專利名稱：抗病毒載體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及新的病毒載體，所述的病毒載體能把抗病毒的抑制性RNA分子傳遞到靶細胞中。
核酶是有酶活性的RNA分子，它催化序列特異的RNA加工。在近幾年的文獻中，廣泛描述了核酶的設計和結構(3,7,31)。其中最強有力的系統(tǒng)是那些傳遞多靶核酶的種類，該多靶核酶能在多個位點裂解靶病毒RNA(5,21)。
近幾年來，許多實驗室開發(fā)了基于HIV的逆轉錄病毒載體系統(tǒng)(2,4,18,19,22-24,27,32,35,39,43)。在抗HIV基因治療方面，相對于基于鼠的更常規(guī)載體如鼠白血病病毒(MLV)載體，這些載體有許多優(yōu)點。首先，HIV載體將精確地靶向那些易受HIV感染的細胞(22,23)。其次，基于HIV的載體能轉導一般難以被鼠載體轉導的細胞諸如巨噬細胞(19,20)。第三，抗HIV基因組能通過任何逃逸治療策略的病毒(HIV)，經CD4+細胞群體增殖(7)。這是因為該載體基因組具有能被病毒顆粒包裝系統(tǒng)識別的包裝信號。這些各種特征使HIV載體在抗HIV基因治療領域成為一個有力的工具。
多靶核酶和基于HIV的載體的組合作為一種治療策略是吸引人的。不過，直到現(xiàn)在這種策略才有可能。載體顆粒的產生，發(fā)生在表達該顆粒的包裝組分并包裝該載體基因組的生產細胞中。因此，設計成摧毀病毒RNA的核酶也將在載體產生過程中，能打斷基于HIV載體系統(tǒng)的組分的表達。本發(fā)明的目的是克服這個問題。
因此，本發(fā)明提供一種病毒載體系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括(ⅰ)一種編碼下列基因產物的第一核苷酸序列，所述的基因產物能結合第二核苷酸序列或其轉錄產物，并直接或間接地影響第二核苷酸序列或其轉錄產物的裂解，所述第二核苷酸序列編碼一種對病毒顆粒的裝配必須的病毒多肽；(ⅱ)一種編碼病毒顆粒裝配所需的所述病毒多肽的第三核苷酸序列，所述的第三核苷酸序列擁有與第二核苷酸序列不同的核苷酸序列，結果所述的第三核苷酸序列或其轉錄產物抵抗由所述的基因產物指導的裂解。
在另一方面，本發(fā)明提供一種病毒載體生產系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括(ⅰ)一種包含至少一條第一核苷酸序列的病毒基因組，所述的第一核苷酸序列編碼一種基因產物，該基因產物能結合第二核苷酸序列或其轉錄產物，并直接或間接影響第二核苷酸序列或其轉錄產物的裂解，所述第二核苷酸序列編碼一種對病毒顆粒的裝配必須的病毒多肽；(ⅱ)一種編碼病毒基因組裝配進病毒顆粒所需的所述病毒多肽的第三核苷酸序列，所述的第三核苷酸序列擁有與第二核苷酸序列不同的核苷酸序列，結果所述的第三核苷酸序列或其轉錄產物抵抗由所述的基因產物指導的裂解。
一般來說，該基因產物是一種選自核酶或反義核酸的RNA抑制性序列，優(yōu)選的是核酶。
優(yōu)選地是，所述的病毒載體是一種逆轉錄病毒載體，更優(yōu)選的是一種慢病毒載體，如HIV載體。一般來說，第二核苷酸序列和第三核苷酸序列來自相同的病毒物種，更優(yōu)選的是來自相同的病毒株。一般來說，該病毒基因組來自相同的病毒物種，更優(yōu)選的是來自相同的病毒株。
在逆轉錄病毒載體的情況下，病毒顆粒裝配所需的多肽選自gag、pol和env蛋白。優(yōu)選地是，至少gag和pol序列是慢病毒的序列，更優(yōu)選的是HIV的序列。此外或另外，env序列是一種慢病毒的序列，更優(yōu)選的是HIV的序列。
在一優(yōu)選的實施方案中，第三核苷酸序列抵抗由基因產物所指導的裂解，該是因為由至少一個基因產物識別的裂解位點和/或針對至少一個基因產物的結合位點被移去的核苷酸序列中，一種或多種保守性改變引起。例如，當基因產物是一種核酶時，所述的第三核苷酸序列適合于抵抗由該核酶引起的裂解。
優(yōu)選地，第三核苷酸序列是優(yōu)化適于在宿主細胞中表達的密碼子。宿主細胞(該術語包括生產細胞和包裝細胞)一般是哺乳動物細胞。
在一特別優(yōu)選的實施方案中，(ⅰ)病毒基因組是一種包含下列核苷酸序列的HIV基因組，所述的核苷酸序列編碼抗HIV的核酶和/或抗HIV的反義序列，對抗在靶HIV中的HIV包裝組分序列(如gag.pol)，以及(ⅱ)用于產生包裝HIV顆粒的病毒系統(tǒng)進一步包含編碼與靶HIV中相同的包裝組分(如gag.pol蛋白)的核苷酸構建體，其中，該核苷酸構建體的序列與靶HIV中發(fā)現(xiàn)的序列不同，所以抗HIV的核酶和/或反義HIV序列，在生產細胞產生HIV顆粒的過程中，不影響gag.pol轉錄體的裂解或降解。
本發(fā)明也提供一種包含根據(jù)本發(fā)明病毒載體的病毒顆粒，和一種或多種由根據(jù)本發(fā)明的第三核苷酸序列編碼的多肽。例如，本發(fā)明提供一種用本發(fā)明的病毒載體生產系統(tǒng)所產生的病毒顆粒。
在另一方面，本發(fā)明提供一種生產病毒顆粒的方法，該方法包括導入到宿主細胞中的下列物質(ⅰ)一種根據(jù)本發(fā)明的病毒基因組載體；(ⅱ)一種或多種根據(jù)本發(fā)明的第三核苷酸序列；和(ⅲ)編碼不是由一種或多種第三核苷酸序列編碼的其他必須的病毒包裝組分的核苷酸序列。
本發(fā)明進一步提供一種用本發(fā)明的方法所產生的病毒顆粒。
本發(fā)明也提供一種藥物組合物，該組合物包括根據(jù)本發(fā)明的病毒顆粒與藥學可接受的載體或稀釋劑合用。
本發(fā)明的病毒系統(tǒng)或本發(fā)明的病毒顆?？梢杂糜谥委煵《靖腥荆绕涫悄孓D錄病毒感染，如包括HIV感染的慢病毒感染。因此，本發(fā)明提供一種治療病毒感染的方法，該方法包括給患病毒感染的人或動物患者，施用有效量的本發(fā)明的病毒系統(tǒng)、病毒顆?；蛩幱媒M合物。
本發(fā)明特別涉及攜帶抗HIV核酶的基于HIV載體。然而，本發(fā)明可應用于任何其他的病毒，尤其是任何其他的慢病毒，用基因治療來對付這些病毒可能是合乎需求的。本發(fā)明在此針對HIV進行說明，但是，不能認為這是把本發(fā)明的范圍限制為基于HIV的抗HIV載體。本發(fā)明詳述術語“病毒載體”指的是一種核苷酸構建體，它包含能在宿主細胞中轉錄的一種病毒基因組，所述的基因組包含足夠的病毒遺傳信息，在包裝組分的存在下允許包裝病毒RNA基因組進入一種能感染靶細胞的病毒顆粒。靶細胞的感染包括逆轉錄并整合到適于具體病毒的靶細胞基因組中。一般來說，所用的病毒載體攜帶異源的編碼序列(目的核苷酸)，該編碼序列能被載體傳遞到靶細胞中，例如編碼核酶的第一核苷酸序列。所述的病毒載體不能進行獨立復制，以在最終的靶細胞中產生感染性病毒顆粒。
可以認為，術語“病毒載體系統(tǒng)”意指一套含有各部分的藥盒，當與病毒顆粒產生所必須的其他組分組合時，用該藥盒可在宿主細胞中產生病毒顆粒。例如，第一核苷酸序列一般可存在于一種質粒載體構建體中，該構建體適合于把第一核苷酸序列克隆到一種病毒基因組載體構建體中。當在藥盒中和第三核苷酸序列(一般也存在于不同的質粒載體構建體中)組合時，含有第一核苷酸序列的質粒和含有第三核苷酸序列的質粒的組合結果包括了本發(fā)明的基本要素。然后，上述藥盒可被技術人員用于產生合適的病毒載體基因組構建體，當和含有第三核苷酸序列的質?；蛘呔幋a其他病毒裝配所需組分的核酸構建體一起轉染到宿主細胞時，該表達載體基因組構建體可導致產生感染性病毒顆粒。
此外，第三核苷酸序列可穩(wěn)定地存在于包裝細胞系中，本藥盒也包括該細胞系。
所述的藥盒可以包括產生病毒顆粒所需的其他組分，如宿主細胞和編碼病毒裝配所需的基本病毒多肽的其他質粒。舉例來說，該藥盒可含有(ⅰ)一種含編碼抗HIV核酶的第一核苷酸序列的質粒以及(ⅱ)一種含編碼修飾的HIV gag.pol構建體的第三核苷酸序列的質粒，所述的HIV gag.pol構建體不能被抗HIV的核酶裂解。然后，選擇性組分是(a)一種具有合適的限制酶識別位點的HIV病毒基因組構建體，通過這些位點把第一核苷酸序列克隆到病毒基因組中；(b)一種編碼VSV-G env蛋白的質粒。另外，編碼病毒顆粒裝配所需的病毒多肽的核苷酸序列也在藥盒中作為含有所述核苷酸序列的包裝細胞系形式提供，例如表達VSV-G的細胞系。
術語“病毒載體產生系統(tǒng)”指的是上面所述的病毒載體系統(tǒng)，其中，第一核苷酸序列已經被插入到合適的病毒載體基因組中。
一般來說，病毒載體是逆轉錄病毒載體，尤其是慢病毒載體如HIV載體。本發(fā)明的逆轉錄病毒載體可衍生于或者來源于任何合適的逆轉錄病毒。大量的不同逆轉錄病毒已經被鑒定出來。這些例子包括鼠白血病病毒(MLV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、猿猴免疫缺陷病毒、人T細胞白血病病毒(HTLV)、馬傳染性貧血病毒(EIAV)、小鼠乳頭瘤病毒(MMTV)、勞氏肉瘤病毒(RSV)、Fujinami肉瘤病毒(FuSV)、莫洛尼鼠白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠骨肉瘤病毒(FBR MSV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、Abelson鼠白血病病毒(A-MLV)、鳥髓細胞瘤病毒-29(MC29)以及鳥成紅細胞瘤病病毒(AEV)。逆轉錄病毒的詳細表可在如下的書中找到，見Coffin等，1997，“逆轉錄病毒”，冷泉港實驗室出版社，編著者JM Coffin,SM Hughes,HEVamus,758-763頁。
某些逆轉錄病毒的基因組結構的細節(jié)可以在本領域找到。舉例來說，有關HIV和Mo-MLV的詳細資料可從NCBI基因庫獲得(基因組入庫號分別為AF033819和AF033811)。
慢病毒組甚至能進一步分為“靈長類”和“非靈長類”二組。靈長類慢病毒的例子包括人免疫缺陷病毒(HIV，它是引起人自身免疫缺陷綜合癥(AIDS)的病原)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。非靈長類慢病毒組包括“慢病毒”原型visna/maedi病毒(VMV)、和相關的羊關節(jié)炎-腦炎病毒(CAEV)、馬傳染性貧血病毒(EIAV)以及最近描述的貓免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)。
逆轉錄病毒基因組的基本結構是一個5′LTR和一個3′LTR(能使基因組包裝的包裝信號位于之間或其中)，一個引物結合位點，能整合到宿主細胞基因組中的整合位點，以及編碼包裝組分的gag、pol和env基因一這些是病毒顆粒裝配所需的多肽。更復雜的逆轉錄病毒有其他的特征，如在HIV中的ren和RRE序列，它們能把整合前病毒的RNA轉錄體有效地從細胞核運輸?shù)奖桓腥景屑毎募毎|中。
在前病毒中，這些基因的兩端側翼是稱為長末端重復(LTRs)的區(qū)域。所述的LTRs負責前病毒的整合和轉錄。LTRs也用作增強子啟動子的序列并能控制病毒基因的表達。逆轉錄病毒RNAs的顆?；ㄟ^位于病毒基因組的5′末端的psi序列開始。
LTRs本身是相同的序列，這些序列可分為三個元件，稱為U3、R和U5。U3來源于RNA 3′端特有的序列。R來源于在RNA二個末端重復的序列而U5來源于RNA的5′末端特有的序列。三個元件的大小在不同的逆轉錄病毒中變化較大。
在一缺陷逆轉錄病毒載體基因組中，gag、pol和env可以缺乏或沒有功能。位于RNA二個末端的所述R區(qū)是重復序列。U5和U3分別代表RNA基因組的5′和3′末端的特有序列。
在一典型的用于基因治療的逆轉錄病毒載體中，可從病毒中移去至少一個或多個復制所需的gag、pol和env蛋白編碼區(qū)的部分。這樣制得復制缺陷的逆轉錄病毒載體。移去的部分甚至可被諸如本發(fā)明的第一核苷酸序列等目的核苷酸序列(NOI)取代，以產生能把其基因組整合到宿主基因組中的病毒，但是，其中修飾過的病毒基因組由于缺乏結構蛋白，其自身不能增殖。當在宿主基因組中整合時，出現(xiàn)NOI的表達-例如，結果表現(xiàn)出治療和/或診斷效應。因此，把NOI轉移到目的位點一般可通過下述方法獲得，該方法把NOI整合到重組病毒載體中；把修飾病毒載體包裝到病毒顆粒外殼上；然后使其轉導到目的位點-如靶細胞或靶細胞群體中。
因此，用于本發(fā)明的最小逆轉錄病毒基因組可包括(5′)R-U5-1個或多個第一核苷酸序列-U3-R(3′)。然而，用于在宿主細胞/包裝細胞中產生逆轉錄病毒基因組的質粒載體，也包括轉錄調節(jié)控制序列，該調節(jié)控制序列操作性地與逆轉錄病毒基因組連接，以指導該基因組在宿主細胞/包裝細胞中轉錄。這些調節(jié)序列可以是和轉錄逆轉錄病毒序列相連的天然序列，即5′U3區(qū)，或者它們是諸如另一種病毒啟動子的異源啟動子，例如CMV啟動子。
某些逆轉錄病毒基因組為了有效地產生病毒，需要另外的序列。例如，在HIV的情況下，優(yōu)選地包括rev和RRE序列。不過，對rev和RRE序列的需求能通過密碼子優(yōu)化而減少或取消。
一旦逆轉錄病毒載體基因組作為前病毒DNA被整合到其靶細胞的基因組中，必然表達核酶序列。在逆轉錄病毒中，啟動子位于前病毒的5′LTR U3區(qū)。在逆轉錄病毒載體中，驅動治療基因表達的啟動子可以是在5′U3區(qū)的天然逆轉錄病毒啟動子，或是被構建到載體中的替代啟動子。該替代啟動子基本上可取代逆轉錄病毒天然的5′U3啟動子，或者，它可被整合到載體基因組之中如LTRs之間的不同位置。
因此，第一核苷酸序列也將操作性地與轉錄調節(jié)控制序列連接，以使第一核苷酸序列的轉錄在靶細胞中出現(xiàn)。該控制序列一般在哺乳動物細胞中具有活性。例如，所述的控制序列可以是一種病毒啟動子，如天然病毒啟動子或CMV啟動子，或者它可以是哺乳動物啟動子。特別優(yōu)選地應用下列的啟動子，該啟動子優(yōu)先地在該病毒最初感染的特殊細胞類型或組織類型中有活性。因此，在一實施方案中，可用組織特異調節(jié)的序列。驅動一個或多個第一核苷酸序列表達的調節(jié)控制序列可以是組成性的或調節(jié)的啟動子。
例如，通過應用包裝或輔助細胞系和重組載體結合的方法，可增殖復制缺陷的逆轉錄病毒載體，以制備用于下一步轉導的逆轉錄病毒載體的合適滴度。那就是說，以反式方式提供三個包裝蛋白。
“包裝細胞系”含有一個或多個逆轉錄病毒的gag、pol和env基因。該包裝細胞系產生用于包裝逆轉錄病毒DNA所需的蛋白，但由于缺乏psi區(qū)，它不能顆?；Ｈ欢?，當攜帶一個NOI和psi區(qū)的重組載體被導入到包裝細胞系中時，所述的輔助蛋白能包裝psi陽性的重組載體，以產生重組病毒貯存物。該病毒貯存物能用于轉導細胞，以把NOI導入到靶細胞的基因組中。應用稱為psi陽性的psi包裝信號是優(yōu)選的，psi陽性含有橫跨從拼接供體的上游至gag起始密碼子下游的附加序列(Bender等(46))，因為已經表明該包裝信號增加病毒的滴度。
基因組缺乏形成病毒蛋白所需的全部基因的重組病毒僅能一次性轉導，卻不能增殖。這些僅能轉導靶細胞一個循環(huán)的病毒載體被稱為復制缺陷載體。所以，所述的NOI導入到宿主/靶細胞基因組中卻不產生潛在的有害逆轉錄病毒。有效的包裝系總結表見Coffin等，1997(同上)的文章中。
優(yōu)選地使用下述的逆轉錄病毒包裝細胞系，在這些細胞系中，gag、pol和env病毒編碼區(qū)在不同的表達質粒中攜帶，這些質粒獨立地被轉染進包裝細胞系中。有時稱為三質粒轉染法(Soneoka等(33))的這種策略，能降低產生有復制活性的病毒的潛力，因為產生野生型病毒需要三個重組事件。由于同源性大大地有利于重組，也用降低或消除載體和輔助體的基因組之間的同源性的方法，以降低產生有復制活性的輔助病毒的問題。
一種穩(wěn)定地轉染包裝細胞系的替代方法是應用瞬時轉染的細胞系。當正在開發(fā)載體時，使用瞬時轉染法測定載體的產生水平具有優(yōu)勢。在這一方面，瞬時轉染法避免了出現(xiàn)穩(wěn)定的產生載體細胞系所需的較長時間，并且也可用于如果載體或逆轉錄病毒包裝組分對細胞有毒性的情況。一般用于產生逆轉錄病毒載體的組分包括編碼gag/pol蛋白的質粒，編碼env蛋白的質粒和含有NOI的質粒。載體的生產涉及一種或多種這些組分瞬時轉染到含有所需其他組分的細胞中。如果所述的載體編碼毒性基因或干擾宿主細胞復制的基因，如細胞周期抑制蛋白或誘導凋亡的基因，出現(xiàn)穩(wěn)定產生載體的細胞系就可能困難，但能用瞬時轉染法，在細胞死亡之前產生載體。另外，應用瞬時轉染法開發(fā)出了許多細胞系，這些細胞產生的載體滴度水平可與從穩(wěn)定產生載體的細胞系的水平相比擬(Pear等(47))。
生產細胞/包裝細胞可以是任何合適的細胞類型。最常用的是哺乳動物生產細胞，但是其他細胞如昆蟲細胞也不排除在外。顯然，生產細胞必須能有效地翻譯gag、pol和env的mRNA。許多合適的生產/包裝細胞系在本領域眾所周知。例如，本領域的技術人員通過把編碼包裝組分的核苷酸構建體穩(wěn)定地導入細胞系中，也能制取合適的包裝細胞系。
正如下面討論的那樣，如果逆轉錄病毒基因組編碼一種能影響gag、pol和/或env RNA轉錄體裂解的抑制性RNA分子，所述的核苷酸序列以整合或質粒攜帶的方式存在于包裝細胞系中，或者存在于瞬時轉染的生產細胞中，編碼gag、pol和/或env蛋白的這些核苷酸序列將被修飾，這樣降低或防止與抑制性RNA分子的結合。用這種方法，抑制性RNA分子不能阻止在包裝細胞系中病毒顆粒包裝所需的組分的表達。
在實驗和實際用途中，使用高滴度的病毒制品是十分合乎要求的。增加病毒滴度的技術包括使用上面討論的psi陽性包裝信號和一定濃度的病毒貯存物。此外，使用不同的包膜蛋白，如來自皰性口炎病毒的G蛋白，可提高滴度，使其濃度達到每毫升109(Cosset等(48))。不過，一般選擇包膜蛋白，這樣病毒顆粒優(yōu)先地感染被需要治療的病毒感染的細胞。例如，如果一種HIV載體被用于治療HIV感染，所用的env蛋白是HIV env蛋白。
按照本發(fā)明所用的合適的第一核苷酸序列編碼下述的基因產物，這些基因產物導致靶核苷酸序列的裂解和/或酶促降解，它們一般是核糖核酸。作為具體的實例，所指的是核酶和反義序列。
核酶是在特異的位點裂解RNA的RNA酶。可以這樣構建核酶，使其特異地針對任何選擇的含有核酶裂解位點的序列。因此，在轉錄病毒序列中選擇識別位點而構建核酶。舉例來說，由第一核苷酸序列編碼的核酶，識別和裂解產生病毒顆粒所需的病毒基因組的必要元件，如包裝組分。所以，對逆轉錄病毒基因組來說，上述必要元件包括gag、pol和env基因產物。一種能識別至少gag、pol和env基因序列之一，或更典型地識別從這些基因轉錄的RNA序列的合適的核酶，能結合和裂解上述序列。作為合適的方法，這將降低或阻止gag、pol或env蛋白的產生，因而降低或阻止逆轉錄病毒顆粒的產生。
核酶以幾種形式存在，包括錘頭、發(fā)夾和肝炎δ型抗基因組核酶。本發(fā)明優(yōu)選地使用錘頭核酶，部分原因是它們的體積相對較小，也因為它們的靶裂解位點的序列要求最小，以及它們的特性已得到全面的描述。在本發(fā)明研究中最常用的核酶是錘頭核酶和發(fā)夾核酶。
每一個單獨的核酶有一個基序，該基序識別在靶RNA中的識別位點并與之結合。該基序采取一個或多個“結合臂”的形式，一般是二個結合臂。在錘頭核酶中的結合臂是側翼序列螺旋Ⅰ和螺旋Ⅲ，它們位于螺旋Ⅱ的側翼。這些序列的長度是可變的，一般每種為6-10個核苷酸，但可以更短或更長。側翼序列的長度能影響裂解率。例如，已經發(fā)現(xiàn)降低側翼序列中的核苷酸總數(shù)，從20降低到12，能增加核酶裂解HIV序列的轉換率，達到10倍(44)。在錘頭核酶中，核酶螺旋Ⅱ的催化基序，在一個稱為裂解位點的位點中裂解靶RNA。核酶是否裂解任何給定的RNA，可通過存在或缺乏針對含合適的裂解位點的核酶的識別位點確定。
每一類型的核酶識別其自身的裂解位點。錘頭核酶裂解位點擁有直接位于上游的核苷酸堿基三聯(lián)體GUX，其中，G是鳥嘌呤，U是尿嘧啶而X是任何的核苷酸堿基。發(fā)夾核酶擁有一個BCUGNYR的裂解位點，其中，B是任何不是腺嘌呤的核苷酸堿基，N是任何核苷酸，Y是胞嘧啶或胸腺嘧啶而R是鳥嘌呤或腺嘌呤。由發(fā)夾核酶引起的裂解發(fā)生在裂解位點的G和N之間。
編碼包裝組分的核酸序列(第三核苷酸序列)可以抵抗所述的核酶或多種核酶，因為它們缺乏針對所述的核酶或多種核酶的任何裂解位點。這將阻止由所述的核酶或多種核酶引起的酶活性，因此不存在針對所述的核酶或多種核酶的有效識別位點。另外或此外，潛在的識別位點可在側翼序列中改變，這些序列構成核酶與之結合的識別位點的一部分。這種改變消除核酶基序與識別位點的結合，或者足以使任何核酶-靶復合物的去穩(wěn)定而降低結合能力，因此降低該核酶的特異性和催化活性。如果僅改變側翼序列，它們優(yōu)選地進行如下改變，結果在該改變的靶序列上的核酶催化活性可以被忽略或有效地消除。
優(yōu)選地是，本發(fā)明使用了幾種抗HIV的核酶系列(5,7,10,13,21,36,38,40)。這些核酶可以是任何的抗HIV的核酶，但是必須包括一種或多種裂解表達gag、pol或env所需的RNA的種類。優(yōu)選地是，利用多個核酶，同時在多個位點能裂解原始逆轉錄病毒的gag、pol或env的RNA。由于HIV以準物種群存在，并不是所有的核酶的靶序列包括在全部的HIV變體中。由該變異性所出現(xiàn)的問題能通過使用多靶核酶解決。多靶核酶包括成系列存在于單一載體中，并且當作為一條單一的RNA序列表達時，能獨立起作用。一種含有二個或多個具有不同靶識別位點的核酶的單一RNA可以稱為多靶核酶。已經表明成系列地設置核酶可增強裂解作用。使用多個核酶并不局限于治療HIV感染，而是可用于有關的其他病毒、逆轉錄病毒或其他病毒。
反義技術在本領域眾所周知。一般認為反義序列通過各種機制抑制基因表達。據(jù)信反義序列起作用的一種機制是細胞蛋白RNAseH被招募到靶序列/反義構建體的異源雙鏈體處，結果引起異源雙鏈體的裂解和降解。因此反義構建體，與核酶的作用相反，據(jù)說能間接地引起靶序列的裂解/降解。因此根據(jù)本發(fā)明，第一核苷酸序列可以編碼一種反義RNA，該反義RNA與一種編碼基本/包裝組分的基因結合或與來自該基因轉錄的RNA結合，結果抑制該基因的表達，例如導致得到的異源雙鏈體的RNAseH降解。對反義構建體來說，沒有必要編碼與下列基因互補的全長序列，所述的基因編碼一種基本/包裝組分-一部分就足以起作用。技術人員可容易地確定如何設計合適的反義構建體。
相反，在宿主細胞/生產細胞/包裝細胞中，編碼病毒顆粒裝配必需的病毒顆粒的基本/包裝組分的核酸序列(第三核苷酸序列)，抵抗由第一核苷酸序列編碼的抑制性RNA分子。例如，在核酶的情況下，該抗性一般利用在序列中取消核酶識別位點的變異而實現(xiàn)。同時，保留針對基本/包裝組分的氨基酸編碼序列，這樣由所述的序列編碼的病毒組分仍然相同，或者至少十分相似，結果基本/包裝組分的功能不被損害。
術語“病毒顆粒裝配必需的病毒多肽”指的是一種一般由病毒基因組編碼的被包裝到病毒顆粒中的多肽，在缺乏該多肽時，病毒基因組就不能包裝。例如，就逆轉錄病毒來說，上述多肽包括gag、pol和env。術語“包裝組分”和“基本組分”也包括在本定義之中。
在反義序列的情況下，第三核苷酸序列與編碼靶病毒包裝組分的反義序列的第二核苷酸序列不同，因為盡管反義序列能與第二核苷酸序列或其轉錄體結合，所述的反義序列不能有效地與第三核苷酸序列或從該序列轉錄的RNA結合。在第二和第三核苷酸序列之間的變化一般是保守性變化，雖然也可以忍受少數(shù)的氨基酸變化，只要基本/包裝組分的功能不被明顯地損害就可。
優(yōu)選地，除了取消核酶識別位點外，針對病毒組分的編碼序列的改變可改善在哺乳動物細胞或其他細胞中的密碼子使用性，其中這些細胞作為產生逆轉錄病毒載體顆粒的生產細胞。在密碼子使用方面的這種改善被稱為“密碼子優(yōu)化”。包括HIV和其他慢病毒的許多病毒使用大量的稀有密碼子，通過把這些密碼子改變成相應的常規(guī)使用的哺乳動物密碼子，能獲得在哺乳動物生產細胞中包裝組分的增加表達。針對哺乳動物細胞以及各種其他生物的密碼子使用表，在本領域眾所周知。
因而優(yōu)選地，編碼包裝組分的序列是密碼子優(yōu)化的。更優(yōu)選地是，該序列作為整體來說是密碼子優(yōu)化的。密碼子優(yōu)化后，可以發(fā)現(xiàn)，在野生型gag、pol和env序列中出現(xiàn)許多位點，它們能用作核酶識別位點并且不再存在于編碼包裝組分的序列中。在一替代但更不實用的策略中，編碼包裝組分的序列能通過靶向保守性改變而改變，只要使它們抵抗選出的能裂解野生型序列的核酶就行。
密碼子優(yōu)化的HIV包裝組分的一個另外優(yōu)點是能增加基因的表達。尤其是，它能使gag，pol的表達不依賴于Rev，這樣在基因組中就不需要包括rev和RRE(11)。因而有可能得到不依賴Rev的載體。結果這種特點能在逆轉錄病毒載體中使用抗rev或RRE因子。
如上所述，用于逆轉錄病毒載體的包裝組分包括gag、pol和env基因的表達產物。按照本發(fā)明，在包裝系統(tǒng)中使用的gag和pol來源于該載體基因組以之為基礎的靶逆轉錄病毒。因此，在RNA轉錄體形式中，gag和pol一般可被存在于載體基因組中的核酶裂解。在包裝系統(tǒng)中使用的env基因來源于不同的病毒，包括諸如MLV的其他逆轉錄病毒和諸如VSV(棒狀病毒)的非逆轉錄病毒，在該情況下，為使其抵抗核酶裂解，不需要任何序列改變。此外，env可來源于與gag和pol相同的逆轉錄病毒，在該情況下，任何針對核酶的識別位點需要通過序列改變而消除。
產生包被蛋白不是逆轉錄病毒的原始包被的逆轉錄病毒載體的過程，被稱為“假型化”(“pseudotyping”)。某些包被蛋白，如MLV包被蛋白和皰性口炎病毒G(VSV-G)蛋白，非常有效地使逆轉錄病毒假型化。假型化能用于改變逆轉錄病毒的靶細胞范圍。此外，為了維持需要治療的被特異病毒感染的靶細胞的靶細胞特異性，該包被蛋白可與諸如HIV等靶病毒的包被蛋白相同。
其他治療性編碼序列可和第一核苷酸序列或各類序列一起存在。其他治療性編碼序列包括，但不局限于，編碼下列分子的序列，這些分子是細胞因子、激素、抗體、免疫球蛋白融合蛋白、酶、免疫共刺激分子、反義RNA、靶蛋白的反式顯性陰性突變體、毒素、條件性毒素、抗原、單鏈抗體、腫瘤抑制蛋白和生長因子。當包括上述分子時，上述編碼序列操作性與一合適的啟動子連接，該啟動子可以是驅動第一核苷酸序列表達的啟動子，或不同的啟動子或各類啟動子。
因此本發(fā)明包含兩種組分。第一種組分是一種基因組構建體，該構建體被病毒包裝組分包裝并攜帶一系列抗病毒的抑制性RNA分子，如抗HIV的核酶(5,7,10,13,21,36,38,40)。這些分子可以是任何抗HIV的核酶，但是，本發(fā)明的關鍵問題是某些分子裂解表達天然或野生型HIV gag、pol或env編碼序列所需的RNA。第二種組分是下述的包裝系統(tǒng)，該包裝系統(tǒng)含有一種表達HIV gag、pol的表達盒，和一種表達HIV env的表達盒或一種編碼假型化包被蛋白的包被基因一該包裝系統(tǒng)能抵抗抑制性RNA分子。
因此，本發(fā)明的病毒顆粒和病毒載體系統(tǒng)以及所用的產生載體的方法，可用于治療或預防病毒感染，優(yōu)選地治療或預防逆轉錄病毒感染，尤其是慢病毒(具體來說HIV)的感染。具體而言，本發(fā)明的病毒顆粒，一般用本發(fā)明的病毒載體系統(tǒng)產生，能用于把抑制性RNA分子傳遞到需要針對病毒感染治療的人和動物中。
另外或此外，可用病毒產生系統(tǒng)轉染離體從病人獲得的細胞，然后回輸?shù)皆摬∪梭w內。離體轉染的病人細胞，在重新給病人施用之前，可制成一種藥用組合物(見下面的描述)。
優(yōu)選地是，所述的病毒顆?？膳c藥用上可接受的載體或稀釋劑結合使用，以產生藥用組合物。由此，本發(fā)明也提供一種用于治療個體的藥用組合物，其中，該組合物包含治療有效量的本發(fā)明的病毒顆粒，與藥用上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑或佐劑一起施用。該藥用組合物可用于人類或動物。
藥用的載體、賦形劑或稀釋劑可根據(jù)施用的預定途徑和標準的藥學實踐選擇。合適的載體和稀釋劑包括等滲的鹽溶液，例如磷酸鹽緩沖液。該藥用組合物可包括-除了載體、賦形劑或稀釋劑之外的任何合適的結合劑、潤滑劑、懸浮劑、包被劑、溶劑和其他載體藥劑，這些藥劑可輔助或增加靶位點的病毒進入(例如脂類傳遞系統(tǒng))。
該藥用組合物可制成制劑，適于胃腸道外、肌肉內、靜脈內、顱內、皮下、眼內或透皮施用。
當條件合適時，該藥學組合物可通過下列任何一種或多種制劑方式施用吸入劑，以栓劑或陰道栓劑的形式，用洗劑、液體劑、乳劑、藥膏或粉末劑形式，通過皮膚墊在體表施用；口服施用可以是含諸如淀粉或乳糖的賦形劑的片劑形式，或單獨或與賦形劑形成混合劑的膠囊或卵狀囊形式，或者含有香味劑或增色劑的酏劑、液體劑或懸浮劑的形式；或它們在腸胃外，例如體腔內、靜脈內、肌肉內或皮下注射使用。用于腸胃外施用時，該組合物最好以含有其他物質的無菌水溶液形式使用，例如含有足夠的鹽類或單糖以制成與血液等滲的溶液。用于口腔或舌下施用時，該組合物可以用常規(guī)的方法制成片劑或錠劑的形式施用。
所施用的病毒數(shù)量一般是103-1010pfu的范圍，優(yōu)選地為105-108pfu，更優(yōu)選地為106-107pfu。當使用注射方法時，一般施用1-10μl在藥用上可接受的合適載體或稀釋劑中的病毒。
當多核苷酸/載體作為裸核酸施用時，施用的核酸的數(shù)量一般為1μg-10mg的范圍，優(yōu)選地為100μg-1mg。
如果第一核苷酸序列(或其他治療用的序列)在可誘導的調節(jié)序列控制之下時，僅有必要在治療期間誘導基因表達。一旦所述的病情被治愈，就可移去誘導劑而停止NOI的表達。這種方法顯然具有臨床優(yōu)勢。例如，上述體系可包含施用抗生素四環(huán)素，以通過其對tet阻遏物/VP16融合蛋白的影響而活化基因表達。
現(xiàn)在本發(fā)明進一步用實施例的方式描述，這些實施例的本意是用于幫助本領域的技術人員實施本發(fā)明，而無論如何也不能認為是限制本發(fā)明的范圍。實施例可參考附圖。在附圖中

圖1概括性顯示插入到4個不同HIV載體中的核酶；圖2概括性顯示如何用PCR制造一個合適的3′LTR。
圖3顯示用于HXB2株的野生型HIV gag,pol的密碼子使用表(保藏號K03455)。
圖4顯示命名為gag,pol-SYNgp的密碼子優(yōu)化序列的密碼子使用表。
圖5顯示稱為env-mn的野生型HIV env的密碼子使用表。
圖6顯示命名為SYNgp160mn的HIV env密碼子優(yōu)化序列的密碼子使用表。
圖7顯示用于本發(fā)明的3個質粒構建體。
圖8顯示用于產生逆轉錄病毒載體顆粒的2個系統(tǒng)的原理。
現(xiàn)在本發(fā)明進一步用下列實施例描述，這些實施例僅用作闡述本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明的范圍。
在gag.pol中的保守序列參照HIV序列數(shù)據(jù)庫鑒定，并用于設計核酶，所述的數(shù)據(jù)庫位于Los Alamos國家實驗室(http//hiv-web.lanl.gov/)。由于HIV-1亞型之間的變異性，所設計的核酶裂解屬于B亞型的北美洲、拉丁美洲和加勒比、歐洲、日本和澳大利亞的主要亞型。所選擇的位點相互參考合成的gagpol序列，以保證較低可能切割密碼子優(yōu)化的gagpol mRNA。設計核酶分別在5′和3′末端具有XhoⅠ和SalⅠ位點。這種設計可構建分隔并串聯(lián)的核酶。
該核酶是下列普通結構的錘頭結構(25)螺旋Ⅰ 螺旋Ⅱ 螺旋Ⅲ5′-NNNNNNNN～CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA～NNNNNNNN～
在不降低催化轉換率的前提下，該核酶的催化結構域(螺旋Ⅱ)能忍受一些變化。
具有基本GUX(其中X是任何的核苷酸堿基)三聯(lián)體，靶向gag和pol的裂解位點見如下GAG 1 5′UAGUAAGAAUGUAUAGCCCUACGAG 2 5′AACCCAGAUUGUAAGACUAUUUGAG 3 5′UGUUUCAAUUGUGGCAAAGAAGGAG 4 5′AAAAAGGGCUGUUGGAAAUGUGPOL 1 5′ACGACCCCUCGUCACAAUAAAGPOL 2 5′GGAAUUGGAGGUUUUAUCAAAGPOL 3 5′AUAUUUUUCAGUUCCCUUAGAUPOL 4 5′UGGAUGAUUUGUAUGUAGGAUCPOL 5 5′CUUUGGAUGGGUUAUGAACUCCPOL 6 5′CAGCUGGACUGUCAAUGACAUAPOL 7 5′AACUUUCUAUGUAGAUGGGGCAPOL 8 5′AAGGCCGCCUGUUGGUGGGCAGPOL 9 5′UAAGACAGCAGUACAAAUGGCA所述的核酶被插入到4個不同的HIV載體中(pH4(10)、pH6、pH4.1或pH6.1)(圖1)。在pH4和pH6中，核酶的轉錄通過一個內部HCMV啟動子驅動(9)。根據(jù)pH4.1和pH6.1，該核酶從5′LTR表達。在pH4和pH6(pH4.1和pH6.1)之間的主要差異在于生產質粒中的3′LTR。pH4和pH4.1在3′LTR中擁有HIV U3。pH6或pH6.1在3′LTR中擁有HCMV。HCMV啟動子取代了大部分的U3，以高組成水平地驅動表達，而HIV-1 U3僅在Tat的存在下支持高水平表達。
用3個PCR引物通過重組PCR產生HCMV/HIV-1雜交體3′LTR(圖2)。用RIB1和RIB2引物以及pH4(12)作為模板，進行第一輪PCR，以擴增HIV-1 HXB2序列8900-9123。經第二輪PCR從pH4擴增雜交體5′LTR，制得HIV-1 U3的5′末端和HCMV啟動子之間的連接序列。來自第一輪PCR反應的PCR產物和RIB3，分別用作5′引物和3′引物。RIB15′-CAGCTGCTCGAGCAGCTGAAGCTTGCATGC-3′RIB25′-GTAAGTTATGTAACGGACGATATCTTGTCTTCTT-3′RIB35′-CGCATAGTCGACGGGCCCGCCACTGCTAGAGATTTTC-3′然后用SphⅠ和SalⅠ切下該PCR產物，并插入到pH4中，因而取代了3′LTR。所得到的質粒命名為pH6。為了構建pH4.1和pH6.1，在pH4和pH6中的內部HCMV啟動子(SpeⅠ-XhoⅠ)，用pBluescriptⅡKS+(Stratagene)的多克隆位點取代(SpeⅠ-XhoⅠ)。
所述的核酶被插入到基因組載體骨架的XhoⅠ位點上。以任何構象出現(xiàn)的任何核酶，用相似的方式使用。實施例2-包裝體系的構建包裝系統(tǒng)能制成各種形式。在第一形式的包裝系統(tǒng)中，HIV gag、pol的組分與HIV env編碼序列共表達。在該情況下，改變了gag、pol和env的編碼序列，結果它們抵抗構建到基因組中的抗HIV的核酶。在改變密碼子的使用性而獲得抵抗性的同時，可選擇密碼子與最高水平表達的哺乳動物基因的密碼子使用類型相匹配。這極大地增加表達水平(28，29)，因而增加了滴度。一種密碼子優(yōu)化的HIV env編碼序列已被Haas等(9)描述。在本實施例中，使用一種修飾的密碼子優(yōu)化的HIV env序列(SEQ I.D.No.3)。相應的env表達質粒被命名為pSYNgp160mn。該修飾序列含有未被Haas等使用的外加基序。該外加序列取自MN株的HIV env序列，并進行了密碼子優(yōu)化。只要使用的密碼子與冗余tRNAs相應(42)，任何相似修飾的核酸序列會起相似的作用，并且引起對基因組中的核酶的抗性。
在一個使用優(yōu)化密碼子的gag、pol的編碼序列的實施例中，合成了重疊的寡核苷酸，然后連接在一起而產生合成的編碼序列。野生型的序列(基因庫編號K03455)和合成的(gagpol-SYNgp)gagpol序列分別在SEQ I.D.Nos1和2中顯示，而它們的密碼子使用性分別在圖3和圖4顯示。野生型env編碼序列的序列(基因庫編號M17449)在SEQ I.D.No 3中給出，合成的密碼子優(yōu)化序列的序列在SEQ I.D.No 4中給出，而它們的密碼子使用表分別在圖5和圖6給出。與env編碼序列一樣，可使用任何獲得對各種核酶有抗性的gag、pol序列。所顯示的合成序列被命名為gag,pol-SYNgp，在其5′末端有一個EcoRⅠ位點和在3′末端有一個NotⅠ位點。它被插入到pClneo(Promega)中而產生質粒pSYNgp。
在第二形式的包裝系統(tǒng)中，一種合成的gag，pol表達盒與一種非HIV的包被編碼序列共表達，該非HIV的包被編碼序列產生一種假型化HIV的表面蛋白。例如，該蛋白可以是VSV-G(20,41)，雙向MLV env(6,34)或任何能摻入HIV顆粒中的其他蛋白(37)。這也包括能把載體靶向到特異組織的分子。非HIV包被蛋白的編碼序列不被各種核酶裂解，因此不需要序列修飾(雖然由于其他的原因，例如在哺乳動物細胞中密碼子使用性的優(yōu)化，某些序列的修飾是合乎需要的)。
在以上說明中提到的全部出版物，在此引入僅供參考。在不偏離本發(fā)明的范圍和精神的前提下，本發(fā)明描述的方法和系統(tǒng)的各種修飾和修改方法，對本領域的技術人員來說是顯而易見的。盡管結合具體優(yōu)選實施方案的形式描述了本發(fā)明，但應該明白，要求保護的本發(fā)明僅限制為上述的具體實施方案是不恰當?shù)摹Ｊ聦嵣?，應該認為對分子生物學或相關領域的技術人員來說明顯的，用于執(zhí)行本發(fā)明的上述模式的各種修改方法，屬于下列權利要求的范圍之中。
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說明書的序列表部分SEQ.ID.NO.1-HXB2株的野生型gagpol序列(登記號K03455)ATGGGTGCGA GAGCGTCAGT ATTAAGCGGG GGAGAATTAG ATCGATGGGA AAAAATTCGG 60TTAAGGCCAG GGGGAAAGAA AAAATATAAA TTAAAACATA TAGTATGGGC AAGCAGGGAG 120CTAGAACGAT TCGCAGTTAA TCCTGGCCTG TTAGAAACAT CAGAAGGCTG TAGACAAATA 180CTGGGACAGC TACAACCATC CCTTCAGACA GGATCAGAAG AACTTAGATC ATTATATAAT 240ACAGTAGCAA CCCTCTATTG TGTGCATCAA AGGATAGAGA TAAAAGACAC CAAGGAAGCT 300TTAGACAAGA TAGAGGAAGA GCAAAACAAA AGTAAGAAAA AAGCACAGCA AGCAGCAGCT 360GACACAGGAC ACAGCAATCA GGTCAGCCAA AATTACCCTA TAGTGCAGAA CATCCAGGGG 420CAAATGGTAC ATCAGGCCAT ATCACCTAGA ACTTTAAATG CATGGGTAAA AGTAGTAGAA 480GAGAAGGCTT TCAGCCCAGA AGTGATACCC ATGTTTTCAG CATTATCAGA AGGAGCCACC 540CCACAAGATT TAAACACCAT GCTAAACACA GTGGGGGGAC ATCAAGCAGC CATGCAAATG 600TTAAAAGAGA CCATCAATGA GGAAGCTGCA GAATGGGATA GAGTGCATCC AGTGCATGCA 660GGGCCTATTG CACCAGGCCA GATGAGAGAA CCAAGGGGAA GTGACATAGC AGGAACTACT 720AGTACCCTTC AGGAACAAAT AGGATGGATG ACAAATAATC CACCTATCCC AGTAGGAGAA 780ATTTATAAAA GATGGATAAT CCTGGGATTA AATAAAATAG TAAGAATGTA 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ACCAACAACC CACCCATCCC GGTGGGAGAA 780ATCTACAAAC GCTGGATCAT CCTGGGCCTG AACAAGATCG TGCGCATGTA TAGCCCTACC 840AGCATCCTGG ACATCCGCCA AGGCCCGAAG GAACCCTTTC GCGACTACGT GGACCGGTTC 900TACAAAACGC TCCGCGCCGA GCAGGCTAGC CAGGAGGTGA AGAACTGGAT GACCGAAACC 960CTGCTGGTCC AGAACGCGAA CCCGGACTGC AAGACGATCC TGAAGGCCCT GGGCCCAGCG 1020GCTACCCTAG AGGAAATGAT GACCGCCTGT CAGGGAGTGG GCGGACCCGG CCACAAGGCA 1080CGCGTCCTGG CTGAGGCCAT GAGCCAGGTG ACCAACTCCG CTACCATCAT GATGCAGCGC 1140GGCAACTTTC GGAACCAACG CAAGATCGTC AAGTGCTTCA ACTGTGGCAA AGAAGGGCAC 1200ACAGCCCGCA ACTGCAGGGC CCCTAGGAAA AAGGGCTGCT GGAAATGCGG CAAGGAAGGC 1260CACCAGATGA AAGACTGTAC TGAGAGACAG GCTAATTTTT TAGGGAAGAT CTGGCCTTCC 1320TACAAGGGAA GGCCAGGGAA TTTTCTTCAG AGCAGACCAG AGCCAACAGC CCCACCAGAA 1380GAGAGCTTCA GGTCTGGGGT AGAGACAACA ACTCCCCCTC AGAAGCAGGA GCCGATAGAC 1440AAGGAACTGT ATCCTTTAAC TTCCCTCAGA TCACTCTTTG GCAACGACCC CTCGTCACAA 1500TAAAGATAGG GGGGCAGCTC AAGGAGGCTC TCCTGGACAC CGGAGCAGAC GACACCGTGC 1560TGGAGGAGAT GTCGTTGCCA GGCCGCTGGA AGCCGAAGAT GATCGGGGGA ATCGGCGGTT 1620TCATCAAGGT GCGCCAGTAT GACCAGATCC TCATCGAAAT CTGCGGCCAC AAGGCTATCG 1680GTACCGTGCT GGTGGGCCCC ACACCCGTCA ACATCATCGG ACGCAACCTG TTGACGCAGA 1740TCGGTTGCAC GCTGAACTTC CCCATTAGCC CTATCGAGAC GGTACCGGTG AAGCTGAAGC 1800CCGGGATGGA CGGCCCGAAG GTCAAGCAAT GGCCATTGAC AGAGGAGAAG ATCAAGGCAC 1860TGGTGGAGAT TTGCACAGAG ATGGAAAAGG AAGGGAAAAT CTCCAAGATT GGGCCTGAGA 1920ACCCGTACAA CACGCCGGTG TTCGCAATCA AGAAGAAGGA CTCGACGAAA TGGCGCAAGC 1980TGGTGGACTT CCGCGAGCTG AACAAGCGCA CGCAAGACTT CTGGGAGGTT CAGCTGGGCA 2040TCCCGCACCC CGCAGGGCTG AAGAAGAAGA AATCCGTGAC CGTACTGGAT GTGGGTGATG 2100CCTACTTCTC CGTTCCCCTG GACGAAGACT TCAGGAAGTA CACTGCCTTC ACAATCCCTT 2160CGATCAACAA CGAGACACCG GGGATTCGAT ATCAGTACAA CGTGCTGCCC CAGGGCTGGA 2220AAGGCTCTCC CGCAATCTTC CAGAGTAGCA TGACCAAAAT CCTGGAGCCT TTCCGCAAAC 2280AGAACCCCGA CATCGTCATC TATCAGTACA TGGATGACTT GTACGTGGGC TCTGATCTAG 2340AGATAGGGCA GCACCGCACC AAGATCGAGG AGCTGCGCCA GCACCTGTTG AGGTGGGGAC 2400TGACCACACC CGACAAGAAG CACCAGAAGG AGCCTCCCTT CCTCTGGATG GGTTACGAGC 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CTCCTCTGGA AGGGTGAGGG GGCAGTAGTG ATCCAGGATA 4200ATAGCGACAT CAAGGTGGTG CCCAGAAGAA AGGCGAAGAT CATTAGGGAT TATGGCAAAC 4260AGATGGCGGG TGATGATTGC GTGGCGAGCA GACAGGATGA GGATTAG 4307SEQ.ID.NO.3-來自HIV-1 MN的包被基因(基因庫登記號M17449)ATGAGAGTGA AGGGGATCAG GAGGAATTAT CAGCACTGGT GGGGATGGGG CACGATGCTC 60CTTGGGTTAT TAATGATCTG TAGTGCTACA GAAAAATTGT GGGTCACAGT CTATTATGGG 120GTACCTGTGT GGAAAGAAGC AACCACCACT CTATTTTGTG CATCAGATGC TAAAGCATAT 180GATACAGAGG TACATAATGT TTGGGCCACA CAAGCCTGTG TACCCACAGA CCCCAACCCA 240CAAGAAGTAG AATTGGTAAA TGTGACAGAA AATTTTAACA TGTGGAAAAA TAACATGGTA 300GAACAGATGC ATGAGGATAT AATCAGTTTA TGGGATCAAA GCCTAAAGCC ATGTGTAAAA 360TTAACCCCAC TCTGTGTTAC TTTAAATTGC ACTGATTTGA GGAATACTAC TAATACCAAT 420AATAGTACTG CTAATAACAA TAGTAATAGC GAGGGAACAA TAAAGGGAGG AGAAATGAAA 480AACTGCTCTT TCAATATCAC CACAAGCATA AGAGATAAGA TGCAGAAAGA ATATGCACTT 540CTTTATAAAC TTGATATAGT ATCAATAGAT AATGATAGTA CCAGCTATAG GTTGATAAGT 600TGTAATACCT CAGTCATTAC ACAAGCTTGT CCAAAGATAT CCTTTGAGCC AATTCCCATA 660CACTATTGTG CCCCGGCTGG TTTTGCGATT CTAAAATGTA ACGATAAAAA GTTCAGTGGA 720AAAGGATCAT GTAAAAATGT CAGCACAGTA CAATGTACAC ATGGAATTAG GCCAGTAGTA 780TCAACTCAAC TGCTGTTAAA TGGCAGTCTA GCAGAAGAAG AGGTAGTAAT TAGATCTGAG 840AATTTCACTG ATAATGCTAA AACCATCATA GTACATCTGA ATGAATCTGT ACAAATTAAT 900TGTACAAGAC CCAACTACAA TAAAAGAAAA AGGATACATA TAGGACCAGG GAGAGCATTT 960TATACAACAA AAAATATAAT AGGAACTATA AGACAAGCAC ATTGTAACAT TAGTAGAGCA 1020AAATGGAATG ACACTTTAAG ACAGATAGTT AGCAAATTAA AAGAACAATT TAAGAATAAA 1080ACAATAGTCT TTAATCAATC CTCAGGAGGG GACCCAGAAA TTGTAATGCA CAGTTTTAAT 1140TGTGGAGGGG AATTTTTCTA CTGTAATACA TCACCACTGT TTAATAGTAC TTGGAATGGT 1200AATAATACTT GGAATAATAC TACAGGGTCA AATAACAATA TCACACTTCA ATGCAAAATA 1260AAACAAATTA TAAACATGTG GCAGGAAGTA GGAAAAGCAA TGTATGCCCC TCCCATTGAA 1320GGACAAATTA GATGTTCATC AAATATTACA GGGCTACTAT TAACAAGAGA TGGTGGTAAG 1380GACACGGACA CGAACGACAC CGAGATCTTC AGACCTGGAG GAGGAGATAT GAGGGACAAT 1440TGGAGAAGTG AATTATATAA ATATAAAGTA GTAACAATTG AACCATTAGG AGTAGCACCC 1500ACCAAGGCAA AGAGAAGAGT GGTGCAGAGA GAAAAAAGAG CAGCGATAGG AGCTCTGTTC 1560CTTGGGTTCT TAGGAGCAGC AGGAAGCACT ATGGGCGCAG CGTCAGTGAC GCTGACGGTA 1620CAGGCCAGAC TATTATTGTC TGGTATAGTG CAACAGCAGA ACAATTTGCT GAGGGCCATT 1680GAGGCGCAAC AGCATATGTT GCAACTCACA GTCTGGGGCA TCAAGCAGCT CCAGGCAAGA 1740GTCCTGGCTG TGGAAAGATA CCTAAAGGAT CAACAGCTCC TGGGGTTTTG GGGTTGCTCT 1800GGAAAACTCA TTTGCACCAC TACTGTGCCT TGGAATGCTA GTTGGAGTAA TAAATCTCTG 1860GATGATATTT GGAATAACAT GACCTGGATG CAGTGGGAAA GAGAAATTGA CAATTACACA 1920AGCTTAATAT ACTCATTACT AGAAAAATCG CAAACCCAAC AAGAAAAGAA TGAACAAGAA 1980TTATTGGAAT TGGATAAATG GGCAAGTTTG TGGAATTGGT TTGACATAAC AAATTGGCTG 2040TGGTATATAA AAATATTCAT AATGATAGTA GGAGGCTTGG TAGGTTTAAG AATAGTTTTT 2100GCTGTACTTT CTATAGTGAA TAGAGTTAGG CAGGGATACT CACCAITGTC GTTGCAGACC 2160CGCCCCGCAG TTCCGAGGGG ACCCGACAGG CCCGAAGGAA TCGAAGAAGA AGGTGGAGAG 2220AGAGACAGAG ACACATCCGG TCGATTAGTG CATGGATTCT TAGCAATTAT CTGGGTCGAC 2280CTGCGGAGCC TGTTCCTCTT CAGCTACCAC CACAGAGACT TACTCTTGAT TGCAGCGAGG 2340ATTGTGGAAC TTCTGGGACG CAGGGGGTGG GAAGTCCTCA AATATTGGTG 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CCGCGGCTGG GAGGTGCTGA AGTACTGGTG GAACCTCCTC 2400CAGTATTGGA GCCAGGAGCT GAAGTCCAGC GCCGTGAGCC TGCTGAACGC CACCGCCATC 2460GCCGTGGCCG AGGGCACCGA CCGCGTGATC GAGGTGCTCC AGAGGGCCGG GAGGGCGATC 2520CTGCACATCC CCACCCGCAT CCGCCAGGGG CTCGAGAGGG CGCTGCTGTA A 257權利要求
1．一種病毒載體系統(tǒng)，包括(ⅰ)一種編碼下列基因產物的第一核苷酸序列，所述的基因產物能結合第二核苷酸序列或其轉錄產物，并直接或間接地影響第二核苷酸序列或其轉錄產物的裂解，所述第二核苷酸序列編碼一種對病毒顆粒的裝配必須的病毒多肽；(ⅱ)一種編碼病毒顆粒裝配所需的所述病毒多肽的第三核苷酸序列，所述的第三核苷酸序列擁有與第二核苷酸序列不同的核苷酸序列，使得所述的第三核苷酸序列或其轉錄產物抵抗由所述的基因產物指導的裂解。
2．一種病毒載體生產系統(tǒng)，包括(ⅰ)一種包含至少一條第一核苷酸序列的病毒基因組，所述的第一核苷酸序列編碼一種基因產物，該基因產物能結合第二核苷酸序列或其轉錄產物，并直接或間接地影響第二核苷酸序列或其轉錄產物的裂解，所述的第二核苷酸序列編碼一種對病毒顆粒的裝配必須的病毒多肽；(ⅱ)一種編碼病毒基因組裝配成病毒顆粒所需的所述病毒多肽的第三核苷酸序列，所述的第三核苷酸序列擁有與第二核苷酸序列不同的核苷酸序列，使得所述的第三核苷酸序列或其轉錄產物抵抗由所述的基因產物指導的裂解。
3．一種根據(jù)權利要求1或2的系統(tǒng)，其中該基因產物選自核酶或反義核糖核酸。
4．一種根據(jù)權利要求1-3之任一項的系統(tǒng)，其中該病毒載體是一種逆轉錄病毒載體。
5．一種根據(jù)權利要求4的系統(tǒng)，其中該逆轉錄病毒載體是一種慢病毒載體。
6．一種根據(jù)權利要求5的系統(tǒng)，其中該慢病毒載體是一種HIV載體。
7．一種根據(jù)權利要求4-6之任一項的系統(tǒng)，其中病毒顆粒裝配所需的該多肽選自gag、pol和env蛋白。
8．一種根據(jù)權利要求7的系統(tǒng)，其中至少gag和pol蛋白來自一種慢病毒。
9．一種根據(jù)權利要求7的系統(tǒng)，其中env蛋白來自一種慢病毒。
10．一種根據(jù)權利要求8或9的系統(tǒng)，其中該慢病毒是HIV。
11．一種根據(jù)前述權利要求之任一項的系統(tǒng)，其中該第三核苷酸序列，由于在核苷酸序列中，由至少一個基因產物識別的裂解位點和/或針對至少一個基因產物的結合位點被移去而產生的一種或多種保守性改變導致對所述的基團產物所指導的裂解具有抗性。
12．一種根據(jù)權利要求1-10之任一項的系統(tǒng)，其中該第三核苷酸序列適應于抵抗由所述的至少一種基因產物所指導的裂解。
13．一種根據(jù)前述權利要求之任一項的系統(tǒng)，其中該第三核苷酸序列已被密碼子優(yōu)化，適于在生產細胞中表達。
14．一種根據(jù)權利要求13的系統(tǒng)，其中該生產細胞是哺乳動物細胞。
15．一種根據(jù)前述權利要求之任一項的系統(tǒng)，其中該系統(tǒng)包括多個由本文所定義的第一核苷酸序列和第三核苷酸序列。
16．一種病毒顆粒，該病毒顆粒含有一種根據(jù)權利要求2-15之任一項所定義的病毒載體基因組和一種或多種根據(jù)權利要求2-15之任一項所定義的第三核苷酸序列。
17．一種病毒顆粒，該病毒顆粒用一種根據(jù)權利要求2-15之任一項的病毒載體生產系統(tǒng)產生。
18．一種產生病毒顆粒的方法，該方法包括導入到宿主細胞中的下列物質(ⅰ)一種根據(jù)權利要求2-15之任一項所定義的病毒基因組；(ⅱ)一種或多種根據(jù)權利要求2-1 5之任一項所定義的第三核苷酸序列；(ⅲ)不是由一種或多種第三核苷酸序列編碼但編碼其他必須的病毒包裝組分的核苷酸序列。
19．一種用權利要求18的方法產生的病毒顆粒。
20．一種藥物組合物，該組合物包括一種根據(jù)權利要求16，17或19的病毒顆粒，與藥學上可接受的載體或稀釋劑。
21．一種根據(jù)權利要求1-16之任一項的病毒系統(tǒng)，或一種根據(jù)權利要求16，17或19的病毒顆粒用于治療病毒感染。
22．一種根據(jù)權利要求1-16之任一項的病毒系統(tǒng)，用于產生病毒顆粒的方法中。
全文摘要
提供一種病毒載體生產系統(tǒng),該系統(tǒng)包含:(i)一種包含至少一條第一核苷酸序列的病毒基因組,所述的第一核苷酸序列編碼一種基因產物,該基因產物能結合第二核苷酸序列或其轉錄產物,并直接或間接地影響第二核苷酸序列或其轉錄產物的裂解,所述第二核苷酸序列編碼一種對病毒顆粒裝配必須的病毒多肽;(ii)一種編碼病毒基因組裝配成病毒顆粒所需的所述病毒多肽的第三核苷酸序列,所述的第三核苷酸序列擁有與第二核苷酸序列不同的核苷酸序列,結果所述的第三核苷酸序列或其轉錄產物抵抗由所述的基因產物指導的裂解?？梢杂迷摬《据d體生產系統(tǒng)生產用于治療或預防病毒感染的病毒顆粒。
文檔編號C12N15/63GK1297486SQ9980512
公開日2001年5月30日 申請日期1999年2月17日 優(yōu)先權日1998年2月17日
發(fā)明者A·J·金斯曼, K·米特羅法諾斯, N·金 申請人:牛津生物醫(yī)學(英國)有限公司