專利名稱：溶血鞘脂的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種溶血鞘脂(lysosphingolipids)的生產(chǎn)方法。更具體說，本發(fā)明涉及生產(chǎn)溶血鞘脂的在工業(yè)上有用的方法，所說的溶血鞘脂適合用于化妝品、藥物、鞘脂化(sphingo)技術(shù)、細(xì)胞技術(shù)等等，本發(fā)明還涉及通過所說生產(chǎn)方法獲得的溶血鞘脂。
近來，據(jù)證實(shí)鞘脂廣泛分布在生物體內(nèi)(包括低等動(dòng)物和高等動(dòng)物)并且起重要的生物活性作用，例如生長、誘導(dǎo)分化和細(xì)胞中的編程性細(xì)胞死亡。此外，作為細(xì)胞膜組成之一的鞘脂已被用作化妝品或藥物的添加劑。
缺少通過酰胺鍵與神經(jīng)鞘脂類中類鞘脂的氨基相連接的脂肪酸的鞘脂的N-脫?；问?溶血形式)稱為溶血鞘脂。據(jù)證實(shí)溶血鞘脂與鞘脂相比具有相似的和不同的生物活性。
由于溶血鞘脂在鞘氨醇中含有游離的氨基，因而其可通過再?；饔糜米骱铣扇苎手苌?鞘脂衍生物或鞘脂類似物)的起始原料。例如，可以合成含有同種脂肪酸組成的鞘脂、具有不同的脂肪酸鏈長度的鞘脂、或含有官能性脂肪酸(如二十二碳六烯酸)的新鞘脂?；蛘?，可以獲得用發(fā)色團(tuán)、放射性同位素等標(biāo)記的鞘脂。此外，可以通過利用溶血鞘脂中的游離氨基來實(shí)現(xiàn)固定化到載體上。
溶血鞘脂的常規(guī)生產(chǎn)方法包括化學(xué)方法、使用酶的方法和使用微生物的方法。
在醇溶劑中的肼解方法和堿性水解方法是已知的由鞘糖脂獲得溶血鞘脂的化學(xué)方法。然而，當(dāng)使用例如含有唾液酸的糖鞘脂(神經(jīng)節(jié)苷脂)時(shí)，在此方法中唾液酸部分的脫酰基反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行。此外，當(dāng)使用含有氨基糖的鞘糖脂時(shí)N-乙?；怀?，導(dǎo)致形成脫-N-乙?；娜苎侵Ｊ姑擋；娜苎乔手哂信c天然存在的物質(zhì)相同的糖鏈需要非常復(fù)雜的工藝。在一個(gè)示例性的方法中，將保護(hù)基團(tuán)選擇性地引入脂類部分的氨基上，將唾液酸部分再酰化，然后脫去保護(hù)基團(tuán)。在另一個(gè)示例性的方法中，在摻入脂質(zhì)體后將糖部分選擇性再?；?。此外，在這些方法中產(chǎn)生了很多副產(chǎn)物。如上所述，通過化學(xué)方法生產(chǎn)溶血鞘脂需要大量的勞動(dòng)和專業(yè)技術(shù)。
溶血形式的鞘磷脂之一(鞘磷脂)的化學(xué)生產(chǎn)通常使用在醇溶劑中使用鹽酸水解的方法。然而，使用這種方法會(huì)產(chǎn)生各種副產(chǎn)物。例如，除天然存在的D-赤型(2S,3R)外還形成L-蘇型(2S,3S)類鞘脂的立體異構(gòu)體。結(jié)果，感興趣的天然存在的D-赤型的產(chǎn)量較低，并且從反應(yīng)混合物中純化D-赤型是非常困難的。
另一方面，使用由鞘脂生產(chǎn)溶血形式的酶的方法是迄今為止已知的方法。已知有以下方法使用通過諾卡氏菌屬的放線菌產(chǎn)生的神經(jīng)節(jié)苷脂神經(jīng)酰胺酶(ceramidase)的方法(生物化學(xué)雜志1031-4(1988)；JP-A 64-60379)；使用通過紅球菌屬放線菌產(chǎn)生的酶或細(xì)胞加工產(chǎn)物的方法(JP-A 6-78782)；使用通過假單胞菌屬細(xì)菌產(chǎn)生的鞘脂神經(jīng)酰胺N-脫酰基酶的方法(生物化學(xué)雜志27024370-24374(1995)；JP-A8-84587)；使用通過非發(fā)酵型革蘭氏陰性芽孢桿菌AI-2產(chǎn)生的鞘脂神經(jīng)酰胺N-脫酰酶的方法(JP-A 10-257884)；以及使用通過假單胞菌屬細(xì)菌產(chǎn)生的神經(jīng)酰胺酶的方法(JP-A 10-14563)。
然而，在這些使用酶的方法中溶血形式的反應(yīng)產(chǎn)率并不令人滿意。例如，當(dāng)使用鞘脂神經(jīng)酰胺N-脫酰酶時(shí)，盡管產(chǎn)率根據(jù)所用的底物而變化，但由神經(jīng)節(jié)苷脂GM2(其最是容易被水解的底物)的產(chǎn)率最多約為70％，而由神經(jīng)節(jié)苷脂GM1的產(chǎn)率最多約為60％。
使用以下微生物或其提取物生產(chǎn)溶血鞘脂的方法是已知的能夠產(chǎn)生糖鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰酶的鏈霉菌屬放線菌[生物科學(xué)、生物技術(shù)和生物化學(xué)592028-2032(1995)；JP-A 7-107988]；以及產(chǎn)生神經(jīng)鞘脂神經(jīng)酰胺N-脫酰酶的假單胞菌屬或希瓦氏菌屬的細(xì)菌[JP-A-10-41792]。
然而，除在向培養(yǎng)基添加底物的過程中含有感興趣的溶血形式外，反應(yīng)中還含有諸如染料、糖脂等得自培養(yǎng)基或細(xì)胞的大量雜質(zhì)。因此，為獲得高純度的溶血形式，此方法中需要復(fù)雜的純化過程。此外，出于上述原因，在此方法中處理少量的鞘脂以純化溶血形式是非常困難的。
在所有的通過使用酶、微生物或其提取物生產(chǎn)溶血鞘脂的常規(guī)方法中，反應(yīng)僅在含水體系中進(jìn)行。已知沒有使用兩相體系的方法，所說的兩相由水相和有機(jī)溶劑相組成，其中有機(jī)相形成與水相不可混和的分離相。
發(fā)明目的如上所述，通過化學(xué)法、酶法或通過使用微生物生產(chǎn)溶血鞘脂的常規(guī)方法效率較差、會(huì)產(chǎn)生不期望的副產(chǎn)物、導(dǎo)致較低的反應(yīng)產(chǎn)率、并且需要大量的勞動(dòng)和專業(yè)技術(shù)來進(jìn)行純化。
因而，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種有效生產(chǎn)溶血鞘脂的方法，該方法不產(chǎn)生副產(chǎn)物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供通過上述方法獲得的溶血鞘脂。
通過以下的描述并且參考附圖，本發(fā)明的這些和其它的目的和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見。
圖2描繪了在有機(jī)溶劑的存在下或無有機(jī)溶劑的存在下影響溶血形式產(chǎn)率的底物特異性。
圖3描繪了在表面活性劑和有機(jī)溶劑的存在下或無表面活性劑和有機(jī)溶劑的存在下產(chǎn)生溶血形式的時(shí)間過程。
圖4描繪了在有機(jī)溶劑的存在下使用不同量的酶時(shí)溶血形式的產(chǎn)率。
圖5描繪了所添加的有機(jī)溶劑的量和溶血形式的產(chǎn)率之間的關(guān)系。
籍此，本發(fā)明提供以下方面1、一種通過使用特異性水解鞘脂中類鞘脂和脂肪酸之間酰胺鍵的酶來生產(chǎn)溶血鞘脂的方法，其中酶反應(yīng)在兩相體系反應(yīng)混合物中進(jìn)行，所說的混合物中含有至少一種與水不可混和的有機(jī)溶劑；2、據(jù)上述(1)的生產(chǎn)溶血鞘脂的方法，其中酶反應(yīng)在至少一種表面活性劑的存在下進(jìn)行；3、據(jù)上述(1)或(2)的生產(chǎn)溶血鞘脂的方法，其中有機(jī)溶劑選自烴、醇、酯和醚。
4、據(jù)上述(3)的生產(chǎn)溶血鞘脂的方法，其中烴是六碳或更多碳的烴。
5、據(jù)上述(3)的生產(chǎn)溶血鞘脂的方法，其中醇是八碳或更多碳的醇。
6、據(jù)上述(3)的生產(chǎn)溶血鞘脂的方法，其中酯由六碳或更多碳的羧酸和二碳或更多碳的醇組成。
7、據(jù)上述(3)的生產(chǎn)溶血鞘脂的方法，其中醚選自苯基醚、乙二醇二乙醚、二異丙基醚和乙烯基乙醚；8、據(jù)上述(2)的生產(chǎn)溶血鞘脂的方法，其中表面活性劑選自具有甾族化合物主鏈的表面活性劑、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯脫水山梨糖醇烷基醚和聚氧乙烯烷基醚；且9、通過上述(1)-(8)任一方法獲得的溶血鞘脂。
這里所用的“TM”是指商標(biāo)。發(fā)明詳細(xì)描述本發(fā)明中用作底物的鞘脂包括天然存在的或合成的具有長鏈骨架、類鞘脂的物質(zhì)，包括單獨(dú)的或混和形式的鞘糖脂、鞘磷脂和神經(jīng)酰胺。
在本文中，溶血鞘脂是指鞘脂的N-脫酰形式，不含有通過酰胺鍵與類鞘脂的氨基相連接的脂肪酸。
關(guān)于本發(fā)明中使用的特異性水解鞘脂中類鞘脂和脂肪酸之間酰胺鍵的酶沒有限制。酶可以是已知的可從鞘脂中釋放脂肪酸的酶，并且包括，例如通過諾卡氏菌屬放線菌產(chǎn)生的神經(jīng)節(jié)苷脂神經(jīng)酰胺酶[生物化學(xué)雜志1031-4(1988)；JP-A 64-60379]；通過紅球菌屬放線菌產(chǎn)生的酶(JP-A 6-78782)；通過鏈霉菌屬放線菌產(chǎn)生的糖鞘脂神經(jīng)酰胺脫酰酶[生物科學(xué)、生物技術(shù)和生物化學(xué)592028-2032(1995)；JP-A 7-107988]；通過假單胞菌屬細(xì)菌產(chǎn)生的鞘脂神經(jīng)酰胺N-脫酰酶[生物化學(xué)雜志27024370-24374(1995)；JP-A 8-84587]；通過希瓦氏菌屬細(xì)菌產(chǎn)生的鞘脂神經(jīng)酰胺N-脫酰酶[JP-A10-45792]；通過假單胞菌屬細(xì)菌產(chǎn)生的神經(jīng)酰胺酶[JP-A 10-14563]；得自哺乳動(dòng)物組織的神經(jīng)酰胺酶[生物化學(xué)雜志2413731-3737(1966)；生物化學(xué)81692-1698；Biochimica et BiophysicaActa 176339-347(1969)；科學(xué)1781100-1102(1972)]；無脊椎動(dòng)物神經(jīng)酰胺酶[WO98/03529]。
其中，通過假單胞菌屬細(xì)菌產(chǎn)生的鞘脂神經(jīng)酰胺N-脫酰酶和通過希瓦氏菌屬細(xì)菌產(chǎn)生的鞘脂神經(jīng)酰胺N-脫酰酶具有廣泛的底物特異性，并且特別優(yōu)選于生產(chǎn)各種溶血鞘脂。
產(chǎn)生鞘脂神經(jīng)酰胺N-脫酰酶的假單胞菌屬的細(xì)菌菌株假單胞菌sp.TK-4被命名為G-182，并且已于1994年6月24日(原始保藏日)遵照布達(dá)佩斯條約進(jìn)行了保藏，其入冊(cè)登記號(hào)為FERM BP-5096。產(chǎn)生鞘脂神經(jīng)酰胺N-脫酰酶的希瓦氏菌屬的細(xì)菌菌株海藻希瓦氏菌(Shewanella alga)NS-589已于1996年6月26日保藏，入冊(cè)登記號(hào)為FERM P-15700。這兩個(gè)菌株已被保藏在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)和人體技術(shù)研究所，日本茨城縣筑波市東1丁目1番3號(hào)。
這些酶可以酶溶液的形式使用或者被固定化至不溶于水的載體上。
將水或水溶液用于本發(fā)明的水相。特別是，同針對(duì)各種反應(yīng)的酶和底物等之中添加緩沖液是優(yōu)選的。
分離相是與水不可混和的有機(jī)溶劑相。有機(jī)溶劑選自烴、醇、酯、醚和酮，以致在有機(jī)溶劑相和水相之間，脂肪酸(神經(jīng)鞘脂類的降解產(chǎn)物)在有機(jī)溶劑相中的分配比高于水相，并且作為底物的神經(jīng)鞘脂類在有機(jī)相中的分配比低于水相。
有機(jī)溶劑包括(但不限制于此)例如烴，包括脂族烴，如己烷、庚烷、辛烷、異辛烷、壬烷、癸烷、十二烷、十五烷、十七烷、十八烷、2-甲基戊烷、2,2-二甲基丁烷、2,2,3-三甲基庚烷、2,2,4-三甲基庚烷、己烯、辛烯、癸烯、十二碳烯、十五碳烯和十七碳烯；脂族環(huán)烴，如環(huán)己烷、甲基環(huán)己烷、環(huán)癸烷、環(huán)己烯和環(huán)癸烯；含鹵烴，如二氯乙烷、四氯乙烷、三氯乙烯、四氯化碳、辛基氯化物、二苯乙酮基氯化物、氯苯和二氯苯；以及芳族烴，如苯、甲苯、二甲苯、均三苯、乙苯、丁基苯、異丙基苯和對(duì)異丙基甲苯。
醇類包括辛醇、癸醇、十二烷醇、辛烯醇、癸烯醇和環(huán)癸醇。
酯類包括己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、十二碳酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯、硬脂酸丁酯、檸檬酸丁酯和檸檬酸乙酯。
醚類包括苯基醚、乙烯基乙醚、乙二醇二乙醚、二異丙基醚和辛基醚。
酮類包括辛酮、癸酮和十二烷酮。
在上述列出的有機(jī)溶劑中，具體說來在本發(fā)明的方法中可以優(yōu)選使用六碳或更多碳的烴(包括脂族、環(huán)狀、芳族和含鹵烴)、八碳或更多碳的醇、由六碳或更多碳的羧酸和二碳或更多碳的醇組成的酯、以及選自苯醚、乙二醇二乙醚、二異丙醚和乙烯基乙醚的醚。
此外，本發(fā)明中使用的有機(jī)溶劑的數(shù)量并不限制于一種。可以混合和使用兩種或多種有機(jī)溶劑。
本發(fā)明中的兩相體系包括其中水相和有機(jī)溶劑相所處狀態(tài)為水相分散在有機(jī)溶劑相中或者所處狀態(tài)為有機(jī)溶劑相分散在水相中(例如通過攪拌)、或者所處狀態(tài)為水相和有機(jī)溶劑相分離成彼此接觸的兩個(gè)相(例如通過沉降而不分散)的體系。
或者，有機(jī)溶劑相和/或水相可以在繼續(xù)酶反應(yīng)的同時(shí)偶而交換，從而使溶血鞘脂的連續(xù)生產(chǎn)成為可能。有機(jī)溶劑的添加量可以不受限制，優(yōu)選50％或更多，通常為水相體積的5-10倍。
水相中可以添加各種鹽和表面活性劑。例如，可以添加選自以下物質(zhì)中的至少一種具有甾族化合物主鏈的表面活性劑，如牛磺脫氧膽酸鈉和膽酸鈉；聚氧乙烯烷基苯基醚，如Triton型表面活性劑和Nonidet P-40TM；聚氧乙烯脫水山梨糖醇烷基醚，如吐溫型表面活性劑；以及非離子表面活性劑，如聚氧乙烯烷基醚。優(yōu)選地，表面活性劑的量不受限制，以反應(yīng)體系總體積計(jì)通常為0.1-2wt％。
關(guān)于反應(yīng)條件沒有限制。在所用的各個(gè)酶的最佳條件下(包括pH和溫度)可以更有效地生產(chǎn)溶血鞘脂。
例如，當(dāng)在反應(yīng)中使用由假單胞菌屬細(xì)菌產(chǎn)生的鞘脂神經(jīng)酰胺N-脫酰酶時(shí)，優(yōu)選通過添加具有甾族化合物主鏈的表面活性劑(如?；敲撗跄懰徕c或膽酸鈉)在pH 6-10下進(jìn)行反應(yīng)。此外，通過聯(lián)合使用聚氧乙烯烷基苯基醚(如Triton X-100TM或Nonidet P-40TM)可更有效地水解神經(jīng)鞘脂類。
關(guān)于反應(yīng)時(shí)間沒有限制。反應(yīng)可以進(jìn)行使用酶從所用底物中獲得所需量的溶血鞘脂所需要的時(shí)間，所說的底物如天然存在或合成的鞘脂，包括糖鞘脂、神經(jīng)鞘磷脂和神經(jīng)酰胺。
本發(fā)明生產(chǎn)的溶血鞘脂可以根據(jù)常規(guī)的方法來純化。
可以通過沉降后分離成兩相或者通過使用選擇膜或柱來從反應(yīng)混合物中除去有機(jī)溶劑?；蛘撸梢酝ㄟ^減壓濃縮或通過蒸餾來除去溶劑。
如此獲得的在水相中含有溶血形式的反應(yīng)混合物中含有少量污染物。因此，通過使用常規(guī)提取方法(如反相層析法、借助硅膠的正相層析法或離子交換層析法)可以容易地純化溶血鞘脂。
此外，通過將有機(jī)溶劑蒸發(fā)可以獲得得自鞘脂的脂肪酸，其中所說的有機(jī)溶劑來自從上述去除步驟中分離出的有機(jī)相。
通過薄層層析法、液相層析法、質(zhì)譜法、核磁共振波譜法等的分析，可以證實(shí)純化的溶血鞘脂的結(jié)構(gòu)。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明的方法可以將鞘脂轉(zhuǎn)化成感興趣的溶血鞘脂。
另外，通過處理本發(fā)明獲得的溶血鞘脂，可以生產(chǎn)溶血鞘脂的衍生物。例如，可以如下生產(chǎn)溶血鞘脂的衍生物。
可以根據(jù)氨基酰胺化的化學(xué)或酶的常規(guī)方法來進(jìn)行再?；饔?。
在化學(xué)再?；校磻?yīng)可以通過使用標(biāo)記或未標(biāo)記的脂族羧酸或其反應(yīng)性衍生物來進(jìn)行。本發(fā)明中可以使用的脂族羧酸的實(shí)例包括飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、以及所有的具有脂族化合物特性的羧酸，例如其中脂肪酸烴鏈被鹵素或諸如取代或未取代的氨基、氧基或羥基的官能團(tuán)所取代的酸、或者烴鏈中具有氫、硫或氨基的酸。
酶促再?；梢酝ㄟ^使用已知的脂肪酶來實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)特別有用的方法中，通過利用特異性水解鞘脂中類鞘脂和脂肪酸之間酰胺鍵的酶(例如上述的鞘脂神經(jīng)酰胺N-脫酰酶(WO98/03529))的逆反應(yīng)，可以容易地進(jìn)行再?；磻?yīng)。
所得溶血鞘脂中神經(jīng)酰胺的氨基的標(biāo)記可以通過將形成發(fā)色團(tuán)的物質(zhì)、熒光物質(zhì)、生物素、放射性同位素等引入需要標(biāo)記的部分中來完成。
以下實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明作更詳細(xì)的舉例說明，但不要理解為限制本發(fā)明的范圍。
使用薄層層析使所得反應(yīng)混合物展開。使用苔黑酚-硫酸目測(cè)檢驗(yàn)TLC平板。然后，使用圖像光密度計(jì)(Bio-Rad)定量測(cè)定GM1溶血形式的產(chǎn)率。結(jié)果示于表1。
在下表1列出的有機(jī)溶劑中，環(huán)癸烷來自Aldrich且其它全部來自nacalai tesque。
表1溶劑 溶血形式的產(chǎn)率(％)對(duì)照 68
1-丁醇 441-戊醇 511-己醇 531-庚醇 621-辛醇 702-辛醇 901-癸醇 831-十二烷醇 100己烷 76辛烷 89癸烷 95十五烷 97十七烷 97十八烷 971-己烯 801-辛烯 911-癸烯 941-十二碳烯 93環(huán)己烷 87甲基環(huán)己烷 93環(huán)癸烷 89苯 70甲苯 84二甲苯 95均三苯 97正乙苯 97正丁基苯 99對(duì)異丙基甲苯 98異丙基苯 96正辛基氯化物 99正二苯乙酮基氯化物 100氯仿 62
四氯化碳73乙酸乙酯58乙酸丁酯68乙酸己酯60乙酸苯酯55乙酸芐酯67己酸甲酯47辛酸甲酯61癸酸甲酯62十二碳酸甲酯68丙酸乙酯58丁酸乙酯54己酸乙酯73辛酸乙酯73癸酸乙酯75十二碳酸乙酯74肉豆蔻酸異丙酯 91硬脂酸正丁酯84苯醚97乙醚41丙醚54丁醚64乙烯基乙醚 73乙烯基丁醚 61乙二醇二乙醚71二異丙基醚 91
使用薄層層析使所得反應(yīng)混合物展開。使用苔黑酚-硫酸目測(cè)檢驗(yàn)TLC平板。然后，如實(shí)施例1所述使用圖像光密度計(jì)(Bio-Rad)定量測(cè)定GM1溶血形式的產(chǎn)率。結(jié)果示于表2。
表面活性劑的最終濃度以反應(yīng)體系的體積計(jì)為0.8wt％。在下表2列出的表面活性劑中，Triton X-100TM來自Pierce且其它全部來自nacalai tesque。
表2表面活性劑溶血形式的產(chǎn)率(％)沒有添加 25?；敲撗跄懰徕c99膽酸鈉92Triton X-100TM64吐溫20TM 42Nonidet P-40TM60Brij-58TM 66Lubrol PXTM 72
使用薄層層析使所得反應(yīng)混合物展開。使用苔黑酚-硫酸目測(cè)檢驗(yàn)TLC平板。然后，如實(shí)施例1所述使用圖像光密度計(jì)(Bio-Rad)定量測(cè)定GM1溶血形式的產(chǎn)率。結(jié)果示于表3．表3中表面活性劑的濃度是最終濃度，以反應(yīng)體系體積計(jì)的wt％來表達(dá)。
表3濃度 溶血形式的產(chǎn)率(％)0250.05 550.01 650.2 800.4 880.8 921.0 92
使用薄層層析使所得反應(yīng)混合物展開。使用苔黑酚-硫酸目測(cè)檢驗(yàn)TLC平板。然后，如實(shí)施例1所述使用圖像光密度計(jì)(Bio-Rad)定量測(cè)定GM1的降解率，即溶血形式的產(chǎn)率。結(jié)果如

圖1所示。
圖1描繪了在有機(jī)溶劑的存在下針對(duì)溶血形式產(chǎn)率的最佳pH。在圖中，縱軸和橫軸分別表示降解率(％)和pH?？招膱A圈和空心圓圈、空心三角和空心三角分別代表通過使用乙酸緩沖液、磷酸緩沖液、Tris-HCl緩沖液和甘氨酸-NaOH緩沖液獲得的結(jié)果。
在所得的反應(yīng)混合物中，通過使用薄層層析展開并且使用茚三酮試劑目測(cè)檢驗(yàn)所產(chǎn)生的鞘氨醇來定量測(cè)定得自神經(jīng)酰胺的溶解形式的產(chǎn)率。通過使用考馬斯亮藍(lán)目測(cè)檢驗(yàn)所產(chǎn)生的溶血鞘磷脂來定量測(cè)定鞘磷脂的產(chǎn)率。使用薄層層析使含有其它底物的反應(yīng)混合物展開。使用苔黑酚-硫酸目測(cè)檢驗(yàn)TLC平板。然后，如實(shí)施例1所述使用圖像光密度計(jì)(Bio-Rad)定量測(cè)定得自各個(gè)底物的溶血形式的產(chǎn)率。結(jié)果如圖2所示。
圖2描繪了在有機(jī)溶劑存在或缺少的情況下影響溶血形式產(chǎn)率的底物特異性。在圖中，縱軸和橫軸分別表示產(chǎn)率(％)和各種底物。涂黑條表示在正十七烷存在下的降解率，而透明條表示沒有正十七烷存在下的降解率。
圖3描繪了在有表面活性劑和有機(jī)溶劑或沒有表面活性劑和有機(jī)溶劑存在下GM1降解率的時(shí)間過程。圖中，縱軸和橫軸分別表示降解率(％)和時(shí)間(hr)。符號(hào)表示在以下物質(zhì)的存在下獲得的結(jié)果?；敲撗跄懰徕c和正癸烷(空心圓圈)、?；敲撗跄懰徕c(空心圓圈)、Triton X-100TM和正癸烷(空心方塊)、或Triton X-100TM(空心三角)。
反應(yīng)條件(A)將100μl等分的正癸烷(nacalai tesque)添加到10μl 50mM的乙酸緩沖液中(pH6.0)，所說的緩沖液含有2mU得自假單胞菌屬細(xì)菌的SCD酶[生物化學(xué)雜志27024370-24374(1995)；JP-A8-84587]、0.8％?；敲撗跄懰徕c(nacalai tesque)和10nmolGM1 (Matreya)，并且培養(yǎng)。
反應(yīng)條件(B)10μl等分的50mM乙酸緩沖液(pH6.0)，所說的緩沖液含有2mU得自假單胞菌屬細(xì)菌的SCD酶、0.8％牛磺脫氧膽酸鈉和100nmol GM1，并且培養(yǎng)。
反應(yīng)條件(C)將100μl等分的正癸烷添加到10μl 50mM的乙酸緩沖液中(pH6.0)，所說的緩沖液含有2mU得自假單胞菌屬細(xì)菌的SCD酶、0.8％Triton X-100TM(Pierce)和10nmol GM1，并且培養(yǎng)。
反應(yīng)條件(D)10μl等分的50mM乙酸緩沖液(pH6.0)，所說的緩沖液含有2mU得自假單胞菌屬細(xì)菌的SCD酶、0.8％Triton X-100TM和10nmol GM1，并且培養(yǎng)。
使用薄層層析使所得反應(yīng)混合物展開。使用苔黑酚-硫酸目測(cè)檢驗(yàn)TLC平板。然后，如實(shí)施例1所述使用圖像光密度計(jì)(Bio-Rad)定量測(cè)定GM1的降解率，即溶血形式的產(chǎn)率。結(jié)果如圖4所示。
圖4描繪了在?；敲撗跄懰徕c、不同濃度Triton X-100TM和有機(jī)溶劑的存在下使用不同量的酶的GM1降解率。圖中，縱軸和橫軸分別表示降解率(％)和Triton X-100TM的濃度(％)。
將不同數(shù)量的正癸烷(nacalai tesque)或正十七烷(nacalaitesque)添加到10μl 50mM乙酸緩沖液中(pH6.0)，所說的緩沖液含有2mU得自假單胞菌屬細(xì)菌的SCD酶[生物化學(xué)雜志27024370-24374(1995)；JP-A 8-84587]、0.8％牛磺脫氧膽酸鈉(nacalaitesque)、0.1％Triton X-100TM(Pierce)和10nmol GM1(Matreya)。將混合物在37℃下培養(yǎng)16小時(shí)。
使用薄層層析使所得反應(yīng)混合物展開。使用苔黑酚-硫酸目測(cè)檢驗(yàn)TLC平板。然后，如實(shí)施例1所述使用圖像光密度計(jì)(Bio-Rad)定量測(cè)定GM1的降解率，即溶血形式的產(chǎn)率。結(jié)果如圖5所示。
圖5描繪了有機(jī)溶劑的量與溶血形式的產(chǎn)率之間的關(guān)系。圖中，縱軸和橫軸分別表示降解率(％)和有機(jī)溶劑的量(μl)。透明條表示正癸烷的結(jié)果，而涂黑條表示正十七烷的結(jié)果。
使用薄層層析使所得反應(yīng)混合物展開。使用苔黑酚-硫酸目測(cè)檢驗(yàn)TLC平板。然后，如實(shí)施例1所述使用圖像光密度計(jì)(Bio-Rad)定量測(cè)定GM1的溶血形式的產(chǎn)率。結(jié)果如表4所示。
表面活性劑的最終濃度以反應(yīng)體系的體積計(jì)為0.1wt％。在下表4所列出的表面活性劑中，Triton X-100TM來自Pierce并且所有其它的物質(zhì)均來自nacalai tesque。
表4濃度溶血形式的產(chǎn)率(％)Triton X-100TM39吐溫20TM51吐溫80TM69
Nonidet P-40TM64Brij-58TM65Lubrol PXTM67
使用薄層層析使所得反應(yīng)混合物展開。使用苔黑酚-硫酸目測(cè)檢驗(yàn)TLC平板。然后，如實(shí)施例1所述使用圖像光密度計(jì)(Bio-Rad)定量測(cè)定GM1的溶血形式的產(chǎn)率。結(jié)果如表5所示。
混合物中表面活性劑的最終濃度以反應(yīng)體系的體積計(jì)為0.1wt％。在下表5所列出的表面活性劑中，Triton X-100TM來自Pierce并且所有其它的物質(zhì)均來自nacalai tesque。
表5混合物中的表面活性劑 溶血形式的產(chǎn)率(％)對(duì)照 53Triton X-100TM70Nonidet P-40TM68吐溫20TM48吐溫80TM50Brij-58TM53Lubrol PXTM57
將10mg神經(jīng)節(jié)苷脂GM3(Matreya)溶解于10ml 50mM乙酸緩沖液中(pH6.0)，所說的緩沖液含有0.8％?；敲撗跄懰徕c。將混合物放入200ml梨形燒瓶中，然后向其中加入2U的SCD酶。其上覆蓋100ml等分的正癸烷，并且將混合物在37℃下放置16小時(shí)。向水相加入1U的SCD酶，并且將混合物再在37℃下培養(yǎng)16小時(shí)。此時(shí)，神經(jīng)節(jié)苷脂GM3的降解率為95％。
在反應(yīng)完成之后，回收水相，將其分成兩等份并且使用反相層析進(jìn)行純化。將水相加到POROS R2H柱中(Φ4.6×100mm，PerSeptive)，然后用乙腈∶水=10∶90到乙腈∶甲醇=10∶90進(jìn)行梯度洗脫。收集含有溶血神經(jīng)節(jié)苷脂GM3的洗脫級(jí)分并且濃縮至干。結(jié)果，通過薄層層析、使用苔黑酚-硫酸與重鉻酸(bichromic acid)-硫酸混合物目測(cè)檢驗(yàn)證實(shí)獲得了5.6mg純度為95％或者更高的溶血形式。
如上所述，通過本發(fā)明的生產(chǎn)方法可以有效地、方便和高純度地大量工業(yè)化制備溶血鞘脂。
權(quán)利要求
1.一種通過使用特異性水解鞘脂中類鞘脂和脂肪酸之間酰胺鍵的酶來生產(chǎn)溶血鞘脂的方法，其中酶反應(yīng)在兩相體系反應(yīng)混合物中進(jìn)行，所說的混合物中含有至少一種與水不可混和的有機(jī)溶劑。
2.據(jù)權(quán)利要求1的生產(chǎn)溶血鞘脂的方法，其中所述的酶反應(yīng)在至少一種表面活性劑的存在下進(jìn)行。
3.據(jù)權(quán)利要求1或2的生產(chǎn)溶血鞘脂的方法，其中所述有機(jī)溶劑選自烴、醇、酯和醚。
4.據(jù)權(quán)利要求3的生產(chǎn)溶鞘脂類的方法，其中所述的烴是六碳或更多碳的烴。
5.據(jù)權(quán)利要求3的生產(chǎn)溶鞘脂類的方法，其中所述的醇是八碳或更多碳的醇。
6.據(jù)權(quán)利要求3的生產(chǎn)溶鞘脂類的方法，其中所述的酯由六碳或更多碳的羧酸和二碳或更多碳的醇組成。
7.據(jù)權(quán)利要求3的生產(chǎn)溶血鞘脂的方法，其中所述的醚選自苯基醚、乙二醇二乙醚、二異丙基醚和乙烯基乙醚。
8.據(jù)權(quán)利要求2的生產(chǎn)溶血鞘脂的方法，其中所述的表面活性劑選自具有甾族化合物主鏈的表面活性劑、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯脫水山梨糖醇烷基醚和聚氧乙烯烷基醚。
9.通過權(quán)利要求1-8任一方法獲得的溶血鞘脂。
全文摘要
一種通過使用能夠特異性水解鞘脂中類鞘脂和脂肪酸之間酸性酰胺鍵的酶來生產(chǎn)溶鞘脂類的方法,其特征在于酶反應(yīng)在兩相體系的液體反應(yīng)混合物中進(jìn)行,所說的混合物中含有至少一種形成水相和分離相的有機(jī)溶劑,如果需要可以有表面活性劑存在。
文檔編號(hào)C12P13/00GK1296528SQ99804807
公開日2001年5月23日 申請(qǐng)日期1999年3月30日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月31日
發(fā)明者栗田豐久, 伊豆博幸, 佐野睦, 加藤郁之進(jìn) 申請(qǐng)人:寶酒造株式會(huì)社