專利名稱：制備具有高唾液酸含量的重組糖蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及制備具有高唾液酸含量的重組糖蛋白的方法。
背景技術(shù)：
唾液酸(Sia，NeuAc，NeuGc)是對(duì)神經(jīng)氨酸(Neu)的?；苌锏耐ǚQ。唾液酸最早由Blix在1936年從牛唾液腺的粘蛋白中分離出，它是包含9個(gè)碳并具有COOH基團(tuán)的酸性糖。根據(jù)取代基團(tuán)的不同，已經(jīng)報(bào)道了 50種唾液酸(Angata，T.和Varki，A. ,Chem. Rev, 102,439-469,2002)，已知這50種唾液酸在不同的物種和組織中特異地分布。在高等動(dòng)物中，通過(guò)各自的特異性唾液酸轉(zhuǎn)移酶的反應(yīng)，唾液酸經(jīng)α -糖苷鍵連接至糖蛋白、糖脂及寡糖聚糖的fell、GlcNAc、GalNAc和唾液酸。由于糖綴合聚糖的唾液酸位于聚糖結(jié)構(gòu)的末端，而該末端存在于細(xì)胞膜表面上， 已預(yù)期唾液酸直接參與細(xì)胞與胞外環(huán)境之間的接觸，并且近期已知通過(guò)去除唾液酸縮短了體液中的血細(xì)胞或糖蛋白的壽命。例如，當(dāng)去除紅細(xì)胞膜上的唾液酸(脫唾液酸化作用 (asialylation))時(shí)，半乳糖暴露于細(xì)胞表面上并結(jié)合至枯否細(xì)胞(Kupffer cell)表面上的受體凝集素，該凝集素特異地結(jié)合至半乳糖。由此，通過(guò)受體介導(dǎo)的胞吞作用，半乳糖被從循環(huán)系統(tǒng)中去除，而已去除唾液酸的脫唾液酸糖蛋白也被肝細(xì)胞表面上的凝集素結(jié)合， 并被以類似于紅細(xì)胞的上述方式從循環(huán)系統(tǒng)中去除。此外，對(duì)于α-抗胰蛋白酶、膽堿酯酶、絨毛膜促性腺激素、CTLA4Ig、第八因子(Factor VIII)、Y -谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)和促黃體生成激素(LH)這些唾液酸化糖蛋白，據(jù)報(bào)道與未結(jié)合唾液酸的糖蛋白相比，結(jié)合有唾液酸的糖蛋白半衰期顯著延長(zhǎng)(Ngantung FA.等，2006，Biotechnol. Bioeng,95(1)，106，106-119)。特別地，在唾液酸化糖蛋白中，促紅細(xì)胞生成素(EPO)是誘導(dǎo)紅細(xì)胞生成的糖蛋白激素，重組促紅細(xì)胞生成素正被用作貧血的治療劑。野生型促紅細(xì)胞生成素含有3個(gè) N-聚糖和1個(gè)0-聚糖。由于1個(gè)N-聚糖最多可結(jié)合4個(gè)唾液酸且1個(gè)0-聚糖最多可結(jié)合2個(gè)唾液酸，1個(gè)促紅細(xì)胞生成素分子有可能一共結(jié)合14個(gè)唾液酸。結(jié)合有聚糖的唾液酸阻斷了存在于肝中的脫唾液酸糖蛋白受體的結(jié)合，從而防止了肝中促紅細(xì)胞生成素的分解。促血小板生成素(TPO)是類似于EPO的激素，主要由肝和腎產(chǎn)生，TPO調(diào)節(jié)骨髓中的血小板生成。TPO由332個(gè)氨基酸組成，分子量大約為80 IOOkDa,具有6個(gè)N-聚糖和M個(gè)0-聚糖。起始的155個(gè)氨基酸與EPO非常類似，就如EPO的糖蛋白而言，聚糖的唾液酸含量顯著地影響了該蛋白的體內(nèi)穩(wěn)定性。通過(guò)用唾液酸酶從EPO中去除全部唾液酸后，觀察到EPO體內(nèi)活性顯著下降而證實(shí)了上述事實(shí)(Takeuchi M等，1989，ft~OC Natl Acad ki，7819-22)。對(duì)于EPO而言，聚糖的結(jié)構(gòu)具有四天線、四唾液酸化及核心巖藻糖基化的形式，就重組人TPO而言，各種聚糖結(jié)構(gòu)具有二天線或異源的形式(Inous N等，1999， Glycoconjugate Journal，16，707-718)。因此，糖蛋白的唾液酸含量提高越多，糖蛋白在體內(nèi)的半衰期就變得越長(zhǎng)(Fukuda, Μ. N.等，1989，Blood, 73，84-89 ；Sinclair, Α. Μ.等，2005，J. Pharm. Sci.，94， 1626-1635)。因此，唾液酸含量的提高對(duì)于治療性糖蛋白的品質(zhì)和生物等效性而言是必需的。因此，本發(fā)明人等研究了通過(guò)提高唾液酸化糖蛋白(如促紅細(xì)胞生成素和促血小板生成素)的唾液酸含量來(lái)增強(qiáng)內(nèi)在活性的方法。結(jié)果，本發(fā)明人等通過(guò)在產(chǎn)生人促紅細(xì)胞生成素或促血小板生成素的細(xì)胞中同時(shí)過(guò)表達(dá)CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(CMP-SAT)、α-2， 3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶和誘導(dǎo)有點(diǎn)突變的UDP-GlcNAc 2-表異構(gòu)酶/ManNAc激酶(GNE/MNK)，并鑒定出促紅細(xì)胞生成素和促血小板生成素的唾液酸含量相比于野生型的唾液酸含量顯著提高而完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一個(gè)目的是提供制備具有高唾液酸含量的重組糖蛋白的方法。為實(shí)現(xiàn)所述目的，本發(fā)明提供了制備唾液酸含量提高的糖蛋白的方法，所述方法包括1)制備包含編碼UDP-GlcNAc 2_表異構(gòu)酶/ManNAc激酶(GNE/MNK)的基因、編碼 α -2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的基因以及編碼單磷酸胞苷(CMP)-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因的表達(dá)載體，所述GNE/MNK具有SEQ ID NO :1所表示的氨基酸序列中的263位氨基酸或266位氨基酸被取代的氨基酸序列，所述α _2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶具有SEQ ID NO :4所表示的氨基酸序列，所述CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體具有SEQ ID NO 5所表示的氨基酸序列；2)將步驟1)中的所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入產(chǎn)生唾液酸化糖蛋白的宿主細(xì)胞中以制備轉(zhuǎn)染子；以及3)孵育步驟2、中的所述轉(zhuǎn)染子以從所述轉(zhuǎn)染子中純化出重組糖蛋白。本發(fā)明也提供了通過(guò)所述方法制備的唾液酸含量提高的糖蛋白。本發(fā)明還提供了制備胞內(nèi)CMP-唾液酸含量提高的細(xì)胞的方法，所述方法包括1)制備包含編碼GNE/MNK的基因、編碼α-2，3_唾液酸轉(zhuǎn)移酶的基因以及編碼 CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因的表達(dá)載體，所述GNE/MNK具有SEQ ID NO 1所表示的氨基酸序列中的263位氨基酸或266位氨基酸被取代的氨基酸序列，所述α -2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶具有SEQ ID NO :4所表示的氨基酸序列，所述CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體具有SEQ ID NO :5所表示的氨基酸序列；以及2)將步驟1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中以制備轉(zhuǎn)染子。本發(fā)明也提供了制備胞內(nèi)CMP-唾液酸含量提高的細(xì)胞的方法，所述方法包括1)制備包含編碼GNE/MNK的基因的表達(dá)載體，所述GNE/MNK具有SEQ ID NO 1所表示的氨基酸序列中的263位氨基酸或266位氨基酸被取代的氨基酸序列；以及2)將步驟1)中的所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中以制備轉(zhuǎn)染子。本發(fā)明也提供了通過(guò)所述方法制備的胞內(nèi)CMP-唾液酸含量提高的細(xì)胞。在產(chǎn)生糖蛋白的宿主細(xì)胞中，同時(shí)過(guò)表達(dá)人α-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因、CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因和誘導(dǎo)有點(diǎn)突變的GNE/MNK基因。所述誘導(dǎo)有點(diǎn)突變的GNE/MNK基因僅用亮氨酸取代263位的精氨酸，或進(jìn)一步用谷氨酰胺或色氨酸取代266位的精氨酸。因此，由于宿主細(xì)胞中的胞內(nèi)CMP-唾液酸含量及促紅細(xì)胞生成素和促血小板生成素中的唾液酸增力口，在產(chǎn)生唾液酸化重組糖蛋白的宿主細(xì)胞中過(guò)表達(dá)上述3種基因可用于制備相比于野生型糖蛋白而言唾液酸含量提高的糖蛋白。


從與附圖結(jié)合的下列詳細(xì)描述中，將更清楚地理解本發(fā)明的上述和其它目的、特征和其它優(yōu)點(diǎn)，其中圖1為表示所制備的用于在微生物中過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)有突變的UDP-GlcNAc 2_表異構(gòu)酶/ManNAc激酶(GNE/MNK)酶的表達(dá)載體的圖；圖2為表示隨CMP-唾液酸濃度的GNE/MNK表異構(gòu)酶活性的圖表㈧和表示根據(jù)各點(diǎn)突變誘導(dǎo)的表異構(gòu)酶的相對(duì)比活性的圖表⑶；圖3為表示所制備的用于在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中過(guò)表達(dá)α-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)載體的圖；圖4為表示所制備的用于在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中過(guò)表達(dá)CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)載體的圖；圖5為表示所制備的用于在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)有點(diǎn)突變的GNE/MNK 基因的表達(dá)載體的圖；圖6為表示通過(guò)RT-PCR鑒定轉(zhuǎn)染入中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中的點(diǎn)突變的GNE/MNK基因的表達(dá)的圖；圖7為表示過(guò)表達(dá)了點(diǎn)突變的GNE/MNK基因的胞內(nèi)CMP-唾液酸含量的圖表；圖8為表示轉(zhuǎn)染入中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中的α-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因㈧和點(diǎn)突變的GNE/MNK基因(B)的表達(dá)的圖；圖9為表示轉(zhuǎn)染了點(diǎn)突變的GNE/MNK基因、人α-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因和 CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中的CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物成倍增長(zhǎng)的圖表；圖10為表示轉(zhuǎn)染了點(diǎn)突變的GNE/MNK基因、人α-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因和 CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中的胞內(nèi)CMP-唾液酸含量的圖表；圖11為表示轉(zhuǎn)染了點(diǎn)突變的GNE/MNK基因、人α-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因和 CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中通過(guò)等電聚焦(IEF)遷移到負(fù)電荷處的促紅細(xì)胞生成素亞型的圖；圖12為表示轉(zhuǎn)染了點(diǎn)突變的GNE/MNK基因、人α-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因和 CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中的重組促紅細(xì)胞生成素的唾液酸含量的圖表；以及圖13為表示由陰離子交換HPLC得到的促紅細(xì)胞生成素的N-連接型聚糖的唾液酸化圖譜的圖。
具體實(shí)施例方式在下文中，將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。本發(fā)明提供了制備唾液酸含量提高的糖蛋白的方法。上述方法優(yōu)選包括、但不限于以下步驟
1)制備包含編碼UDP-GlcNAc 2_表異構(gòu)酶/ManNAc激酶(GNE/MNK)的基因、編碼 α -2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的基因以及編碼單磷酸胞苷(CMP)-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因的表達(dá)載體，所述GNE/MNK具有SEQ ID NO :1所表示的氨基酸序列中的263位氨基酸或266位氨基酸被取代的氨基酸序列，所述α _2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶具有SEQ ID NO :4所表示的氨基酸序列，所述CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體具有SEQ ID NO 5所表示的氨基酸序列；2)將步驟1)中的所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入產(chǎn)生唾液酸化糖蛋白的宿主細(xì)胞中以制備轉(zhuǎn)染子；以及3)孵育步驟2、中的所述轉(zhuǎn)染子以從所述轉(zhuǎn)染子中純化出重組糖蛋白。所述糖蛋白優(yōu)選為選自于由促紅細(xì)胞生成素、促血小板生成素、α-抗胰蛋白酶、 膽堿酯酶、絨毛膜促性腺激素、CTLA4Ig、第八因子、γ -谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、粒細(xì)胞集落刺激因子 (G-CSF)和促黃體生成激素(LH)所組成的組中的一種，更優(yōu)選為促紅細(xì)胞生成素或促血小板生成素，但不限于此。在上述方法中，在步驟1)中的GNE/MNK中，優(yōu)選、但不限于由亮氨酸取代其263位的精氨酸。在所述GNE/MNK中，優(yōu)選、但不限于由谷氨酰胺或色氨酸取代其266位的精氨酸。 在所述GNE/MNK中，更優(yōu)選由亮氨酸取代其263位的精氨酸且優(yōu)選由谷氨酰胺或色氨酸取代其266位的精氨酸，但不限于此。在上述方法中，步驟幻中的宿主細(xì)胞優(yōu)選為選自于由酵母細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲(chóng)細(xì)胞所組成的組中的一種，但不限于此。所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞優(yōu)選為選自于由中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、HT-1080、人類淋巴母細(xì)胞、SP2/0(小鼠骨髓瘤細(xì)胞)、NS0 (小鼠骨髓瘤細(xì)胞)、幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK)、人胚腎細(xì)胞(HEK)、PERC. 6(人視網(wǎng)膜細(xì)胞)所組成的組中的一種，更優(yōu)選為CH0，但不限于此。在具有263位氨基酸或266位氨基酸被取代的氨基酸序列的GNE/MNK中，表異構(gòu)酶活性優(yōu)選得以維持但并不限于此，而不受CMP-唾液酸濃度的影響。傳統(tǒng)地，由患有遺傳性代謝途徑疾病(如唾液酸尿癥(sialuria))的患者的遺傳分析結(jié)果，報(bào)道了在UDP-GlcNAc 2-表異構(gòu)酶/ManNAc激酶(GNE/MNK)基因中出現(xiàn)了由沈3 位的精氨酸氨基酸突變?yōu)榱涟彼?、或?66位的精氨酸氨基酸突變?yōu)楣劝滨０坊蛏彼岬狞c(diǎn)突變(R263L、和M66Q或R266W)，該位點(diǎn)為表異構(gòu)酶的變構(gòu)位點(diǎn)。由于CMP-唾液酸在正常狀態(tài)細(xì)胞中積聚，表異構(gòu)酶的反饋抑制由于所述點(diǎn)突變而消失，鑒定出唾液酸過(guò)度合成并超出需求地積聚(Seppala,R.等，1999，Am. J. Hum. Genet.，64，1563-1569)。然而，由于一直沒(méi)有通過(guò)利用表異構(gòu)酶的反饋抑制來(lái)提高糖蛋白(如促紅細(xì)胞生成素和促血小板生成素)的唾液酸含量的研究，本發(fā)明人等意在研究出通過(guò)利用GNE/MNK基因的點(diǎn)突變來(lái)提高結(jié)合有唾液酸的糖蛋白的唾液酸含量的方法。本發(fā)明人等意在通過(guò)對(duì)UDP-GlcNAc 2_表異構(gòu)酶/ManNAc激酶(GNE/MNK)的點(diǎn)突變鑒定出對(duì)該酶的表異構(gòu)酶活性的影響，UDP-GlcNAc 2-表異構(gòu)酶/ManNAc激酶參與唾液酸的合成代謝途徑。因此，本發(fā)明人等通過(guò)用亮氨酸取代野生型GNE/MNK基因263位的精氨酸、通過(guò)用谷氨酰胺或色氨酸取代GNE/MNK基因266位的精氨酸、或通過(guò)用亮氨酸取代野生型GNE/MNK基因263位的精氨酸并用谷氨酰胺或色氨酸取代GNE/MNK基因266位的精氨酸誘導(dǎo)點(diǎn)突變(參見(jiàn)圖1)，并將其插入表達(dá)載體中以在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)。純化過(guò)表達(dá)的 GNE/MNK酶后，測(cè)定表異構(gòu)酶活性。結(jié)果，對(duì)于誘導(dǎo)了點(diǎn)突變的各類GNE/MNK，顯示其表異構(gòu)酶活性維持不變，而不受CMP-唾液酸濃度提高的影響，這一點(diǎn)不同于野生型GNE/MNK (參見(jiàn)圖2)。因此，發(fā)現(xiàn)相比于正常狀態(tài)細(xì)胞，表達(dá)點(diǎn)突變的GNE/MNK酶的細(xì)胞可合成并積聚更多的CMP-唾液酸。為了鑒定由點(diǎn)突變的GNE/MNK過(guò)表達(dá)引起的CMP-唾液酸含量的變化，本發(fā)明人等制備了點(diǎn)突變的GNE/MNK (M63L或R263L-R266Q)的表達(dá)載體(參見(jiàn)圖幻，將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中并在該細(xì)胞中過(guò)表達(dá)所述表達(dá)載體，所述中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞為產(chǎn)生重組促紅細(xì)胞生成素的宿主細(xì)胞。結(jié)果，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)鑒定了所述宿主細(xì)胞中的點(diǎn)突變的GNE/MNK基因的過(guò)表達(dá)(參見(jiàn)圖6)，在聚糖末端唾液酸化中用作底物的 CMP-唾液酸的胞內(nèi)含量相比于野生型宿主細(xì)胞顯示出提高(參見(jiàn)圖7)。本發(fā)明人等意在研究由α -2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶、CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體和點(diǎn)突變的 GNE/MNK的過(guò)表達(dá)引起的糖蛋白唾液酸含量的變化，所述α-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶為將唾液酸連接至N-連接型聚糖的半乳糖殘基的酶。因此，本發(fā)明人等制備了所述α _2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶、CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體和點(diǎn)突變的GNE/MNK的表達(dá)載體(參見(jiàn)圖3、圖4和圖幻，將所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中并在該細(xì)胞中過(guò)表達(dá)所述表達(dá)載體，所述中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞為產(chǎn)生重組促紅細(xì)胞生成素或促血小板生成素的宿主細(xì)胞。結(jié)果，通過(guò)PCR鑒定了所述全部3種基因的過(guò)表達(dá)(參見(jiàn)圖8和圖9)，并且胞內(nèi)CMP-唾液酸含量顯示出提高(參見(jiàn)圖10)。為了根據(jù)從所述細(xì)胞中純化的促紅細(xì)胞生成素的分子電荷總量鑒定亞型，在導(dǎo)入了所述3種基因的細(xì)胞系中進(jìn)行等電聚焦(IEF)分析，由于唾液酸含量的提高，所有亞型都遷移至負(fù)極(參見(jiàn)圖11)。此外，相比于野生型細(xì)胞，產(chǎn)生的重組促紅細(xì)胞生成素和促血小板生成素的唾液酸含量顯示出顯著的提高(參見(jiàn)圖1 。另外，為了更準(zhǔn)確地分析促紅細(xì)胞生成素的N-連接型聚糖中唾液酸的結(jié)合形式，作為通過(guò)陰離子交換HPLC進(jìn)行的N-連接型聚糖唾液酸化圖譜分析的結(jié)果，本發(fā)明人鑒定出，在導(dǎo)入了所述3種基因的細(xì)胞系中，中性唾液酸化聚糖和單唾液酸化聚糖的比例顯著降低，而四唾液酸化聚糖的比例大幅提高(圖 13)。因此，已發(fā)現(xiàn)通過(guò)將α -2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶、CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體和點(diǎn)突變的GNE/MNK 導(dǎo)入產(chǎn)生重組促紅細(xì)胞生成素或促血小板生成素的細(xì)胞中，胞內(nèi)CMP-唾液酸含量提高，促紅細(xì)胞生成素和促血小板生成素的唾液酸含量也由此提高。因此，通過(guò)在產(chǎn)生唾液酸化重組糖蛋白的宿主細(xì)胞中過(guò)表達(dá)α-2，3_唾液酸轉(zhuǎn)移酶、CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體和點(diǎn)突變的GNE/MNK，將α -2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶、CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體和點(diǎn)突變的GNE/MNK用于制備唾液酸含量提高的糖蛋白。此外，本發(fā)明提供了通過(guò)所述方法制備的唾液酸含量提高的糖蛋白。所述唾液酸含量提高的糖蛋白優(yōu)選為選自于由促紅細(xì)胞生成素、促血小板生成素、α-抗胰蛋白酶、膽堿酯酶、絨毛膜促性腺激素、CTLA4Ig、第八因子、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、 粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)和促黃體生成激素(LH)所組成的組中的一種，更優(yōu)選為促紅細(xì)胞生成素或促血小板生成素，但不限于此。所述唾液酸含量提高的糖蛋白優(yōu)選、但不限于唾液酸/糖蛋白的摩爾比為7。在產(chǎn)生促紅細(xì)胞生成素或促血小板生成素的宿主細(xì)胞中同時(shí)過(guò)表達(dá)人α _2， 3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶、CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體和GNE/MNK，在該GNE/MNK中，通過(guò)用亮氨酸取代沈3 位的精氨酸、或通過(guò)用亮氨酸取代263位的精氨酸并用谷氨酰胺或色氨酸取代266位的精氨酸誘導(dǎo)了點(diǎn)突變。由于在所述產(chǎn)生促紅細(xì)胞生成素或促血小板生成素的宿主細(xì)胞中，胞內(nèi)CMP-唾液酸含量以及促紅細(xì)胞生成素和促血小板生成素的唾液酸含量提高，通過(guò)過(guò)表達(dá)所述3種基因制備的唾液酸化糖蛋白可以有用地用作唾液酸含量提高的糖蛋白。此外，本發(fā)明提供了制備胞內(nèi)CMP-唾液酸含量提高的細(xì)胞的方法。所述方法包括、但不限于以下步驟1)制備包含編碼GNE/MNK的基因、編碼α-2，3_唾液酸轉(zhuǎn)移酶的基因以及編碼 CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因的表達(dá)載體，所述GNE/MNK具有SEQ ID NO 1所表示的氨基酸序列中的263位氨基酸或266位氨基酸被取代的氨基酸序列，所述α -2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶具有SEQ ID NO :4所表示的氨基酸序列，所述CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體具有SEQ ID NO :5所表示的氨基酸序列；以及2)將步驟1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中以制備轉(zhuǎn)染子。進(jìn)一步地，所述方法包括、但不限于以下步驟 1)制備包含編碼GNE/MNK的基因的表達(dá)載體，所述GNE/MNK具有SEQ ID NO 1所表示的氨基酸序列中的263位氨基酸或266位氨基酸被取代的氨基酸序列；以及2)將步驟1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中以制備轉(zhuǎn)染子。在上述方法中，優(yōu)選、但不限于由亮氨酸取代步驟1)中263位的精氨酸。在所述 GNE/MNK中，優(yōu)選、但不限于由谷氨酰胺或色氨酸取代266位的精氨酸。在所述GNE/MNK中， 優(yōu)選由亮氨酸取代263位的精氨酸并優(yōu)選由谷氨酰胺或色氨酸取代266位的精氨酸，但不限于此。在上述方法中，步驟幻中的宿主細(xì)胞優(yōu)選為選自于由酵母細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲(chóng)細(xì)胞所組成的組中的一種，但不限于此。所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞優(yōu)選為選自于由中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、HT-1080、人類淋巴母細(xì)胞、SP2/0(小鼠骨髓瘤細(xì)胞)、NS0(小鼠骨髓瘤細(xì)胞)、幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK)、人胚腎細(xì)胞(HEK)、PERC.6(人視網(wǎng)膜細(xì)胞)所組成的組中的一種，更優(yōu)選為CH0，但不限于此。CMP-唾液酸為唾液酸的活性形式，應(yīng)在細(xì)胞中維持高水平以提高糖蛋白的唾液酸含量。在將α -2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶、CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體和點(diǎn)突變的GNE/MNK的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入產(chǎn)生重組促紅細(xì)胞生成素或促血小板生成素的宿主細(xì)胞中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中后，與野生型宿主細(xì)胞相比，其胞內(nèi)CMP-唾液酸含量顯著提高。在將點(diǎn)突變的GNE/MNK的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入產(chǎn)生促紅細(xì)胞生成素的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中后，相比于野生型宿主細(xì)胞，其胞內(nèi)CMP-唾液酸含量顯著提高。在天然型GNE/MNK中，已知當(dāng)唾液酸的胞內(nèi)前體CMP-唾液酸的濃度提高時(shí)，由于通過(guò)反饋抑制機(jī)制抑制了天然型UDP-GlcNAc 2-表異構(gòu)酶的活性， 最終阻止了唾液酸的合成。如上所述，通過(guò)取代GNE/MNK的特定氨基酸序列，由于唾液酸合成途徑中的活性得以維持并且由CMP-唾液酸引起的反饋抑制機(jī)制不起作用，因而胞內(nèi)的 CMP-唾液酸得以充分維持。因此，通過(guò)在產(chǎn)生唾液酸化重組糖蛋白的宿主細(xì)胞中過(guò)表達(dá)α-2，3_唾液酸轉(zhuǎn)移酶、CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體和點(diǎn)突變的GNE/MNK ；或通過(guò)過(guò)表達(dá)點(diǎn)突變的GNE/MNK，可將α -2， 3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶、CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體和點(diǎn)突變的GNE/MNK有用地用于制備胞內(nèi)CMP-唾液酸含量提高的細(xì)胞。此外，本發(fā)明提供了通過(guò)所述方法制備的CMP-唾液酸含量提高的細(xì)胞。
在將α -2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶、CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體和GNE/MNK (該GNE/MNK通過(guò)用亮氨酸取代263位的精氨酸、或通過(guò)用亮氨酸取代263位的精氨酸且用谷氨酰胺或色氨酸取代266位的精氨酸誘導(dǎo)了點(diǎn)突變)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入產(chǎn)生重組促紅細(xì)胞生成素或促血小板生成素的宿主細(xì)胞中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中后，與野生型宿主細(xì)胞相比，其胞內(nèi)CMP-唾液酸含量顯著提高。在將點(diǎn)突變的GNE/MNK的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入產(chǎn)生促紅細(xì)胞生成素的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中后，與野生型宿主細(xì)胞相比，其胞內(nèi)CMP-唾液酸含量顯著提高。如上所述，通過(guò)取代GNE/MNK的特定氨基酸序列，胞內(nèi)的CMP-唾液酸得以充分維持。因此，通過(guò)在產(chǎn)生唾液酸化重組糖蛋白的宿主細(xì)胞中過(guò)表達(dá)α-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶、CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體和點(diǎn)突變的GNE/MNK ；或通過(guò)過(guò)表達(dá)點(diǎn)突變的GNE/MNK所制備的細(xì)胞可有用地用作胞內(nèi)CMP-唾液酸含量提高的細(xì)胞。實(shí)施例下文將參考以下實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)實(shí)施例來(lái)更加詳細(xì)地描述本發(fā)明。然而，以下實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)實(shí)施例僅為說(shuō)明性目的提供，并不應(yīng)以任何方式限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1 :UDP_GlcNAc 2-表異構(gòu)酶/ManNAc激酶(GNE/MNK)基因的點(diǎn)突變誘導(dǎo)<1-1>GNE/MNK基因263位氨基酸或266位氨基酸的取代通過(guò)利用正向引物(5‘ -ATGGAGAAGAACGGGAATAACCGG-3 ‘，SEQ ID NO :6)禾口反向引物(5' -CTAGTGGATCCTGCGGGTCGTGTAG-3 ‘，SEQ ID NO :7)經(jīng) PCR 從褐家鼠(Rattus norvegicus)的月干組織(從 Korea Advanced Institute of Science and Technology 獲得)中擴(kuò)增野生型GNE/MNK基因(SEQ ID NO : 1)，然后，通過(guò)表1中所示的誘導(dǎo)點(diǎn)突變的引物和 QuickChange Site-Directed Mutagenesis 試劑盒(Stratagene)，利用用于點(diǎn)突變的正向引物(5 ‘ -GGAGATGGTTCTAGTGATGCGAAG-3 ‘，SEQ ID NO :8)和反向引物(5 ‘ -CCTCTA CCAAGATCACTACGCCTTC-3 ‘，SEQ ID NO :9)，用亮氨酸取代洸3 位的精氨酸(SEQ ID NO 2)； 或用谷氨酰胺或色氨酸取代266位的精氨酸。<1-2>GNE/MNK基因263位氨基酸或266位氨基酸的取代根據(jù)上述實(shí)施例<1_1>的方法，利用正向引物 (5 ‘ -ATGGAGAAGAACGGGAATAACCGG-3 ‘，SEQ ID NO 6)和反向引物(5 ‘ -CTAGTGGATC CTGCGGGTCGTGTAG-3 ‘，SEQ ID NO 7)經(jīng) PCR 擴(kuò)增野生型 GNE/MNK 基因(SEQ ID N0: 1)，然后，通過(guò)表1中所示的誘導(dǎo)點(diǎn)突變的引物，使用用于點(diǎn)突變的另一正向引物 (5' -GGAGATGGTCTAGTGATGCAGAAG-3 ‘，SEQ ID NO 10)和反向引物(5 ‘ -CCTCTACCAAGATC ACTACGTCTTC-3'，SEQ ID NO 11)，用亮氨酸取代沈3位的精氨酸并用谷氨酰胺取代沈6位的精氨酸(SEQ ID NO 3)；或用亮氨酸取代263位的精氨酸并用色氨酸取代266位的精氨酸。表1用于誘導(dǎo)唾液酸尿癥樣點(diǎn)突變的引物序列
權(quán)利要求
1.制備唾液酸含量提高的糖蛋白的方法，所述方法包括1)制備包含編碼UDP-GlcNAc2-表異構(gòu)酶/ManNAc激酶(GNE/MNK)的基因、編碼α-2， 3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的基因以及編碼單磷酸胞苷(CMP)-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因的表達(dá)載體，所述GNE/MNK具有SEQ ID NO 1所表示的氨基酸序列中的263位氨基酸或266位氨基酸被取代的氨基酸序列，所述α-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶具有SEQ ID NO :4所表示的氨基酸序列，所述 CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體具有SEQ ID NO 5所表示的氨基酸序列；2)將步驟1)中的所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入產(chǎn)生唾液酸化糖蛋白的宿主細(xì)胞中以制備轉(zhuǎn)染子；以及3)孵育步驟幻中的所述轉(zhuǎn)染子以從所述轉(zhuǎn)染子中純化出重組糖蛋白。
2.如權(quán)利要求1中所述的方法，其中，所述糖蛋白選自于由促紅細(xì)胞生成素、促血小板生成素、α-抗胰蛋白酶、膽堿酯酶、絨毛膜促性腺激素、CTLA4Ig、第八因子、Y -谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)和促黃體生成激素(LH)所組成的組中的一種。
3.如權(quán)利要求1中所述的方法，其中，用亮氨酸取代所述步驟1)中的所述GNE/MNK中 263位的精氨酸。
4.如權(quán)利要求1中所述的方法，其中，用谷氨酰胺或色氨酸取代所述步驟1)中的所述 GNE/MNK中266位的精氨酸。
5.如權(quán)利要求1中所述的方法，其中，用亮氨酸取代所述步驟1)中的所述GNE/MNK中 263位的精氨酸、并用谷氨酰胺或色氨酸取代所述步驟1)中的所述GNE/MNK中266位的精氨酸。
6.如權(quán)利要求1中所述的方法，其中，所述步驟2)中的所述宿主細(xì)胞選自于由酵母細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲(chóng)細(xì)胞所組成的組中的一種。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自于由中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞 (CHO)、HT-1080、人類淋巴母細(xì)胞、SP2/0(小鼠骨髓瘤細(xì)胞)、NSO (小鼠骨髓瘤細(xì)胞)、幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK)、人胚腎細(xì)胞(HEK)和PERC.6(人視網(wǎng)膜細(xì)胞)所組成的組中的一種。
8.通過(guò)如權(quán)利要求1所述的方法制備的唾液酸含量提高的糖蛋白。
9.如權(quán)利要求8所述的糖蛋白，其中，所述唾液酸含量提高的糖蛋白的唾液酸/糖蛋白的摩爾比為7以上。
10.如權(quán)利要求8中所述的糖蛋白，其中，所述糖蛋白選自于由促紅細(xì)胞生成素、促血小板生成素、α-抗胰蛋白酶、膽堿酯酶、絨毛膜促性腺激素、CTLA4Ig、第八因子、Y -谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)和促黃體生成激素(LH)所組成的組中的一種。
11.制備胞內(nèi)CMP-唾液酸含量提高的細(xì)胞的方法，所述方法包括1)制備包含編碼UDP-GlcNAc2-表異構(gòu)酶/ManNAc激酶(GNE/MNK)的基因、編碼α-2， 3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的基因以及編碼CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因的表達(dá)載體，所述GNE/MNK具有SEQ ID No :1所表示的氨基酸序列中的263位氨基酸或266位氨基酸被取代的氨基酸序列，所述α -2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶具有SEQ ID NO 4所表示的氨基酸序列，所述CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體具有SEQ ID NO :5所表示的氨基酸序列；以及2)將步驟1)中的所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中以制備轉(zhuǎn)染子。
12.制備胞內(nèi)CMP-唾液酸含量提高的細(xì)胞的方法，所述方法包括1)制備包含編碼GNE/MNK的基因的表達(dá)載體，所述GNE/MNK具有SEQ ID NO :1所表示的氨基酸序列中的263位氨基酸或266位氨基酸被取代的氨基酸序列；以及 2)將步驟1)中的所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中以制備轉(zhuǎn)染子。
13.如權(quán)利要求11或12中所述的方法，其中，用亮氨酸取代所述步驟1)中的所述GNE/ MNK中263位的精氨酸。
14.如權(quán)利要求11或12中所述的方法，其中，用谷氨酰胺或色氨酸取代所述步驟1)中的所述GNE/MNK中266位的精氨酸。
15.如權(quán)利要求11或12中所述的方法，其中，用亮氨酸取代所述步驟1)中的所述GNE/ MNK中263位的精氨酸、并用谷氨酰胺或色氨酸取代步驟1)中的所述GNE/MNK中266位的精氨酸。
16.通過(guò)如權(quán)利要求11或12所述的方法制備的唾液酸含量提高的細(xì)胞。
全文摘要
本申請(qǐng)涉及制備具有高唾液酸含量的重組糖蛋白的方法。具體而言，對(duì)于UDP-GlcNAc 2-表異構(gòu)酶/ManNAc激酶(GNE/MNK)酶(該酶中，通過(guò)僅用亮氨酸取代263位的精氨酸、或通過(guò)進(jìn)一步用谷氨酰胺取代266位的精氨酸誘導(dǎo)了點(diǎn)突變)而言，該酶的表異構(gòu)酶活性維持不變，不受CMP-唾液酸濃度的影響，并且，過(guò)表達(dá)該酶的細(xì)胞的胞內(nèi)單磷酸胞苷(CMP)-唾液酸含量得以提高。特別是，由于在產(chǎn)生糖蛋白(如促紅細(xì)胞生成素和促血小板生成素)的宿主細(xì)胞中(在該宿主細(xì)胞中，人α-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因、CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因和誘導(dǎo)有點(diǎn)突變的GNE/MNK基因同時(shí)得到過(guò)表達(dá))，細(xì)胞中的胞內(nèi)CMP-唾液酸含量和糖蛋白中的唾液酸提高，因此，在產(chǎn)生唾液酸化重組糖蛋白的宿主細(xì)胞中，上述3種基因的過(guò)表達(dá)可用于制備唾液酸含量提高的糖蛋白。
文檔編號(hào)C12N15/54GK102482674SQ201180003414
公開(kāi)日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2011年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月8日
發(fā)明者孫榮德, 鄭然太, 金政會(huì), 黃真榮 申請(qǐng)人:韓國(guó)科學(xué)技術(shù)院