專利名稱：一種谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶真空干燥的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酶制劑的生產(chǎn)工藝，具體地涉及一種谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶真空干燥的制備方法，添加使谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶穩(wěn)定的耐熱、抗氧化保護(hù)劑，應(yīng)用真空干燥法來干燥微生物發(fā)酵液生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶。
背景技術(shù)：
谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶是一種催化酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的微生物酶，催化存在于肽鏈內(nèi)的谷氨酸Gln殘基Y-羧基酰胺基與賴氨酸Lys殘基ε-氨基發(fā)生交聯(lián)作用；在分子內(nèi)或分子間產(chǎn)生(Y- Glu)- Lys的架橋粘結(jié)作用，形成交聯(lián)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而改善蛋白質(zhì)功能性質(zhì)，其安全而超強(qiáng)的交聯(lián)特性，受到國內(nèi)外食品科技工作者廣泛關(guān)注，有“二十一世紀(jì)超級粘合劑”的美稱，經(jīng)常作為改良劑用于粘結(jié)肉，魚糜，面包中。谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶是以半胱氨酸為活性中心殘基的一種硫醇酶，抗氧化性差，高溫條件下易失活，不易保存。目前生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的方法主要是冷凍干燥，成本高，花費(fèi)大，不利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明提出一種提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶穩(wěn)定性的方法，通過加入糖醇類保護(hù)劑提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的熱穩(wěn)定性，通過加入活性肽提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的抗氧化穩(wěn)定性。這樣可以利用真空干燥過程來干燥微生物發(fā)酵液，解決了工業(yè)生產(chǎn)中只能用冷凍干燥生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的問題，提高了谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的穩(wěn)定性，節(jié)約了生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提出了一種谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶真空干燥的制備方法，向谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液中添加熱保護(hù)劑，室溫靜置，經(jīng)高速冷凍離心得到上清液，用95%乙醇對所述上清液進(jìn)行沉淀，經(jīng)高速冷凍離心得到沉淀物，加入抗氧化保護(hù)劑，經(jīng)混合均勻、真空干燥，得到谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶制劑；其中，所述熱保護(hù)劑為糖醇類物質(zhì)，包括山梨糖醇和麥牙糖醇，所述抗氧化保護(hù)劑包括活性肽。所述的發(fā)酵液中谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的酶活為l(T50u/ml。所述山梨糖醇的添加量為0. 59T5%w/v，優(yōu)選添加量為0. 5%^2%w/v ；所述麥牙糖醇的添加量為l°/TlO%w/v，優(yōu)選添加量為29T4%w/v。所述室溫靜置時(shí)間為0. 5h-lh0所述乙醇的添加量與上清液的體積比為0. 5:Γ . 5:1，優(yōu)選比例為0. 5:1。所述抗氧化保護(hù)劑優(yōu)選為小麥蛋白肽。所述抗氧化保護(hù)劑的添加量與沉淀物的質(zhì)量比為0.5:廣1:1. 5，優(yōu)選比例為 0.75:1。于35°C _40°C下進(jìn)行真空干燥，優(yōu)選時(shí)間為3h_5h。本發(fā)明中，采用兩次高速冷凍離心，第一次向發(fā)酵液加入熱保護(hù)劑后經(jīng)過高速冷凍離心取上清液得到發(fā)酵液上清液，經(jīng)過加入乙醇進(jìn)行沉淀后通過第二次高速冷凍離心獲得沉淀物，并加入抗氧化劑。本發(fā)明中，采用兩次高速冷凍離心達(dá)到了高度純化谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的技術(shù)效果。谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶通過催化蛋白質(zhì)多肽分子內(nèi)和分子間發(fā)生共價(jià)交聯(lián)，從而改善蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。但谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶自身的穩(wěn)定性差，不宜長期儲存，從而影響谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶在食品領(lǐng)域的應(yīng)用。因而本發(fā)明涉及一種應(yīng)用真空干燥法生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的工藝，向谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液中添加熱保護(hù)劑，室溫放置一段時(shí)間，選用95%乙醇對所述發(fā)酵液進(jìn)行沉淀，高速冷凍離心，棄上清，向得到的沉淀物中添加抗氧化保護(hù)劑，混合均勻，真空干燥，得到谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶制劑。本發(fā)明中，利用真空干燥代替冷凍干燥生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，解決了高溫對谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶穩(wěn)定性的影響。本發(fā)明中的熱保護(hù)劑糖醇類物質(zhì)是單糖分子的醛基或酮基被還原成醇基的化合物，使糖轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘣?，在熱環(huán)境下有較高的穩(wěn)定性，這是因?yàn)樘谴贾泻写罅苛u基，能夠改變?nèi)芤褐械鞍踪|(zhì)的水合結(jié)構(gòu)，促進(jìn)蛋白質(zhì)分子間的疏水相互作用，從而提高了蛋白質(zhì)受熱時(shí)的穩(wěn)定性。本發(fā)明中適用的糖醇類包括山梨糖醇、甘露糖醇、赤鮮糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、木糖醇等。不同的糖醇對蛋白質(zhì)的保護(hù)作用是有差異的，這可能是由于羥基基團(tuán)的數(shù)量和位置不同造成的。本發(fā)明提出糖醇中山梨糖醇和麥芽糖醇對蛋白質(zhì)的熱保護(hù)效果最為理想，其次是乳糖醇和木糖醇。本發(fā)明中采用活性肽作為抗氧化保護(hù)劑?；钚噪氖堑鞍踪|(zhì)中20個(gè)天然氨基酸以不同的組成和排列方式構(gòu)成的從二肽到復(fù)雜的線性、環(huán)狀結(jié)果不同肽的總稱，按照原料的類別劃分，本發(fā)明方法適用的活性肽包括小麥肽、大豆肽、玉米肽、卵白肽、絲蛋白肽和復(fù)合肽等。活性肽具有一定的營養(yǎng)作用和生理功能。谷氨酸殘基在蛋白質(zhì)中的存在形式是其酰胺形式的谷氨酰胺，谷氨酰胺是合成體內(nèi)極其重要的抗氧化劑一還原型谷胱甘肽的前體物質(zhì)，因而本發(fā)明采用活性肽作為抗氧化保護(hù)劑。本發(fā)明采用的小麥蛋白肽中谷氨酸含量是所有植物蛋白中含量最高的，約占蛋白總量的35%，因此，添加小麥蛋白肽能夠顯著提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶抗氧化能力。除小麥蛋白肽外，大部分蛋白肽也可提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的抗氧化能力，但效果不如小麥蛋白肽。與其他保護(hù)劑(如氨基酸類、單價(jià)鹽類等)對谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的作用相比，活性肽主要發(fā)揮的抗氧化作用最顯著，得到的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的質(zhì)量最多，在長期保存中，總酶活下降最少，且活性肽類成本較低，適合于廣泛應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)在于，在一般的生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶過程中，主要添加熱保護(hù)劑來穩(wěn)定谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，本發(fā)明中，向發(fā)酵液同時(shí)添加熱保護(hù)劑和抗氧化保護(hù)劑，抗氧化作用效果明顯，可顯著提高酶活，且以此法生產(chǎn)的酶穩(wěn)定性更好。本發(fā)明選用二次高速冷凍離心，得到的酶制劑較一次冷凍離心得到得酶制劑，純度更高。本發(fā)明的有益效果在于熱保護(hù)劑可以提高受熱時(shí)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的熱穩(wěn)定性；抗氧化保護(hù)劑如小麥蛋白肽中含有多種氨基酸，可以提高長期放置過程中酶的抗氧化性。本發(fā)明有效解決了谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶穩(wěn)定性差的問題，并極大降低了生產(chǎn)成本。將本發(fā)明制備的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶常溫放置，每隔一月進(jìn)行酶活測定。檢測結(jié)果顯示，依照本發(fā)明制備方法得到的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶具有良好酶穩(wěn)定性。


圖1所示為實(shí)施例1所制備的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶制劑的穩(wěn)定性隨時(shí)間變化的示意圖。圖2所示為實(shí)施例2所制備的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶制劑的穩(wěn)定性隨時(shí)間變化的示意圖。圖3所示為實(shí)施例3所制備的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶制劑的穩(wěn)定性隨時(shí)間變化的示意圖。圖4所示為實(shí)施例4所制備的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶制劑的穩(wěn)定性隨時(shí)間變化的示意圖。圖5所示為實(shí)施例5所制備的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶制劑的穩(wěn)定性隨時(shí)間變化的示意圖。圖6所示為實(shí)施例6所制備的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶制劑的穩(wěn)定性隨時(shí)間變化的示意圖。圖7所示為實(shí)施例7所制備的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶制劑的穩(wěn)定性隨時(shí)間變化的示意圖。
具體實(shí)施例方式結(jié)合以下具體實(shí)施例和附圖，對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容不局限于以下實(shí)施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點(diǎn)都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書為保護(hù)范圍。本發(fā)明谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶真空干燥的制備方法，包括以下步驟向谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液中添加熱保護(hù)劑，室溫靜置，經(jīng)高速冷凍離心得到上清液，用95%乙醇對上清液進(jìn)行沉淀，經(jīng)高速冷凍離心得到沉淀物，加入抗氧化保護(hù)劑，經(jīng)混合均勻、真空干燥，得到谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶制劑；其中，熱保護(hù)劑為糖醇類物質(zhì)，包括山梨糖醇和麥牙糖醇，抗氧化保護(hù)劑包括活性肽。其中，谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液中谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的酶活為l(T50u/ml。本發(fā)明中，山梨糖醇添加量為0. 59T5%w/v，優(yōu)選添加量為0. 59T2%w/v。麥芽糖醇添加量為1°/Tl0%w/V，優(yōu)選添加量為29T4%w/v。小麥蛋白肽添加量與的沉淀物質(zhì)量比優(yōu)選 0.75:1 (w/w)。本發(fā)明中，添加熱保護(hù)劑的發(fā)酵液經(jīng)高速冷凍離心，棄沉淀物，得到上清液。乙醇的用量與加入熱保護(hù)劑后發(fā)酵液經(jīng)高速冷凍離心得到的上清液的體積比為0. 5:1 (ν/ν)。發(fā)酵液加入熱保護(hù)劑后，室溫放置0-池，優(yōu)選放置時(shí)間為0. 5-lh。添加乙醇的發(fā)酵液經(jīng)高速冷凍離心、棄上清液后得到沉淀物，加入抗氧化保護(hù)劑。其中，真空干燥在35°C -45°C真空環(huán)境下進(jìn)行，優(yōu)選干燥時(shí)間為3- ！。本發(fā)明中熱保護(hù)劑為糖醇類物質(zhì)，包括麥芽糖醇、木糖醇、乳糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、赤蘚糖醇等。本發(fā)明中抗氧化保護(hù)劑為活性肽類，包括乳肽、小麥肽、大豆肽、玉米肽、 卵白肽、絲蛋白肽和復(fù)合肽等。實(shí)施例1
向茂原輪鏈絲菌(份腫mobaraense)所產(chǎn)生的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液IOOml中以0. 5:1的乙醇發(fā)酵液體積比添加乙醇對酶進(jìn)行沉淀，高速冷凍離心機(jī)設(shè)定 6000r/min、4°C、離心20min得到沉淀物，將沉淀物放入真空干燥箱中，40°C干燥池，得到谷
5氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶制劑。用自封袋封口，并定期測定酶活性。實(shí)施例2
向茂原輪鏈絲菌(份腫mobaraense)所產(chǎn)生的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液IOOml中加入l%(w/v)山梨糖醇，攪拌后室溫放置30min，以0. 5:1的乙醇發(fā)酵液的體積比添加乙醇對酶進(jìn)行沉淀，高速冷凍離心機(jī)設(shè)定6000r/min、4°C、離心20min得到沉淀物， 將沉淀物放入真空干燥箱中，40°C干燥池，得到谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶制劑。用自封袋封口，定期測定酶活性。實(shí)施例3
向茂原輪鏈絲菌(份腫mobaraense^所產(chǎn)生的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液IOOml中加入3%(w/v)麥芽糖醇，攪拌后室溫放置30min，以0. 5:1的乙醇發(fā)酵液的體積比添加乙醇對酶進(jìn)行沉淀，高速冷凍離心機(jī)設(shè)定6000r/min、4°C、離心20min得到沉淀物， 將沉淀物放入真空干燥箱中，40°C干燥池，得到谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶制劑。用自封袋封口，定期測定酶活性。實(shí)施例4
向茂原輪鏈絲菌(份腫mobaraense^所產(chǎn)生的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液IOOml中加入3%(w/v)麥芽糖醇、1%山梨糖醇，攪拌后室溫放置30min，以0. 5:1的乙醇發(fā)酵液的體積比添加乙醇對酶進(jìn)行沉淀，高速冷凍離心機(jī)設(shè)定6000r/min、4°C、離心 20min得到沉淀物，將沉淀物放入真空干燥箱中，40°C干燥池，得到谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶制劑。用自封袋封口，定期測定酶活性。實(shí)施例5
向茂原輪鏈絲菌(份腫mobaraense^所產(chǎn)生的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液IOOml中以0. 5:1的乙醇發(fā)酵液體積比添加乙醇對酶進(jìn)行沉淀，高速冷凍離心機(jī)設(shè)定 6000r/min、4°C、離心20min得到沉淀物，以小麥蛋白肽沉淀物為0. 75 1的質(zhì)量比添加小麥蛋白肽，混合均勻后放入真空干燥箱內(nèi)，干燥池，得到谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶制劑。用自封袋封口，定期測定酶活性。實(shí)施例6
向茂原輪鏈絲菌(份腫mobaraense^所產(chǎn)生的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液IOOml中加入1% (w/v)山梨糖醇，攪拌后室溫放置30min，以0. 5:1的乙醇發(fā)酵液的體積比添加乙醇對酶進(jìn)行沉淀，高速冷凍離心機(jī)設(shè)定6000r/min、4°C、離心20min，向得到的沉淀物中加入小麥蛋白肽，添加量與沉淀物的質(zhì)量比為0. 75 :1，放入真空干燥箱內(nèi)，干燥 3h，得到谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶制劑。用自封袋封口，定期測定酶活性。實(shí)施例7
向茂原輪鏈絲菌(份腫mobaraense^所產(chǎn)生的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液IOOml中加入1% (w/v)山梨糖醇和3% (w/v)麥芽糖醇，攪拌后室溫放置30min,以0. 5:1 的乙醇發(fā)酵液的體積比添加乙醇對酶進(jìn)行沉淀，高速冷凍離心機(jī)設(shè)定6000r/min、4°C、 離心20min，向得到的沉淀物中加入小麥蛋白肽，添加量與沉淀物的質(zhì)量比為0. 75 :1，放入真空干燥箱內(nèi)，干燥池，得到谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶制劑。用自封袋封口，定期測定酶活性。實(shí)施例8
通過標(biāo)準(zhǔn)氧肟酸鹽測定法對實(shí)施例1-7制備得到的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶制劑進(jìn)行酶活檢測，其步驟為分別取2ml試劑A液和試劑B液加入磨口試管中，37°C保溫15分鐘，加入 0. 2ml酶液，反應(yīng)10分鐘，加A液的試管加aiilB液終止反應(yīng)，加入B液的試管加入^iil A 液，過濾，以第二支試管反應(yīng)液作為空白對照，525nm處測定OD值。用L-谷氨酸1 -單氧肟酸做標(biāo)準(zhǔn)曲線。試劑A (反應(yīng)液)含0. 2 M Tris-HCl、0. IM鹽酸羥胺、0.01 M還原型谷胱甘肽、 0. 03 M Na-CBZ- Gln- Gly，pH 6.0。試劑B (終止液):以下三種成分按體積比1:1:1的比例混合。3 mol/L HCl、12 % 三氯乙酸(W/V)、5 %三氯化鐵(W/V)。實(shí)施例1制備的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶制劑酶活檢測結(jié)果如圖1所示，未添加任何保護(hù)劑的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，總酶活低，僅2098 (U)，且隨著時(shí)間的推移，總酶活下降較多，從 2098U降到1132U，下降幅度達(dá)50%以上，可見長期保存過程中，穩(wěn)定性較差。實(shí)施例2制備的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶制劑酶活檢測結(jié)果如圖2所示，與圖1比較，加入山梨糖醇后，得到的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的總酶活顯著高于未添加保護(hù)劑得到的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的總酶活。總酶活為2743U，提高700U，且隨著時(shí)間的推移，酶活下降很少，從2743U降到 2400U。實(shí)施例3制備的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶制劑酶活檢測結(jié)果如圖3所示，與圖1比較，加入麥芽糖醇后，得到的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的總酶活顯著高于未添加保護(hù)劑得到的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的總酶活，總酶活為2631U，且隨著時(shí)間的推移，酶活下降很少，從降到2389U。實(shí)施例4制備的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶制劑酶活檢測結(jié)果如圖4所示，與圖1比較，加入山梨糖醇和麥芽糖醇后，得到的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶總酶活顯著高于未添加保護(hù)劑得到的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的總酶活，也高于單獨(dú)添加山梨糖醇和麥芽糖醇(實(shí)施例2-3)得到的總酶活， 總酶活為3023U，隨著時(shí)間的推移，酶活下降少，從3023U降到^32U。實(shí)施例5制備的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶制劑酶活檢測結(jié)果如圖5所示，與圖1比較，加入小麥蛋白肽后，得到的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的總酶活顯著高于未添加保護(hù)劑得到的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的總酶活，總酶活達(dá)27MU，且隨著時(shí)間的推移，酶活下降很少，從2754U降到M71U。實(shí)施例6制備的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶制劑酶活檢測結(jié)果如圖6所示，與圖1比較，加入山梨糖醇和小麥蛋白肽后，得到的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的總酶活顯著高于未添加保護(hù)劑得到的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的總酶活，也高于通過實(shí)施例2-4得到的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的總酶活，總酶活為^80U，且隨著時(shí)間的推移，酶活下降很少，從降到^87U。實(shí)施例7制備的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶制劑酶活檢測結(jié)果如圖7所示，與實(shí)施例1-6 對照，依照本發(fā)明谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的制備方法，加入山梨糖醇、麥芽糖醇和小麥蛋白肽后， 得到的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的總酶活最高，總酶活為3543U，且隨時(shí)間推移酶活的下降幅度最小，從3543U降到3331U?？梢?，添加0. 5%_2% (w/v)的山梨糖醇、2%_4% (w/v)的麥芽糖醇及一定質(zhì)量的小麥蛋白肽可以提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的熱穩(wěn)定性和抗氧化性，在長期保存中發(fā)揮了作用。實(shí)施例9
本實(shí)施例中將乳糖醇和木糖醇作為熱保護(hù)劑，其余操作方法與實(shí)施例4基本相同。經(jīng)檢測，得到的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶總酶活高于未添加任何保護(hù)劑的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的總酶活， 但不如添加山梨糖醇和麥芽糖醇得到的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶得到的總酶活。因此，本發(fā)明提出將山梨糖醇和麥芽糖醇作為熱保護(hù)劑，其對蛋白質(zhì)熱保護(hù)的效果最為理想。
實(shí)施例10
本實(shí)施例中將大豆蛋白肽作為抗氧化保護(hù)劑，其余操作方法與實(shí)施例5基本相同。經(jīng)檢測，得到的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶高于未添加任何保護(hù)劑的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的總酶活，但不如添加小麥蛋白肽得到的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶得到的總酶活。因此，本發(fā)明提出將麥蛋白肽作為抗氧化保護(hù)劑，其對蛋白質(zhì)抗氧化保護(hù)的效果最為理想。
權(quán)利要求
1.一種谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶真空干燥的制備方法，其特征在于，所述方法包括向谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液中添加熱保護(hù)劑，室溫靜置，經(jīng)高速冷凍離心得到上清液，用95%乙醇對所述上清液進(jìn)行沉淀，經(jīng)高速冷凍離心得到沉淀物，加入抗氧化保護(hù)劑，經(jīng)混合均勻、真空干燥， 得到谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶制劑；其中，所述熱保護(hù)劑為糖醇類物質(zhì)，包括山梨糖醇和麥牙糖醇，所述抗氧化保護(hù)劑包括活性肽。
2 根據(jù)權(quán)利要求1所述的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶真空干燥的制備方法，其特征在于，所述的發(fā)酵液中谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的酶活為l(T50u/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶真空干燥的制備方法，其特征在于，所述山梨糖醇的添加量為0. 59T5%w/v，優(yōu)選添加量為0. 59T2%w/v ；所述麥牙糖醇的添加量為 1% 10%w/v，優(yōu)選添加量為2%"4%w/v0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶真空干燥的制備方法，其特征在于，所述室溫靜置時(shí)間為0. 5h-lh。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶真空干燥的制備方法，其特征在于，所述乙醇的添加量與上清液的體積比為0. 5:Γ1. 5:1，優(yōu)選比例為0. 5:1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶真空干燥的制備方法，其特征在于，所述抗氧化保護(hù)劑優(yōu)選為小麥蛋白肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶真空干燥的制備方法，其特征在于，所述抗氧化保護(hù)劑的添加量與沉淀物的質(zhì)量比為0. 5:Γ1:1. 5，優(yōu)選比例為0. 75:1。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶真空干燥的制備方法，其特征在于，于 350C -40°C下進(jìn)行真空干燥，優(yōu)選時(shí)間為!3h-5h。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶真空干燥的制備方法,包括向谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液中添加熱保護(hù)劑，室溫靜置，經(jīng)高速冷凍離心得到上清液，用95%乙醇對所述發(fā)酵液進(jìn)行沉淀，經(jīng)高速冷凍離心得到沉淀物，加入抗氧化保護(hù)劑，經(jīng)混合均勻、真空干燥，得到谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶制劑。本發(fā)明制備方法得到的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶穩(wěn)定性大幅提高。
文檔編號C12N9/10GK102533689SQ201110452678
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月30日
發(fā)明者吳琳琳, 孟珺, 常忠義, 張琳, 步國建, 湯丹, 郭穎, 韋妮, 高紅亮 申請人:上海東圣食品有限公司, 華東師范大學(xué)