專利名稱：檢測(cè)混合物中塞隆骨成分的方法及所用引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)混合物特別是藥材中塞隆骨成分的方法，具體地涉及檢測(cè)藥材、或者以塞隆骨或替代品入藥的中藥制劑中塞隆骨成分的方法，以及該方法中所用到的特異性引物。
背景技術(shù)：
塞隆，學(xué)名高原鼢鼠(Myospalax Baileyi)，哺乳動(dòng)物嚙齒目倉(cāng)鼠科，為青藏高原特有哺乳類害畜。塞隆干燥全骨骼，屬于國(guó)家級(jí)一類動(dòng)物新藥材，具有祛風(fēng)散寒除濕、通經(jīng)止痛、補(bǔ)益肝腎的功能，能夠有效替代豹骨，填補(bǔ)了禁止豹骨入藥后的中藥醫(yī)治空缺。但目前對(duì)于塞隆骨的鑒別主要采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法，依賴鑒別人員經(jīng)驗(yàn)，主觀性高，因此需要一種能夠準(zhǔn)確、有效的鑒別方法。另一方面，脊椎動(dòng)物線粒體基因組大小為161Λ左右，呈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞中呈多拷貝形式存在于線粒體中(依細(xì)胞類型不同而異)。動(dòng)物線粒體基因在進(jìn)化上保守，且遵循嚴(yán)格的母系遺傳特性，因此被廣泛用于起源進(jìn)化分析和物種鑒定。在含塞隆骨成分的混合物例如藥材、或者以塞隆骨入藥的中藥制劑等的生產(chǎn)加工過程中，塞隆骨中的部分DNA通常能夠保留于其中，因此，混合物中的塞隆骨成分可以從其攜帶的DNA檢測(cè)中獲得鑒定。然而，在混合物特別是藥材、中藥制劑中塞隆骨成分鑒定的研究技術(shù)上，由于混合物中塞隆骨DNA含量很低，并且含有多種抑制PCR反應(yīng)的成分，因此，如何能夠有效提取其中的DNA是分子生物學(xué)技術(shù)鑒定塞隆骨成分的一個(gè)關(guān)鍵；同時(shí)，含塞隆骨的混合物特別是中藥制劑中通常還具有較多的其它動(dòng)植物物種，如何設(shè)計(jì)塞隆物種特異性引物也成為鑒定技術(shù)的另一關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種利用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)混合物特別是藥材、中藥制劑中塞隆骨成分的方法，以準(zhǔn)確、有效地鑒別混合物中是否含有塞隆骨成分。本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)混合物特別是藥材、中藥制劑中塞隆骨成分的方法中的特異性引物。本發(fā)明的另一目的在于提供了一種用于分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)混合物特別是需要鑒別是否為塞隆骨的藥材、或者以塞隆骨或替代品入藥的中藥制劑中塞隆骨成分的試劑盒，其中包含本發(fā)明所述的引物。為達(dá)上述目的，一方面，本發(fā)明提供了一種利用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)混合物中塞隆骨成分的方法，該方法主要包括從待測(cè)混合物中提取總DNA ；以所提取的總DNA為模板，利用特異性引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)擴(kuò)增；
對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析判斷。如前所述，通常，含塞隆骨的混合物特別是藥材、或者以塞隆骨入藥的中藥制劑中，塞隆骨成分含量很低，并還含有較多的其它動(dòng)植物物種，還可能含有多種抑制PCR反應(yīng)的成分，在此情況下，設(shè)計(jì)塞隆物種特異性引物是本發(fā)明的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的關(guān)鍵之
ο根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本案發(fā)明人從塞隆骨中提取了總DNA，根據(jù)NCBI中公布的塞隆線粒體DNA與核DNA序列設(shè)計(jì)引物，經(jīng)擴(kuò)增、測(cè)序，提交blastn比對(duì)、分析等， 設(shè)計(jì)了本發(fā)明的塞隆物種特異性引物。所設(shè)計(jì)的塞隆物種特異性引物為選自如下SEQ ID Nos. 1和2(本發(fā)明中亦將該引物對(duì)命名為Z1F/R)、SEQ ID Nos. 3和4(本發(fā)明中亦將該引物對(duì)命名為Z2F/R)、以及SEQ ID Nos. 5和6 (本發(fā)明中亦將該引物對(duì)命名為Z4F/R)中的一對(duì)、兩對(duì)或三對(duì)引物Z1F/R 5' -CTAGGGGTCTGTTTAGG-3，(SEQ ID NO 1)5，-TGATTCATCCGTAGTTG-3，(SEQ ID NO 2)Z2F/R 5' -TTTGCCGAGACGTCAAC-3，(SEQ ID NO 3)5，-TTCCTCGGCCTACATGA-3，(SEQ ID NO 4)Z4F/R 5' -TGACCCAAACTAATAATTAC-3，(SEQ ID NO 5)5，-TACCTCAGGTGTACTAGGA-3，(SEQ ID NO :6)。如前所述，通常含塞隆骨的混合物特別是藥材、或者以塞隆骨入藥的中藥制劑中塞隆骨DNA成分的含量是很低的，如何能夠有效提取其中的DNA，是本發(fā)明檢測(cè)塞隆骨成分技術(shù)的另一個(gè)關(guān)鍵。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的方法中，所述從待測(cè)混合物中提取總DNA的過程包括以下步驟待測(cè)混合物經(jīng)煮沸法處理20 40分鐘；加入CTAB提取緩沖液60°C 70°C消化2 4小時(shí)；用酚仿法抽提；加入異丙醇沉淀富集DNA ；利用PCR純化試劑盒進(jìn)行純化，得到所提取的總DNA。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的上述方法特別適合于對(duì)以塞隆骨入藥的藥材混合物或中藥制劑中塞隆骨總DNA進(jìn)行提取，即使藥材混合物或中藥制劑中塞隆骨成分含量含量低至0. 5wt% (除特別注明外，本發(fā)明中所述含量與比例均為重量含量與比例)， 或是藥材或中藥制劑中含有其他多種動(dòng)植物成分(例如，同仁堂再造丸，含有五十八味藥； 等)，也能有效提取其中的DNA。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，上述從待測(cè)混合物中提取總 DNA的過程中所述煮沸法處理待測(cè)混合物樣品主要是破碎細(xì)胞，具體操作時(shí)可根據(jù)需要向待測(cè)混合物中加入適量的水(通常，每3 5g總固含量的待測(cè)樣品加IOml水)，煮沸通常是可以在常壓下進(jìn)行(100°C左右)，煮沸時(shí)間20 40分鐘，優(yōu)選30分鐘 40分鐘。所述向煮沸后的待測(cè)樣品中加入CTAB提取緩沖液進(jìn)行消化處理，主要是破壞混合物中的多糖多酚類物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選具體實(shí)施方案，所用CTAB提取緩沖液的組成為3% CTAB，IOOmM Tris-HCl pH8. 0,20mM EDTA pH8. 0,2. 5M NaCl。最優(yōu)選的消化處理?xiàng)l件為等體積混合，65 °C，3小時(shí)。
所述酚仿法抽提主要是去除混合物中蛋白質(zhì)、色素等溶于有機(jī)物的雜質(zhì)。酚仿法抽提的具體操作可以按照所屬領(lǐng)域的常規(guī)操作進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明中所述酚仿法抽提的操作為經(jīng)CTAB緩沖液消化后的樣品冷卻至室溫后加入等體積苯酚/ 氯仿/異戊醇05 24 1)，混勻，12000rpm離心20分鐘，取上清；再加入等體積氯仿/ 異戊醇(24 1)，混勻，12000rpm離心20分鐘，取上清。本發(fā)明中，向上述經(jīng)酚仿法抽提得到的上清中加入異丙醇主要是沉淀富集DNA。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，具體操作為加入等體積預(yù)冷的異丙醇，混勻，4°C 12000rpm離心20分鐘，棄上清，沉淀用75%酒精洗滌。為便于后續(xù)純化步驟，可將洗滌后的提取物用適量雙蒸水溶解。所述利用PCR純化試劑盒進(jìn)行純化的步驟主要是去除DNA中殘留的色素等水溶性雜質(zhì)。PCR純化試劑盒可以采用所屬領(lǐng)域常用的商購(gòu)產(chǎn)品，具體操作可以按照純化試劑盒的說明書進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，當(dāng)待測(cè)混合物中含有較多多糖類物質(zhì)時(shí)，在提取總 DNA的過程中，在經(jīng)酚仿法抽提得到的上清中，還可加入LiCl過夜處理，以去除殘留多糖類物質(zhì)，之后再加入異丙醇沉淀富集DNA。此外，對(duì)于利用PCR純化試劑盒所純化得到的總 DNA，還可進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取情況。在本發(fā)明的一具體實(shí)施方案中，所述的待測(cè)混合物為以塞隆骨或其替代品(例如豹骨或其他物種偽品)入藥的中藥制劑或混合藥材，其中除塞隆骨或其替代品外，還含有其他多種動(dòng)植物成分，例如，再造丸含有五十八味藥等；再如，塞隆風(fēng)濕膠囊中應(yīng)以塞隆骨入藥，但有些不法廠商會(huì)以其它物種偽品替代塞隆骨；本發(fā)明的方法是用于檢測(cè)該中藥制劑或混合藥材中是否是真正以塞隆骨入藥。在該具體實(shí)施方案中，為有效提取其中的總 DNA，是按照以下操作進(jìn)行將待測(cè)混合物樣品粉碎，加適量水(通常每3 5g總固含量的待測(cè)樣品加IOml水)，常壓煮沸30分鐘 40分鐘；向煮沸處理后的待測(cè)樣品中加入等體積 CTAB 提取緩沖液(3% CTAB，IOOmM Tris-HCl pH8. 0,20mM EDTA pH8. 0，2. 5MNaCl)，65°C 消化處理3小時(shí)；之后冷卻至室溫，加入等體積苯酚/氯仿/異戊醇05 24 1)，混勻， 12000rpm離心20分鐘，取上清；再加入等體積氯仿/異戊醇(24 1)，混勻，12000rpm離心20分鐘，取上清；加入1/4體積IOM LiCl，混合后4°C過夜；然后樣品在4°C 12000rpm離心30分鐘，取上清加入等體積預(yù)冷的異丙醇，混勻后4°C 12000rpm離心20分鐘，棄上清；用 75 %酒精洗滌沉淀三遍后取適量雙蒸水溶解，溶解的DNA經(jīng)PCR純化試劑盒純化，得到提取的總DNA(具體可采用康為世紀(jì)PCR產(chǎn)物純化試劑盒50T，貨號(hào)CW0521，在其說明書指導(dǎo)的操作基礎(chǔ)上，可適當(dāng)增加去雜質(zhì)緩沖液洗滌體積及次數(shù)，以達(dá)到更好的純化效果)。純化后的DNA可用0. 7%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取情況。按照本發(fā)明的該提取方法，即使待測(cè)混合物中塞隆骨成分含量低至0. 5%左右，也能有效提取其DNA，用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)混合物特別是藥材、 中藥制劑等中塞隆骨成分的方法中，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件如下反應(yīng)體系為15 μ 1，其中 10 XPCR緩沖液 1 5. 5 μ 1，dNTPs (2. 5mM) 0. 5 1. 8 μ 1， 上下游引物(10 μ Μ)各 0. 5 1. 5 μ 1，Taq DNA 聚合酶(5υ/μ 1)0. 2 1. 2 μ 1，DNA 模板 (50ng/y 1)0. 8 3μ 1，無菌超純水補(bǔ)至15μ 1 ；擴(kuò)增條件95°C預(yù)變性5min ；95°C變性30s，48 68°C退火30s，72°C延伸30s，共
535 40個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸7 lOmin。本發(fā)明中，是以所述的引物對(duì)分別以所提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，S卩，單重 PCR擴(kuò)增。所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件中，優(yōu)選的退火溫度為57°C 63°C。更優(yōu)選地，其中，所述引物對(duì)SEQ ID Nos. 1和2的最佳退火溫度為57°C，所述引物對(duì)SEQ ID Nos. 3和4的最佳退火溫度為63°C，所述引物對(duì)SEQ ID Nos. 5和6的最佳退火溫度為57°C。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)混合物特別是藥材、 中藥制劑中塞隆骨成分的方法中，所述對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析判斷主要是進(jìn)行定性分析，定性分析方法可以是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的，例如，該分析過程可包括用凝膠電泳顯示所述擴(kuò)增的產(chǎn)物，根據(jù)是否擴(kuò)增出目的片段，以定性檢測(cè)待測(cè)混合物中是否存在相應(yīng)的塞隆骨成分。本發(fā)明中，所述的待測(cè)混合物可以是指含有或可能含有塞隆骨成分的任何混合物，包括藥材、中藥制劑等。具體地，當(dāng)需要鑒別某一藥材是否為塞隆骨時(shí)，或者需要鑒別某一中藥制劑是以塞隆骨或是其他物種的替代品入藥時(shí)，本發(fā)明的檢測(cè)方法特別適用?？梢岳斫猓景l(fā)明的方法所適用的待測(cè)混合物中并不含有塞隆物種除塞隆骨外的其它組織成分，或者已通過其它方法排除含有塞隆的其它組織成分，即，本發(fā)明的方法是特別針對(duì)以塞隆骨入藥或以塞隆骨的替代品入藥的中藥制劑進(jìn)行檢測(cè)，判別其中是否含有塞隆骨成分。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)混合物特別是藥材、 中藥制劑中塞隆骨成分的方法還包括將待測(cè)混合物樣品的擴(kuò)增結(jié)果與從塞隆骨中提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果進(jìn)行對(duì)照，分析判斷所測(cè)混合物中是否存在塞隆骨成分。從塞隆骨中提取DNA的具體操作可以按照生物技術(shù)領(lǐng)域從單一物種中提取DNA的常規(guī)操作進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)混合物特別是藥材、 中藥制劑中塞隆骨成分的方法中，是以引物對(duì)SEQ ID Nos. 1和2、SEQ ID Nos. 3和4、以及 SEQ ID Nos. 5和6分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果擴(kuò)增出一個(gè)、二個(gè)或三個(gè)相應(yīng)的目的片段，則初步判斷所測(cè)混合物中存在塞隆骨成分。特別是以引物對(duì)SEQ ID Nos. 1和2、SEQ ID Nos. 3 和4、以及SEQ ID Nos. 5和6分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均能擴(kuò)增相應(yīng)的目的片段，則所測(cè)混合物中存在塞隆骨成分。另一方面，本發(fā)明還提供了用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所述檢測(cè)混合物中塞隆骨成分的方法的引物，該引物包括選自:SEQ ID Nos. 1和2、SEQ ID Nos. 3和4、以及SEQ ID Nos. 5和6 中的一對(duì)、兩對(duì)或三對(duì)引物。本發(fā)明的上述引物對(duì)，在檢測(cè)混合物特別是需要鑒別是否為塞隆骨的藥材、以塞隆骨或替代品入藥的中藥制劑中是否存在塞隆骨成分中具有應(yīng)用前景，能夠特異性檢測(cè)待測(cè)混合物中是否含有塞隆骨成分，并且，檢測(cè)靈敏度高，當(dāng)混合物中包含的塞隆骨成分含量為0.5% (質(zhì)量百分比)時(shí)，也能有效提取并特異性地檢測(cè)出來。另一方面，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)混合物中塞隆骨成分的試劑盒，該試劑盒中包含本發(fā)明所述的引物，優(yōu)選還可進(jìn)一步包括相應(yīng)的PCR緩沖液、dNIPs、DNA聚合酶等。具體地，其中所述的引物是本發(fā)明所述的引物對(duì)SEQ ID Nos. 1和2、SEQ ID Nos. 3和4、以及 SEQ ID Nos. 5和6中的一對(duì)、兩對(duì)或三對(duì)引物。有益效果
綜上所述，本發(fā)明從含塞隆骨成分的混合物中提取了總DNA，設(shè)計(jì)了塞隆物種特異性引物，分別以所述塞隆物種特異性引物PCR擴(kuò)增含有塞隆骨或偽品成分的混合物DNA。 本發(fā)明所設(shè)計(jì)的擴(kuò)增引物以及擴(kuò)增方法具有較高的特異性，且檢測(cè)靈敏度高，可單獨(dú)作為一種快速檢測(cè)方法應(yīng)用于對(duì)含有塞隆骨或偽品成分的混合物特別是藥材、中藥制劑進(jìn)行檢測(cè)，準(zhǔn)確地定性檢測(cè)混合物中塞隆骨成分的存在情況。


圖1顯示按照本發(fā)明實(shí)施例1的方法從不同藥材中提取總DNA的瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果。圖中，M為IOObp DNA Ladder，泳道1 山羊角粉，泳道2 羚羊角粉，泳道3 塞隆骨， 泳道4:豹骨。圖2顯示從一些半成品或成品中藥制劑中提取總DNA的瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果。其中，泳道1代表同仁堂再造丸半成藥(豹骨方)；泳道2代表同仁堂再造丸成藥(豹骨方)； 泳道3代表同仁堂再造丸半成藥(塞隆骨方)；泳道4代表同仁堂再造丸成藥(塞隆骨方)； 泳道5代表羚羊清肺丸半成藥(羚羊角方)；泳道6代表羚羊清肺丸成藥(羚羊角方)；泳道7代表羚羊清肺丸半成藥(山羊角方)；泳道8代表羚羊清肺丸成藥(山羊角方)；M為 DL2000。圖3顯示利用通用引物對(duì)SEQ ID Nos. 7和8 (12SF/R)以從塞隆骨中提取的DNA 為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果。圖中，上方序列是塞隆(Myospalax baileyi)序列， 下方序列是以金錢豹(Panthera pardus)序列做對(duì)照。圖4顯示利用通用引物對(duì)SEQ ID Nos. 9和10 (cytbF/R)以從豹骨中提取的DNA 為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果。圖中，上方序列是塞隆(Myospalax baileyi)序列， 下方序列是以金錢豹(Panthera pardus)序列做對(duì)照。圖5顯示依據(jù)塞隆物種特異分子標(biāo)記(SNP)特征設(shè)計(jì)用于塞隆物種檢測(cè)的特異引物結(jié)果。其中，上方序列為塞隆物種序列，下方序列為豹序列，方框內(nèi)所標(biāo)示部分為所設(shè)計(jì)的引物部分。圖6為用塞隆物種特異性引物PCR擴(kuò)增不同混合物樣品DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。其中，泳道1為再造丸(豹骨方)，泳道2為塞隆風(fēng)濕膠囊(豹骨方)，泳道3為再造丸(塞隆骨方)，泳道4為塞隆風(fēng)濕膠囊(塞隆骨方)，泳道5為豹骨藥材，泳道6為塞隆骨藥材，泳道7為空白對(duì)照。
具體實(shí)施例方式為了更清楚地理解本發(fā)明，現(xiàn)參照下列實(shí)施例及附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明。實(shí)施例僅用于解釋而不以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法為所屬領(lǐng)域熟知的常規(guī)方法和常規(guī)條件，或按照制造商所建議的條件；實(shí)施例中所用到的各種化學(xué)試劑均可商購(gòu)獲得，各試劑除標(biāo)注外，均購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司；所用引物委托hvitrogen公司合成。實(shí)施例1再造丸(塞隆方)中塞隆骨成分鑒定
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1、塞隆骨總DNA的提取該提取步驟可以按照所屬領(lǐng)域的常規(guī)操作進(jìn)行。本實(shí)施例的具體操作如下塞隆骨用研缽研磨成小塊，先經(jīng)EDTA脫鈣(10% EDTA溶液(pH7. 0) 48小時(shí)后方可用于DNA提取。樣品(脫鈣后塞隆骨，初始重)中加入Iml裂解液A(10mM Tris-HCl ρΗ8. 0， 0. IMEDTA pH8. 0,0. 5% SDS,200y g/ml 蛋白酶 K)，55°C消化過夜。消化樣品 12000rpm 離心 15min取上清進(jìn)行酚仿抽提。之后用2倍體積無水乙醇沉淀DNA，再用75%乙醇洗沉淀兩遍，適量50 μ 1雙蒸水溶解。樣品DNA經(jīng)PCR純化試劑盒(康為世紀(jì)PCR產(chǎn)物純化試劑盒 50Τ，貨號(hào)CW0521，具體操作按照說明書進(jìn)行)純化，得DNA提取樣品。經(jīng)0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果請(qǐng)參見圖1所示。另，按照上述方法以豹骨為原料提取得到DNA。此外還分別以山羊角、羚羊角為原料，按照傳統(tǒng)方法，均分別提取得到DNA。各原料所提取的DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)請(qǐng)參見圖1所示。2、再造丸(塞隆方)中總DNA的提取選用3批次(10丸/批次)同仁堂再造丸成藥(塞隆骨方)為待測(cè)樣品。每份樣品取所述再造丸(塞隆骨方)成藥(五十八味)4g(約1丸)，其中塞隆骨成分約占0.5% (質(zhì)量百分比)。將藥丸切碎，用IOml雙蒸水充分溶解后，100°C水浴30分鐘，冰浴10分鐘冷卻，4°C 12000rpm離心20分鐘，取上清；加入等體積(IOml) CTAB提取緩沖液(3% CTAB, IOOmM Tris-HCl pH8. 0,20mM EDTA ρΗ8·0，2·5Μ NaCl)，65°C水浴 3 小時(shí)；樣品冷卻至室溫后加入等體積苯酚/氯仿/異戊醇05 24 1)，緩慢顛倒混勻，12000rpm離心20分鐘， 取上清；加入等體積氯仿/異戊醇04 1)，緩慢顛倒混勻，12000rpm離心20分鐘，取上清；加入1/4體積IOM LiCl，緩慢顛倒混合后4°C過夜；樣品4°C 12000rpm離心30分鐘，取上清加入等體積預(yù)冷的異丙醇，緩慢混勻后4°C 12000rpm離心20分鐘，棄上清；用75%酒精洗滌沉淀三遍后取適量雙蒸水溶解。溶解的DNA經(jīng)PCR純化試劑盒(康為世紀(jì)PCR產(chǎn)物純化試劑盒50T，貨號(hào)CW0521，按照說明書的操作進(jìn)行，并增加去雜質(zhì)緩沖液洗滌體積至 350 μ 1、洗滌次數(shù)增為2次純化，得到純化的DNA。純化的DNA經(jīng)0. 7%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取情況，結(jié)果請(qǐng)參見圖2 (3批次共30例樣品提取結(jié)果電泳圖基本類似，圖中僅示意性給出其中一例情況)。另，分別以同仁堂再造丸半成藥(塞隆骨方)(3批次，10丸/批次，每丸為一例樣品，約4g)、再造丸半成藥(豹骨方)(3批次，10丸/批次，每丸為一例樣品，約4g)、再造丸成藥(豹骨方)(3批次，10丸/批次，每丸為一例樣品，約4g)、羚羊清肺丸成藥(山羊角方)(3批次，5丸/批次，每丸為一例樣品，約4g)、羚羊清肺丸半成藥(山羊角方)(3批次， 5丸/批次，每丸為一例樣品，約4g)、羚羊清肺丸成藥(羚羊角方)(3批次，5丸/批次，每丸為一例樣品，約4g)、羚羊清肺丸半成藥(羚羊角方)(3批次，5丸/批次，每丸為一例樣品，約4g)為待測(cè)樣品，按照上述方法，均分別提取得到了總DNA，各種待測(cè)樣品的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)請(qǐng)參見圖2所示(同樣的，由于每種樣品的多例提取結(jié)果電泳圖基本類似，圖中僅示意性給出其中一例情況)。本發(fā)明中，所述的“塞隆骨方”是指該中藥中確實(shí)是以塞隆骨入藥(例如，所述的再造丸(塞隆骨方)是指該再造丸中確實(shí)是以塞隆骨入藥)；所述的“豹骨方”是指與相應(yīng)的塞隆骨方的中藥相比，差異主要在于其中是以豹骨入藥而非以塞隆骨入藥，其它組分基本相同；所述再造丸中并不含除塞隆骨之外的其它塞隆組織成分；所述的“羚羊角方”是指該中藥中是以羚羊角入藥；所述的“山羊角方”是指與相應(yīng)的羚羊角方的中藥相比，差異主要在于其中是以山羊角入藥而非以羚羊角入藥，其它組分基本相同；所述羚羊清肺丸中并不含有塞隆或是豹組織成分。3、物種特異性引物及PCR反應(yīng)條件(1)塞隆特異性引物的設(shè)計(jì)根據(jù)NCBI上提供的塞隆線粒體基因組部分序列(CYTB :EF530744,12SrRNA AF387079)及相近物種(鼴鼠等)線粒體全序列(鼴鼠NC_005035、田鼠NC_008064、小鼠 NC_006915)，通過 DNAstar 在 12SrRNA、cytb 區(qū)域設(shè)計(jì)通用引物 12SF/R、cytbF/R。引物信息見表1所示，利用所述引物對(duì)SEQ ID Nos. 7和8、SEQ ID Nos. 9和10分別對(duì)前述“1、 塞隆骨總DNA的提取”過程中提取得到的純化的DNA為模版，進(jìn)行PCR擴(kuò)增(反應(yīng)體系為 15μ 1，其中 IOXPCR 緩沖液(商業(yè)化產(chǎn)品，內(nèi)含 Tris-HCl pH8. 5 lOOmM、KCl 500mM、 MgC1215mM) 1. 5 μ 1，dNTPs (2. 5mM) 1. 5 μ 1，上下游引物(10 μ Μ)各 0· 5 μ 1，Taq DNA 聚合酶 (5U/y 1)0. 3μ 1，DNA模板(50ng/μ 1) 1 μ 1，無菌超純水補(bǔ)至15 μ 1。擴(kuò)增條件:95°C預(yù)變性 5min ；95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s，40 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) DNA 測(cè)序(測(cè)序結(jié)果分別參見圖 3、圖 4 所示)，提交 blastn(http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)在線比對(duì)，分析，獲得塞隆物種特異分子標(biāo)記(SNP)，利用塞隆序列中存在的SNP，設(shè)計(jì)本發(fā)明的用于塞隆物種檢測(cè)的特異引物，引物設(shè)計(jì)結(jié)果參見圖5所示，其中，上方序列為塞隆序列，下方序列為豹序列，方框內(nèi)所標(biāo)示部分為所設(shè)計(jì)的引物部分。表1用于塞隆12SrRNA、Cytb區(qū)擴(kuò)增的引物信息
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)混合物中塞隆骨成分的方法，該方法主要包括 從待測(cè)混合物中提取總DNA ；以所提取的總DNA為模板，利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述特異性引物為選自SEQ ID Nos. 1和2、SEQ ID Nos. 3和4、以及SEQ ID Nos. 5和6中的一對(duì)、兩對(duì)或三對(duì)引物； 對(duì)上述擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析判斷。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述從待測(cè)混合物中提取總DNA的過程包括如下步驟待測(cè)混合物經(jīng)煮沸法處理20 40分鐘； 加入CTAB提取緩沖液60V 70°C消化2 4小時(shí)； 用酚仿法抽提； 加入異丙醇沉淀富集DNA;利用PCR純化試劑盒進(jìn)行純化，得到所提取的總DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件如下反應(yīng)體系為15 μ 1，其中10XPCR緩沖液1 5. 5 μ l,dNTPs (2. 5mM)0. 5 1. 8μ 1，上下游引物(10 μ Μ)各 0. 5 1. 5 μ l，Taq DNA 聚合酶(5U/μ 1)0. 2 1. 2 μ 1，DNA 模板(50ng/ μ 1)0. 8 3μ 1，無菌超純水補(bǔ)至15μ 1 ；擴(kuò)增條件95°C預(yù)變性5min ；95°C變性30s，48 68°C退火30s, 72°C延伸30s，35 40 個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸7 IOmin ；優(yōu)選地，所述SEQ ID Nos. 1和2的退火溫度為57°C，所述SEQ ID Nos. 3和4的退火溫度為57°C，所述SEQ ID Nos. 5和6的退火溫度為57°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述對(duì)上述擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析判斷的過程包括用凝膠電泳顯示所述擴(kuò)增的產(chǎn)物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述待測(cè)混合物為需要鑒別是否為塞隆骨的藥材、或者以塞隆骨或替代品入藥的中藥制劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，該方法還包括將待測(cè)混合物樣品的擴(kuò)增結(jié)果與從塞隆骨中提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果進(jìn)行對(duì)照， 分析判斷所測(cè)混合物中是否存在塞隆骨成分。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的方法，其中，以SEQID Nos. 1和2、SEQ ID Nos. 3和4、 以及SEQ ID Nos. 5和6分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出一個(gè)、二個(gè)或三個(gè)相應(yīng)的目的片段，則所測(cè)混合物中存在塞隆骨成分。
8.用于實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1 7任一項(xiàng)所述檢測(cè)混合物中塞隆骨成分的方法的引物，該引物包括選自SEQ ID Nos. 1和2、SEQ ID Nos. 3和4、以及SEQ ID Nos. 5和6中的一對(duì)、兩對(duì)或三對(duì)引物。
9.權(quán)利要求8所述的引物在檢測(cè)混合物中是否存在塞隆骨成分中的應(yīng)用；優(yōu)選地，所述待測(cè)混合物為需要鑒別是否為塞隆骨的藥材、或者以塞隆骨或替代品入藥的中藥制劑。
10.一種檢測(cè)混合物中塞隆骨成分的試劑盒，該試劑盒包含權(quán)利要求8所述的引物，優(yōu)選還進(jìn)一步包括PCR緩沖液、dNTPs和DNA聚合酶。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測(cè)混合物中塞隆骨成分的方法及所用引物，所述的方法主要包括從待測(cè)混合物中提取總DNA；以所提取的總DNA為模板，利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述特異性引物為選自SEQ ID Nos.1和2、SEQ ID Nos.3和4、以及SEQ ID Nos.5和6中的一對(duì)、兩對(duì)或三對(duì)引物；對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析判斷。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含上述引物的檢測(cè)混合物特別是需要鑒別是否為塞隆骨的藥材、或者以塞隆骨或替代品入藥的中藥制劑中塞隆骨成分的試劑盒。本發(fā)明的引物具有較高的特異性和靈敏性。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102424846SQ20111043965
公開日2012年4月25日 申請(qǐng)日期2011年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月23日
發(fā)明者劉名, 姚璐, 張曉蘭, 張薇, 曹夢(mèng), 杜菁, 王海, 解素花 申請(qǐng)人:北京中研同仁堂醫(yī)藥研發(fā)有限公司, 北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司, 北京同仁堂股份有限公司