專利名稱：誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞的方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為誘導(dǎo)干細(xì)胞分化的生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞的方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著人均壽命的延長(zhǎng)，人口老齡化問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重，中老年男性雄激素部分缺乏癥(PADAM)患者越來(lái)越多。目前臨床上主要采用了外源性雄激素替代療法(ART)，目的是維持血清中睪酮的生理濃度，以替代內(nèi)源性睪酮的生理功能。然而長(zhǎng)期服用雄激素副作用較大，其一體內(nèi)雄激素的靶細(xì)胞較多，長(zhǎng)期服用外源雄激素治療容易會(huì)有毒副作用的發(fā)生，尤其是前列腺；其二不同個(gè)體間血清睪酮水平差異較大，病人需頻繁抽血檢查相關(guān)指標(biāo)以調(diào)整用量；其三睪酮替代治療會(huì)破壞人體雄激素分泌晨高夜低的自然節(jié)律，還會(huì)抑制自身睪丸的雄激素分泌和生精功能。近年來(lái)隨著細(xì)胞移植療法的發(fā)展，人們把目光轉(zhuǎn)向了采用睪丸間質(zhì)細(xì)胞(Leydig cells)的移植。由于睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌的睪酮約占血漿睪酮的95%，人們?cè)噲D通過(guò)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的移植來(lái)治療睪酮分泌不足的問(wèn)題，睪丸間質(zhì)細(xì)胞移植可以升高患者血清睪酮水平。采用將分離提純的睪丸間質(zhì)細(xì)胞微囊化的方法，既可以防止宿主對(duì)植入睪丸間質(zhì)細(xì)胞的免疫排異反應(yīng)，又保證微膠囊內(nèi)睪丸間質(zhì)細(xì)胞成活和睪酮分泌，微囊化后睪丸間質(zhì)細(xì)胞能對(duì)人絨毛膜促性腺激素有良好的反應(yīng)性，術(shù)后能在一定時(shí)間內(nèi)保持患者血清睪酮水平。 以上研究說(shuō)明睪丸間質(zhì)細(xì)胞移植可能是一種有效的治療男性雄激素部分缺乏癥的方法，但目前尚無(wú)法解決移植細(xì)胞來(lái)源的問(wèn)題。間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化能力，在一定的條件下，間充質(zhì)干細(xì)胞能夠被誘導(dǎo)分化為多種細(xì)胞，包括成骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，脂肪細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞和肝細(xì)胞等。向骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中轉(zhuǎn)入類固醇生成因子-1 (SF-I)基因，能產(chǎn)生具有合成性腺激素和腎上腺類型類固醇激素能力的細(xì)胞。但骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外增殖能力、多向分化能力以及細(xì)胞穩(wěn)定性都會(huì)隨著骨髓供體的年齡增長(zhǎng)或疾病的影響逐漸不同程度的減弱甚至喪失；并且，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化效率較低，分泌的性腺激素量較低，需要尋找其他來(lái)源的干細(xì)胞和有效的誘導(dǎo)分化方法，可以更高效地將干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種有效地誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞的方法。本發(fā)明的另一目的在于提供所述誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞方法的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞的方法，包含以下步驟
(1)將SF-I基因(NM 139051，核苷酸序列171-1828，如SEQ ID NO. 1所示)插入腺病毒的穿梭質(zhì)粒pAdtrack-CMV-EGFP的多克隆位點(diǎn)中，得到重組載體pAdtrack-CMV-SF-Ι ； 然后將重組載體pAdtrack-CMV-SF-Ι與腺病毒載體質(zhì)粒pAdEasy-Ι共轉(zhuǎn)染大腸桿菌 BJ5183，得到攜帶SF-I基因的腺病毒質(zhì)粒pAd-SF-Ι ；將腺病毒質(zhì)粒pAd-SF-Ι單酶切線性化，轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞AD-293后得到腺病毒。(2)采用MOI = 200的量，將步驟(1)制備得到的腺病毒加入到誘導(dǎo)培養(yǎng)液中感染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞；誘導(dǎo)培養(yǎng)液的組成為基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM/F12，含有體積百分比10%胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素、 100 μ g/ml鏈霉素、500 μ M 二丁酰環(huán)磷酸腺苷(dbcAMP)。步驟(1)中所述的腺病毒質(zhì)粒pAd-SF-Ι單酶切線性化是采用I^c I酶切進(jìn)行線性化；步驟(1)中所述的轉(zhuǎn)染采用磷酸鈣共沉淀法進(jìn)行；步驟O)中所述的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)如下方法制備得到從正常的足月新生兒的人臍帶中分離得到沃頓膠組織(Wharton’ s jelly)，將沃頓膠組織剪碎，用培養(yǎng)液培養(yǎng)，待從組織塊游離出來(lái)的細(xì)胞長(zhǎng)至80 90%融合時(shí)，用胰酶消化游離出來(lái)的細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)，得到人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；其中培養(yǎng)液為含有體積百分比10%的胎牛血清，5ng/ml的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，2mM L-谷氨酰胺，216 μ g/ml NaHCO3,100U/ml青霉素，100 μ g/ml鏈霉素和1 μ g/ml兩性霉素B的LG-DMEM培養(yǎng)液。所述的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原分子可用FACScan流式細(xì)胞儀檢測(cè)， 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞不表達(dá)造血標(biāo)志分子⑶14、⑶19、⑶34、⑶45和HLA-DR，而強(qiáng)表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面特異性抗原⑶44、⑶73、⑶90和⑶105 ；流式細(xì)胞的鑒定條件為細(xì)胞的密度不低于 IO6 細(xì)胞/ml，采用 mouse anti IgGl/PE，mouse anti IgGl/FITC 作為同型對(duì)照；采用成脂分化、成骨分化和成軟骨分化鑒定干細(xì)胞的分化能力，成脂分化用油紅染色鑒定，成骨分化用堿性磷酸酶(ALP)染色及Von kossa染色鑒定，成軟骨分化用亞甲基藍(lán)染色鑒定。步驟O)中所述的誘導(dǎo)分化的條件采用胰酶將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞消化，離心收集，按5 X IO5個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種到6孔板，在培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜讓細(xì)胞貼壁后，更換為誘導(dǎo)培養(yǎng)液，以MOI = 200的量將腺病毒加入到誘導(dǎo)培養(yǎng)液中，輕搖動(dòng)培養(yǎng)板使病毒分布均勻，然后每?jī)商旄鼡Q新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)液，誘導(dǎo)分化的時(shí)間為7天。上述的方法應(yīng)用于誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞。一種睪丸間質(zhì)細(xì)胞，通過(guò)上述方法得到。一種睪酮，通過(guò)上述睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌得到。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果(1)人臍帶沃頓膠組織(Wharton's jelly)來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞取自免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完善胎兒的臍帶，具有增殖效率高，免疫原性低，在無(wú)免疫抑制的情況下不會(huì)出現(xiàn)免疫排斥。而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外增殖能力、多向分化能力以及細(xì)胞穩(wěn)定性都會(huì)隨著骨髓供體年衰或疾病的影響，逐漸不同程度的減弱甚至喪失。臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞比骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞更容易獲得，而且增殖能力更強(qiáng)，因此臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可以成為干細(xì)胞治療中細(xì)胞移植的良好的細(xì)胞來(lái)源。(2)本發(fā)明所述的方法利用攜帶SF-I基因的腺病毒感染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，并在DMEM-F12培養(yǎng)液中添加dbcAMP，整個(gè)分化時(shí)間短，僅需一周即可獲得睪丸間質(zhì)細(xì)胞，具有更高的分化效率，能夠獲得更強(qiáng)睪酮分泌能力的睪丸間質(zhì)細(xì)胞。本發(fā)明是一種高效地將間充質(zhì)干細(xì)胞分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞的方法，可為治療男性雄激素部分缺乏癥提供穩(wěn)定的移植細(xì)胞的來(lái)源。


圖1是人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞原代與培養(yǎng)5代圖；圖(a)為原代細(xì)胞，圖(b)為培養(yǎng)5代的細(xì)胞，觀察倍數(shù)均為100倍。圖2是人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)鑒定圖。圖3是ALP染色鑒定人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化能力圖；圖(a)為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過(guò)觀天成骨誘導(dǎo)分化后的堿性磷酸酶(ALP)染色圖，圖(b)為未分化的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞作為陰性對(duì)照。圖4是Von Kossa染色鑒定人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化能力圖；圖(a)為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過(guò)觀天成骨誘導(dǎo)分化后的Von kossa染色圖，圖 (b)為未分化的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞作為陰性對(duì)照。圖5是油紅染色鑒定人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂分化能力圖；圖(a)為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過(guò)21天成脂誘導(dǎo)分化后的油紅染色圖，圖(b)為未分化的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞作為陰性對(duì)照。圖6是亞甲基藍(lán)染色鑒定人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的軟骨分化能力圖；圖(a)為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過(guò)21天軟骨誘導(dǎo)分化后的亞甲基藍(lán)染色圖，圖 (b)為未分化的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞作為陰性對(duì)照。圖 7 是 PAdiTrack-CMV-EGFP 質(zhì)粒圖。圖 8 是 pAdTrack-CMV-SF-Ι 質(zhì)粒圖。圖 9 是 pAdEasy-Ι 質(zhì)粒圖。圖10是攜帶SF-I基因的腺病毒的制備過(guò)程檢測(cè)圖；圖(a)為從小鼠睪丸間質(zhì)瘤細(xì)胞中拷貝SF-I基因的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中泳道1為回收的SF-I基因的PCR產(chǎn)物，泳道M為200bp DNA marker分子量標(biāo)準(zhǔn)；圖(b)為pAdtrack-CMV-SF-Ι陽(yáng)性克隆篩選圖，泳道1 8為挑取的8個(gè)單克隆中所提取的質(zhì)粒，泳道M為11Λ DNA marker分子量標(biāo)準(zhǔn)；圖(c)為采用EcoR I酶切驗(yàn)證圖，泳道1 6分別為圖(b)中的1、2、4、5、7、8號(hào)質(zhì)粒的EcoR I單酶切后產(chǎn)物，泳道M為11Λ DNA marker分子量標(biāo)準(zhǔn)；圖(d)為采用電穿孔法將pAdtrack-CMV-SF-Ι與pAdEasy-Ι共轉(zhuǎn)染大腸桿菌 BJ5183后的克隆篩選圖泳道1 4為所提取的質(zhì)粒，泳道M為11Λ DNAmarker分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖11是采用Real-time RT-PCR方法檢測(cè)將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞的基因表達(dá)的圖。圖12是采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞的睪酮分泌圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例1人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與擴(kuò)增采用組織塊貼壁分離法。在無(wú)菌條件下取得臍帶，采用體積百分比0. 25%碘伏浸泡臍帶:3min消毒，采用生理鹽水沖洗除去臍帶表面及血管內(nèi)的血塊，剪開(kāi)臍帶，用鑷子撕下血管壁周圍的沃頓膠組織(Wharton's jelly)，將其剪成1. 5_2. 5mm3大小的組織塊，置于 24孔板內(nèi)，加入800ml培養(yǎng)液(培養(yǎng)液含有體積百分比10%的胎牛血清，5ng/ml的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，2mM L-谷氨酰胺，216 μ g/ml NaHCO3,100U/ml青霉素，100 μ g/ml鏈霉素和1 μ g/ml兩性霉素B的LG-DMEM培養(yǎng)液)，放于培養(yǎng)箱，37°C,5% CO2條件下靜置培養(yǎng)。 12-15天后，鏡檢可看見(jiàn)從貼壁的組織塊周圍游離出的大量長(zhǎng)梭形細(xì)胞，這時(shí)可用PBS溶液 (貨號(hào)14190-144，GIBCO公司，以下所用PBS同)清洗去除組織塊，采用質(zhì)量體積比0. 25% 的胰蛋白酶溶液消化貼壁細(xì)胞，200g離心收集細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。等貼壁細(xì)胞長(zhǎng)至90% 融合后，去除培養(yǎng)液，采用PBS溶液清洗，采用質(zhì)量體積比0. 25%胰蛋白酶溶液消化，鏡檢等貼壁細(xì)胞收縮，胞間間隙變大時(shí)，加入含體積百分比10% FBS的LG-DMEM終止消化，輕輕吹打讓細(xì)胞懸浮，200g離心收集細(xì)胞，采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1 X IO5個(gè)細(xì)胞 /孔(6孔板)，放置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每?jī)商旄鼡Q培養(yǎng)液。實(shí)施例2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察將臍帶華爾通膠質(zhì)組織塊接種至M孔板培養(yǎng)10天后，逐漸可見(jiàn)到少量細(xì)胞從組織塊中游離出來(lái)，貼壁生長(zhǎng)，并不斷增殖(圖la)。在顯微鏡下觀察，可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)均一的長(zhǎng)梭形，為典型的成纖維細(xì)胞的形態(tài)，成平行排列生長(zhǎng)或漩渦狀生長(zhǎng)，隨著集落生長(zhǎng)的不斷擴(kuò)大而融合為單層貼壁細(xì)胞。常規(guī)傳代培養(yǎng)，長(zhǎng)滿后可見(jiàn)細(xì)胞呈現(xiàn)漩渦狀(圖lb)。實(shí)施例3流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面抗原取正常培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面抗原的表達(dá)，包括 CD105、CD73、CD90、CD45、CD34、CD14、CD19 和 HLA-DR。(1)細(xì)胞長(zhǎng)至80 90%融合后，采用質(zhì)量體積比0. 25%胰蛋白酶溶液消化，離心收集細(xì)胞，PBS溶液清洗2次，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度到IO6細(xì)胞/ml。(2)加入2ml含體積百分比為2. 5% FBS的PBS溶液，吸打混勻細(xì)胞，200g離心。(3)所用抗體包括 CD105、CD73、CD90、CD45、CD34、CD14、CD19 和 HLA-DR 的抗體， 非特異性背景以mouse anti IgGl/PE，mouse anti IgGl/FITC進(jìn)行孵育作為對(duì)照。均按體積百分比1 50比例，用PBS溶液將抗體稀釋后，冰上避光孵育40min。(4)孵育完成后，離心去上清，PBS溶液重懸洗去抗體，重復(fù)1次。(5)最后用500 μ 1 PBS溶液重懸細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的熒光值。利用流式細(xì)胞術(shù)分析臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原的表達(dá)，在分離獲得的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中，⑶44、⑶73、⑶90、⑶105的表達(dá)為陽(yáng)性，而⑶14、⑶19、⑶34、CD45及 HLA-DR的表達(dá)基本上為陰性(圖2)。這些表面抗原的表達(dá)結(jié)果與典型的間充質(zhì)干細(xì)胞的表面抗原的表達(dá)是一致的。實(shí)施例4人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞多向分化能力鑒定(1)檢測(cè)方法CN 102533659 A
取實(shí)施例1制備的傳代培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，按2X IO4細(xì)胞/孔的密度接種到M孔板內(nèi)，等細(xì)胞長(zhǎng)至60 70 %融合后，去除原來(lái)培養(yǎng)液，用PBS溶液清洗，加入成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)液(基礎(chǔ)培養(yǎng)基為L(zhǎng)G-DMEM，含體積百分比10% FBS, 0. 216g/L NaHCO3,100U/ml 青霉素，100 μ g/ml鏈霉素，IOOnM地塞米松，IOmMβ -甘油磷酸鈉，0. 2mM L-抗壞血酸鹽)， 以后每3天更換一次成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)液。誘導(dǎo)28天后，進(jìn)行von-Kossa染色和堿性磷酸酶染色(ALP staining)的成骨分化鑒定。取實(shí)施例1制備的傳代的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，按2X IO4細(xì)胞/孔的密度接種到 24孔板內(nèi)，細(xì)胞長(zhǎng)至60 70%融合后，去除原來(lái)培養(yǎng)液，PBS清洗，加入成脂分化誘導(dǎo)培養(yǎng)液(基礎(chǔ)培養(yǎng)基為L(zhǎng)G-DMEM，含體積百分比10% FBS，2mML_谷氨酰胺，100U/ml青霉素， 100 μ g/ml鏈霉素，60μ M茚甲新，1 μ M地塞米松，0. 5mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤IBMX， 5 μ g/ml胰島素)，以后每3天更換培養(yǎng)液一次，誘導(dǎo)21天后，進(jìn)行Oil Red 0染色檢測(cè)。取實(shí)施例1制備的傳代的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，轉(zhuǎn)移Iml細(xì)胞懸液于15ml塑料離心管中，500g離心15分鐘，使其形成細(xì)胞微團(tuán)結(jié)構(gòu)，小心吸掉上層培養(yǎng)液， 加入2ml軟骨分化培養(yǎng)液(基礎(chǔ)培養(yǎng)基為L(zhǎng)G-DMEM，含體積百分比10% FBS, 2mM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100 μ g/ml鏈霉素，質(zhì)量體積比1 %胰島素鐵硒傳遞蛋白(ITS)，0. 1 μ M 地塞米松，50 μ g/mL 2-磷酸抗壞血酸，40 μ g/mL L-脯氨酸，100 μ g/mL丙酮酸鈉，10ng/mL 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 1)，4天后首次換液，以后每隔2天換液，在21天后取出培養(yǎng)的細(xì)胞團(tuán)塊。 進(jìn)行固定、包埋、切片。將切片進(jìn)行亞甲基藍(lán)染色，顯微鏡下觀察并拍照。(2)檢測(cè)結(jié)果間充質(zhì)干細(xì)胞的一個(gè)重要的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，就是間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化的能力。 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)液中誘導(dǎo)觀天以后，通過(guò)von Kossa染色以及堿性磷酸酶(ALP)染色對(duì)分化的細(xì)胞進(jìn)行成骨分化鑒定。圖3(a)中的棕紅色顯色顯示ALP 的染色結(jié)果，可見(jiàn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)分化后，胞質(zhì)中呈現(xiàn)了堿性磷酸酶活性。圖 4(a)中的黑色顆粒狀小結(jié)是礦質(zhì)沉淀經(jīng)Von Kossa染色的結(jié)果。而對(duì)照組則均呈陰性(圖 3(b)與圖 4(b))。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)成脂分化誘導(dǎo)培養(yǎng)液的誘導(dǎo)21天后，采用Oil Red O染色檢測(cè)脂滴。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過(guò)成脂誘導(dǎo)后，分化的細(xì)胞中出現(xiàn)細(xì)小的脂滴，呈現(xiàn)明顯的陽(yáng)性(圖5(a))，而在未分化的細(xì)胞內(nèi)，染色未見(jiàn)脂滴的存在(圖5(b))。在軟骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)培養(yǎng)液中培養(yǎng)的細(xì)胞團(tuán)約2天時(shí)與管壁分離形成球形結(jié)構(gòu)， 并在培養(yǎng)過(guò)程中逐漸長(zhǎng)大。培養(yǎng)21天后進(jìn)行切片和亞甲基藍(lán)染色觀察，可見(jiàn)經(jīng)誘導(dǎo)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞呈現(xiàn)均一異染，細(xì)胞外基質(zhì)呈淡藍(lán)色(圖6(a))，說(shuō)明經(jīng)誘導(dǎo)后細(xì)胞分泌的基質(zhì)中含有大量的酸性蛋白多糖，而對(duì)照組未著色(圖6(b))。實(shí)施例5攜帶SF-I基因腺病毒的制備從小鼠睪丸間質(zhì)瘤細(xì)胞(MLTC-1，中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所，上海，中國(guó))中提取總 mRNA,通過(guò)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，用I^rimerSTAR高保真DNA聚合酶擴(kuò)增SF-I基因(98°C，IOs ； 580C，20s ；72°C，1. 5min,反應(yīng)30個(gè)循環(huán))，回收SF-1的PCR產(chǎn)物，并將其磷酸化。擴(kuò)增SF-1 基因的引物根據(jù)基因庫(kù)號(hào)NM 139051的序列設(shè)計(jì)如下正向PCR 引物5，-ATTCTCCTTCCGTTCAGCGGACG-3，；反向PCR 引物5，-GGCTGATGGAGGAAGGAATGGT-3，。
將擴(kuò)增得到的SF-1基因插入腺病毒的穿梭質(zhì)粒pAdtrack-CMV-EGFP內(nèi)(見(jiàn)圖7，Stratagene公司，加利福尼亞州，美國(guó))，具體步驟如下首先用內(nèi)切酶MlI消化 pAdtrack-CMV-EGFP載體，然后將線性化的載體末端補(bǔ)平并去磷酸化。將制備好的SF-I片段和pAdtrack-CMV-EGFP載體按照3 1的比例進(jìn)行連接構(gòu)建pAdtrack-CMV-SF-Ι質(zhì)粒 (見(jiàn)圖8)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌toplO (Tiangen公司，北京，中國(guó))，并挑取單克隆。由于 SF-I片段和載體內(nèi)各有一個(gè)EcoR I酶切位點(diǎn)，用EcoR I消化單克隆，正向連接的質(zhì)粒將被切成2. 8kb和8. Okb的DNA片段，反向連接的產(chǎn)物將被切成7. Ikb和3. 3kb的DNA片段，從而可以通過(guò)EcoR I酶切篩選得到陽(yáng)性克隆，再通過(guò)測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。將構(gòu)建好的攜帶SF-I基因的穿梭質(zhì)粒pAdtrack-CMV-SF-Ι與腺病毒載體質(zhì)粒pAdEasy-Ι (見(jiàn)圖9，Stratagene公司，加利福尼亞州，美國(guó))共轉(zhuǎn)染大腸桿菌 BJ5183 (Genmed公司，上海，中國(guó))，兩質(zhì)粒在BJ5183細(xì)菌內(nèi)會(huì)發(fā)生重組，從而得到攜帶SF-I 基因的腺病毒質(zhì)粒pAd-sf-1。將得到的攜帶SF-I基因的腺病毒質(zhì)粒pAd-SF-Ι用I^c I酶切線性化后，采用磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞(AD-293細(xì)胞，NIH，MD，美國(guó))，可以產(chǎn)生腺病毒，腺病毒的產(chǎn)生可根據(jù)EGFP的綠色熒光來(lái)確定。當(dāng)表達(dá)綠色熒光的AD-293細(xì)胞越來(lái)越多，并出現(xiàn)細(xì)胞變圓，核變大，細(xì)胞脫板懸浮的情況下，吸打收集AD-293細(xì)胞，PBS溶液清洗，離心，只保留 200 μ 1 PBS, -80°C和37°C反復(fù)凍融三次，使細(xì)胞破壁，釋放腺病毒，IOOOOg離心10分鐘，上清液含制備的第一代腺病毒。將得到的腺病毒直接用于感染AD-293細(xì)胞，進(jìn)行再一輪的擴(kuò)增，以提高腺病毒的滴度。將AD-293細(xì)胞按2 X IO4細(xì)胞/孔的密度接種到M孔板內(nèi)，待細(xì)胞長(zhǎng)至50%融合后，更換新鮮高糖培養(yǎng)液(培養(yǎng)液成分為10% (ν/ν)胎牛血清(FBQ，2mML-谷氨酰胺， 216 μ g/ml NaHCO3,100U/ml青霉素和100 μ g/ml鏈霉素的HG-DMEM培養(yǎng)液)，將需要測(cè)定滴度的腺病毒懸液從KT1到10_12，按10倍的梯度進(jìn)行稀釋，然后每個(gè)梯度取50 μ 1加到培養(yǎng)液中進(jìn)行感染，每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。M小時(shí)后熒光顯微鏡下檢查綠色熒光的表達(dá)情況。如果在10_7梯度的孔中計(jì)數(shù)得到綠色細(xì)胞為50個(gè)，則病毒的滴度計(jì)為101(l(PFU/ml)。研究結(jié)果從小鼠睪丸間質(zhì)瘤細(xì)胞中提取總mRNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，采用PCR 擴(kuò)增SF-I基因，回收PCR產(chǎn)物(如圖10(a)所示)，跑膠結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物符合目標(biāo)基因大小。將制備好的SF-I片段和pAdtrack-CMV-EGFP載體按照一定的比例進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化toplO細(xì)菌，并挑取8個(gè)單克隆(如圖10 (b)所示)。用EcoR I酶切消化驗(yàn)證連接產(chǎn)物(如圖10 (c)所示)，正向連接的質(zhì)粒將被切成2. Skb和8. Okb的DNA片段，反向連接的產(chǎn)物將被切成7. Ikb和3. 3kb的DNA片段。從酶切結(jié)果可以判斷7號(hào)克隆為正向連接， 將7號(hào)克隆測(cè)序后發(fā)現(xiàn)該克隆DNA序列正確。將得到的pAdtrack-CMV-SF-Ι與pAdEasy-1 質(zhì)粒采用電穿孔法共轉(zhuǎn)染BJ5183，挑選重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒大小約為44Kb (如圖10 (d)所示)，挑選2號(hào)質(zhì)粒進(jìn)行酶切轉(zhuǎn)化AD-293細(xì)胞，以產(chǎn)生攜帶SF-I基因的腺病毒。實(shí)施例6采用攜帶SF-I基因的腺病毒感染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞采用常規(guī)培養(yǎng)的實(shí)施例1制備得到的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，酶消化，離心收集，按 5 X IO5的密度接種到6孔板內(nèi)，在培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜讓細(xì)胞貼壁。第二天早上，更換為誘導(dǎo)培養(yǎng)液(基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM/F12，含體積百分10%的FBS，100U/ml青霉素，100 μ g/ml鏈霉素，500 μ M dbcAMP)，以MOI = 200的量將腺病毒加入到培養(yǎng)液中，輕搖動(dòng)培養(yǎng)板使病毒分布均勻。以后每?jī)商旄鼡Q新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)液，誘導(dǎo)分化7天。
實(shí)施例7鑒定誘導(dǎo)分化的細(xì)胞的基因表達(dá)
采用攜帶SF-I基因的腺病毒感染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞后的第7天，用Real-time RT-PCR檢測(cè)類固醇合成相關(guān)基因的表達(dá)，包括P450SCC，17 β -HSD, LHR和3 β -HSD，引物及熒光探針如下
P450SCC-F 5' -GCGGGCTCCGGAAATTACTC-3’
P450SCC-R 5' -CTGGTAGATGGCATCAATGAATCG-3，
P450SCC-P 5' -(FAM)AGTGATGACCTGTTCCGCTTTGCCT(Eclipse)-3'
17 β -HSD-F 5，-TTAGTCAACAATGTCGGAATGCTTC-3，
17 β -HSD-R 5’ -ACTACGGAGGTGATGTTACAATGG-3 ’
17 β -HSD-P :5，-(FAM)CCCAAGCCATTTCCTGAACGCACCG(Eclipse)-3，
LHR-F :5，-CAATGTGAAAGCACAGTAAGGAAAG-3‘
LHR-R :5，-GGTGTCTTGGGTAAGCAGAAAC-3，
LHR-P :5，-(FAM)CCAGCCACTCAGTTCACTCTCAGCA(Eclipse)-3，
3 β -HSD-F 5’ -AAGCTAGTGTGCCAGTCTTCATC-3 ’
3 β -HSD-R 5’ -CGTTTTTCAGATTCCACCCGTTAG-3’
3 β -HSD-P :5，-(FAM)CGCCAGTACAGCCTTCTCAGCAAGC(Eclipse)-3，
反應(yīng)擴(kuò)增條件為
權(quán)利要求
1.一種誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞的方法，其特征在于包含以下步驟(1)將核苷酸序列如SEQID N0:1所示的SF-I基因插入腺病毒的穿梭質(zhì)粒 pAdtrack-CMV-EGFP的多克隆位點(diǎn)中，得到重組載體pAdtrack-CMV-SF-1 ；然后將重組載體pAdtrack-CMV-SF-Ι與腺病毒載體質(zhì)粒pAdEasy-Ι共轉(zhuǎn)染大腸桿菌BJ5183，得到攜帶 SF-I基因的腺病毒質(zhì)粒pAd-SF-Ι ；將腺病毒質(zhì)粒pAd-SF-1單酶切線性化，轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞 AD-293后得到腺病毒；(2)采用MOI= 200的量，將步驟(1)制備得到的腺病毒加入到誘導(dǎo)培養(yǎng)液中感染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞；誘導(dǎo)培養(yǎng)液的組成為 基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM/F12，含有體積百分比10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μ g/ml鏈霉素、500 μ M 二丁酰環(huán)磷酸腺苷。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞的方法，其特征在于步驟(1)中所述的腺病毒質(zhì)粒pAd-SF-Ι單酶切線性化是通過(guò)I^c I酶切進(jìn)行線性化。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞的方法，其特征在于步驟(1)中所述的轉(zhuǎn)染為通過(guò)磷酸鈣共沉淀法進(jìn)行。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞的方法，其特征在于步驟O)中所述的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)如下方法制備得到首先從正常的足月新生兒的人臍帶中分離得到沃頓膠組織，將沃頓膠組織剪碎，用培養(yǎng)液培養(yǎng)，待從組織塊游離出來(lái)的細(xì)胞長(zhǎng)至80 90%融合時(shí)，用胰酶消化游離出來(lái)的細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)， 得到人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；其中培養(yǎng)液為含有體積百分比10%的胎牛血清，5ng/ml的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，2mM L-谷氨酰胺，216 μ g/ml NaHCO3,100U/ml青霉素，100 μ g/ml鏈霉素和1 μ g/ml兩性霉素B的LG-DMEM培養(yǎng)液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞的方法，其特征在于所述的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原分子為通過(guò)FACScan流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞不表達(dá)造血標(biāo)志分子⑶14、⑶19、⑶34、⑶45和HLA-DR，而強(qiáng)表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面特異性抗原⑶44、⑶73、⑶90和⑶105 ；流式細(xì)胞的鑒定條件為細(xì)胞的密度不低于106/ml，采用mouse anti IgGl/PE和mouse anti IgGl/FITC作為同型對(duì)照;所述的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)成骨分化，成脂和成軟骨分化鑒定干細(xì)胞的分化能力，成脂分化用油紅染色鑒定，成骨分化用堿性磷酸酶染色及Von kossa染色鑒定，成軟骨分化用亞甲基藍(lán)染色鑒定。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞的方法，其特征在于步驟O)中所述誘導(dǎo)分化的條件為用胰酶將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞消化，離心收集， 按5X IO5細(xì)胞/孔的密度接種到6孔板，在培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜讓細(xì)胞貼壁，接著更換誘導(dǎo)培養(yǎng)液，以MOI = 200的量將腺病毒加入到誘導(dǎo)培養(yǎng)液中，輕搖動(dòng)培養(yǎng)板使病毒分布均勻，然后每?jī)商旄鼡Q新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)液；誘導(dǎo)分化7天。
7.權(quán)利要求1 6任一項(xiàng)所述的誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞的方法的應(yīng)用，其特征在于所述的誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞的方法用于誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞。
8.一種睪丸間質(zhì)細(xì)胞，通過(guò)權(quán)利要求1 6任一項(xiàng)所述的誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞的方法得到。
9.一種睪酮，通過(guò)權(quán)利要求8所述的睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌得到。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞的方法與應(yīng)用。該方法包括如下步驟首先將小鼠類固醇生成因子-1基因克隆入腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdtrack-CMV-EGFP，得到重組載體pAdtrack-CMV-SF-1；然后將重組載體pAdtrack-CMV-SF-1與腺病毒載體質(zhì)粒pAdEasy-1重組，得到攜帶SF-1基因的腺病毒質(zhì)粒pAd-SF-1；將腺病毒質(zhì)粒pAd-SF-1單酶切線性化，經(jīng)人胚腎細(xì)胞AD-293包裝后得到腺病毒；再將該腺病毒加入到誘導(dǎo)培養(yǎng)液中感染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞。經(jīng)過(guò)本發(fā)明所述方法的誘導(dǎo)，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在體外可以分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞，需時(shí)僅為1周，從而為采用細(xì)胞替代或者基因方法治療睪酮缺乏癥提供了重要的細(xì)胞來(lái)源。
文檔編號(hào)C12N15/861GK102533659SQ20111043968
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月24日
發(fā)明者彭公峰, 魏星 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)