專利名稱：檢測混合物中羚羊角成分的方法及所用引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)檢測混合物特別是藥材中羚羊角成分的方法，具體地涉及檢測藥材、或者以羚羊角或替代品入藥的中藥制劑中羚羊角成分的方法，以及該方法中所用到的特異性引物。
背景技術(shù)：
羚羊角是我國傳統(tǒng)的名貴中藥，為?？苿游锶恿缪?Saiga tatarica Linnaeus)的角。具有平肝息風(fēng)、清肝明目、散血解毒的功效，用于治療肝風(fēng)內(nèi)動、驚癇抽搐、 高熱痙厥、頭痛眩暈等癥。但目前對于羚羊角的鑒別主要采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法，依賴鑒別人員經(jīng)驗，主觀性高，因此需要一種能夠準(zhǔn)確、有效的鑒別方法。另一方面，脊椎動物線粒體基因組大小為161Λ左右，呈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞中呈多拷貝形式存在于線粒體中(依細(xì)胞類型不同而異)。動物線粒體基因在進(jìn)化上保守，且遵循嚴(yán)格的母系遺傳特性，因此被廣泛用于起源進(jìn)化分析和物種鑒定。在含羚羊角成分的混合物例如藥材、或者以羚羊角入藥的中藥制劑等的生產(chǎn)加工過程中，羚羊角中的部分DNA通常能夠保留于其中，因此，混合物中的羚羊角成分可以從其攜帶的DNA檢測中獲得鑒定。然而，在混合物特別是藥材、中藥制劑中羚羊角成分鑒定的研究技術(shù)上，由于混合物中羚羊角DNA含量很低，并且含有多種抑制PCR反應(yīng)的成分，因此，如何能夠有效提取其中的DNA是分子生物學(xué)技術(shù)鑒定羚羊角成分的一個關(guān)鍵；同時，含羚羊角的混合物特別是中藥制劑中通常還具有較多的其它動植物物種，如何設(shè)計羚羊物種特異性引物也成為鑒定技術(shù)的另一關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于提供一種利用分子生物學(xué)技術(shù)檢測混合物特別是藥材、中藥制劑中羚羊角成分的方法，以準(zhǔn)確、有效地鑒別混合物中是否含有羚羊角成分。本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于分子生物學(xué)技術(shù)檢測混合物特別是藥材、中藥制劑中羚羊角成分的方法中的特異性引物。本發(fā)明的另一目的在于提供了一種用于分子生物學(xué)技術(shù)檢測混合物特別是需要鑒別是否為羚羊角的藥材、或者以羚羊角或替代品入藥的中藥制劑中羚羊角成分的試劑盒，其中包含本發(fā)明所述的引物。為達(dá)上述目的，一方面，本發(fā)明提供了一種利用分子生物學(xué)技術(shù)檢測混合物中羚羊角成分的方法，該方法主要包括從待測混合物中提取總DNA ；以所提取的總DNA為模板，利用特異性引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)擴增；對擴增結(jié)果進(jìn)行分析判斷。
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如前所述，通常，含羚羊角的混合物特別是藥材、或者以羚羊角入藥的中藥制劑中，羚羊角成分含量很低，并還含有較多的其它動植物物種，還可能含有多種抑制PCR反應(yīng)的成分，在此情況下，設(shè)計羚羊物種特異性引物是本發(fā)明的分子生物學(xué)檢測技術(shù)的關(guān)鍵之
ο根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本案發(fā)明人從羚羊角中提取了總DNA，根據(jù)NCBI中公布的羚羊線粒體DNA與核DNA序列設(shè)計引物，經(jīng)擴增、測序，提交blastn比對、分析等， 設(shè)計了本發(fā)明的羚羊特異性引物。所設(shè)計的羚羊特異性引物為選自如下SEQ IDNos. 1和 2(本發(fā)明中亦將該引物對命名為S1F/R)、SEQ ID Nos. 3和4(本發(fā)明中亦將該引物對命名為S2F/R)、以及SEQ ID Nos. 5和6 (本發(fā)明中亦將該引物對命名為S3F/R)中的一對、兩對或三對引物S1F/R 5' -GAAAAACCCACCCACTT-3‘ (SEQ ID NO :1)/5，-TGTGGGTAACAGAGTGG-3，(SEQ ID NO 2)；S2F/R 5' -CTGCCTATTCATACACGTA-3，(SEQ ID NO :3)/5，-TTTGTCCTCATGGTAGG-3，(SEQ ID NO 4)；S3F/R 5' -CTACACCATTAAAGACATTC-3，(SEQ ID NO :5)/5，-ATGCGAATAGGAAGTATCAT-3，(SEQ ID NO :6)。如前所述，通常含羚羊角的混合物特別是藥材、或者以羚羊角入藥的中藥制劑中羚羊角DNA成分的含量是很低的，如何能夠有效提取其中的DNA，是本發(fā)明檢測羚羊角成分技術(shù)的另一個關(guān)鍵。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的方法中，所述從待測混合物中提取總DNA的過程包括以下步驟待測混合物經(jīng)煮沸法處理20 40分鐘；加入CTAB提取緩沖液60°C 70°C消化2 4小時；用酚仿法抽提；加入異丙醇沉淀富集DNA ；利用PCR純化試劑盒進(jìn)行純化，得到所提取的總DNA。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的上述方法特別適合于對以羚羊角入藥的藥材混合物或中藥制劑中羚羊角總DNA進(jìn)行提取，即使藥材混合物或中藥制劑中羚羊角成分含量低至0. 3wt % (除特別注明外，本發(fā)明中所述含量與比例均為重量含量與比例)，或是藥材或中藥制劑中含有其他多種動植物成分(例如，羚羊清肺丸，含有二十四味藥；牛黃清心丸，含有二十九味藥；等)，也能有效提取其中的DNA。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，上述從待測混合物中提取總DNA的過程中所述煮沸法處理待測混合物樣品主要是破碎細(xì)胞，具體操作時可根據(jù)需要向待測混合物中加入適量的水(通常，每3 5g總固含量的待測樣品加IOml水)，煮沸通常是可以在常壓下進(jìn)行(100°C左右)，煮沸時間20 40分鐘，優(yōu)選30分鐘 40分鐘。所述向煮沸后的待測樣品中加入CTAB提取緩沖液進(jìn)行消化處理，主要是破壞混合物中的多糖多酚類物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選具體實施方案，所用CTAB提取緩沖液的組成為3% CTAB，IOOmM Tris-HCl pH 8. 0,20mM EDTA pH 8. 0,2. 5M NaCl。最優(yōu)選的消化處理條件為等體積混合，65 °C，3小時。所述酚仿法抽提主要是去除混合物中蛋白質(zhì)、色素等溶于有機物的雜質(zhì)。酚仿法
4抽提的具體操作可以按照所屬領(lǐng)域的常規(guī)操作進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，本發(fā)明中所述酚仿法抽提的操作為經(jīng)CTAB緩沖液消化后的樣品冷卻至室溫后加入等體積苯酚/ 氯仿/異戊醇05 24 1)，混勻，12000rpm離心20分鐘，取上清；再加入等體積氯仿/ 異戊醇04 1)，混勻，12000rpm離心20分鐘，取上清。本發(fā)明中，向上述經(jīng)酚仿法抽提得到的上清中加入異丙醇主要是沉淀富集DNA。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，具體操作為加入等體積預(yù)冷的異丙醇，混勻，4°C 12000rpm離心20分鐘，棄上清，沉淀用75%酒精洗滌。為便于后續(xù)純化步驟，可將洗滌后的提取物用適量雙蒸水溶解。所述利用PCR純化試劑盒進(jìn)行純化的步驟主要是去除DNA中殘留的色素等水溶性雜質(zhì)。PCR純化試劑盒可以采用所屬領(lǐng)域常用的商購產(chǎn)品，具體操作可以按照純化試劑盒的說明書進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，當(dāng)待測混合物中含有較多多糖類物質(zhì)時，在提取總 DNA的過程中，在經(jīng)酚仿法抽提得到的上清中，還可加入LiCl過夜處理，以去除殘留多糖類物質(zhì)，之后再加入異丙醇沉淀富集DNA。此外，對于利用PCR純化試劑盒所純化得到的總 DNA，還可進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取情況。在本發(fā)明的一具體實施方案中，所述的待測混合物為以羚羊角或其替代品(例如山羊角、黃羊角或其他物種偽品)入藥的中藥制劑或混合藥材，其中除羚羊角或其替代品外，還含有其他多種動植物成分，例如，羚羊清肺丸含有二十四味藥，牛黃清心丸含有二十九味藥等，本發(fā)明的方法是用于檢測該中藥制劑或混合藥材中是否是真正以羚羊角入藥。在該具體實施方案中，為有效提取其中的總DNA，是按照以下操作進(jìn)行將待測混合物樣品粉碎，加適量水(通常每3 5g總固含量的樣品加IOml水)，常壓煮沸30分鐘 40 分鐘；向煮沸處理后的待測樣品中加入等體積CTAB提取緩沖液(3% CTAB, IOOmM Tris-HCl pH 8. 0,20mM EDTA pH 8. 0,2. 5M NaCl)，65°C消化處理3小時；之后冷卻至室溫，加入等體積苯酚/氯仿/異戊醇05 24 1)，混勻，12000rpm離心20分鐘，取上清；再加入等體積氯仿/異戊醇(24 1)，混勻，12000rpm離心20分鐘，取上清；加入1/4體積IOM LiCl， 混合后4°C過夜；然后樣品在4°C 12000rpm離心30分鐘，取上清加入等體積預(yù)冷的異丙醇， 混勻后4°C 12000rpm離心20分鐘，棄上清；用75%酒精洗滌沉淀三遍后取適量雙蒸水溶解，溶解的DNA經(jīng)PCR純化試劑盒純化，得到提取的總DNA (具體可采用康為世紀(jì)PCR產(chǎn)物純化試劑盒50T，貨號CW0521，在其說明書指導(dǎo)的操作基礎(chǔ)上，可適當(dāng)增加去雜質(zhì)緩沖液洗滌體積及次數(shù)，以達(dá)到更好的純化效果)。純化后的DNA可用0. 7%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取情況。按照本發(fā)明的該提取方法，即使待測混合物中羚羊角成分含量低至0.3%左右，也能有效提取其DNA，用于后續(xù)PCR擴增。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的分子生物學(xué)技術(shù)檢測混合物特別是藥材、 中藥制劑等中羚羊角成分的方法中，所述PCR擴增反應(yīng)條件如下反應(yīng)體系為15 μ 1，其中 10 XPCR緩沖液 1 5. 5 μ 1，dNTPs (2. 5mM) 0. 5 1. 8 μ 1， 上下游引物(10 μ Μ)各 0. 5 1. 5 μ 1，Taq DNA 聚合酶(5υ/μ 1)0. 2 1. 2 μ 1，DNA 模板 (50ng/y 1)0. 8 3μ 1，無菌超純水補至15μ 1 ；擴增條件95°C預(yù)變性5min ；95°C變性30s，48 68°C退火30s，72°C延伸30s，共 35 40個循環(huán)；最后72°C延伸7 lOmin。
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本發(fā)明中，是以所述的引物對分別以所提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴增，S卩，單重 PCR擴增。所述PCR擴增反應(yīng)條件中，優(yōu)選的退火溫度為56°C 58°C，最優(yōu)選為57°C。更具體地，其中，所述引物對SEQ ID Nos. 1和2的最佳退火溫度為57°C，所述引物對SEQ ID Nos. 3和4的最佳退火溫度為57°C，所述引物對SEQ ID Nos. 5和6的最佳退火溫度為57°C。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的分子生物學(xué)技術(shù)檢測混合物特別是藥材、 中藥制劑中羚羊角成分的方法中，所述對擴增結(jié)果進(jìn)行分析判斷主要是進(jìn)行定性分析，定性分析方法可以是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的，例如，該分析過程可包括用凝膠電泳顯示所述擴增的產(chǎn)物，根據(jù)是否擴增出目的片段，以定性檢測待測混合物中是否存在相應(yīng)的羚羊角成分。本發(fā)明中，所述的待測混合物可以是指含有或可能含有羚羊角成分的任何混合物，包括藥材、中藥制劑等。具體地，當(dāng)需要鑒別某一藥材是否為羚羊角時，或者需要鑒別某一中藥制劑是以羚羊角或是其他物種的替代品入藥時，本發(fā)明的檢測方法特別適用?？梢岳斫猓景l(fā)明的方法所適用的待測混合物中并不含有羚羊物種除羚羊角外的其它組織成分，或者已通過其它方法排除含有羚羊的其它組織成分，即，本發(fā)明的方法是特別針對以羚羊角入藥或以羚羊角的替代品入藥的中藥制劑進(jìn)行檢測，判別其中是否含有羚羊角成分。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的分子生物學(xué)技術(shù)檢測混合物特別是藥材、 中藥制劑中羚羊角成分的方法還包括將待測混合物樣品的擴增結(jié)果與從羚羊角中提取DNA進(jìn)行PCR擴增的結(jié)果進(jìn)行對照，分析判斷所測混合物中是否存在羚羊角成分。從羚羊角中提取DNA的具體操作可以按照生物技術(shù)領(lǐng)域從單一物種中提取DNA的常規(guī)操作進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的分子生物學(xué)技術(shù)檢測混合物特別是藥材、 中藥制劑中羚羊角成分的方法中，是以引物對SEQ ID Nos. 1和2、SEQ ID Nos.3和4、以及 SEQ ID Nos. 5和6分別進(jìn)行PCR擴增，如果擴增出一個、二個或三個相應(yīng)的目的片段，則初步判斷所測混合物中存在羚羊角成分。特別是以引物對SEQ ID Nos. 1和2、SEQID Nos.3 和4、以及SEQ ID Nos. 5和6分別進(jìn)行PCR擴增，均能擴增相應(yīng)的目的片段，則所測混合物中存在羚羊角成分。另一方面，本發(fā)明還提供了用于實現(xiàn)本發(fā)明所述檢測混合物中羚羊角成分的方法的引物，該引物包括選自:SEQ ID Nos. 1和2、SEQ ID Nos. 3和4、以及SEQ ID Nos. 5和6 中的一對、兩對或三對引物。本發(fā)明的上述引物對，在檢測混合物特別是需要鑒別是否為羚羊角的藥材、以羚羊角或替代品入藥的中藥制劑中是否存在羚羊角成分中具有應(yīng)用前景，能夠特異性檢測待測混合物中是否含有羚羊角成分，并且，檢測靈敏度高，當(dāng)混合物中包含的羚羊角成分含量為0.3% (質(zhì)量百分比)時，也能有效提取并特異性地檢測出來。另一方面，本發(fā)明還提供了一種檢測混合物中羚羊角成分的試劑盒，該試劑盒中包含本發(fā)明所述的引物，優(yōu)選還可進(jìn)一步包括相應(yīng)的PCR緩沖液、dNIPs、DNA聚合酶等。具體地，其中所述的引物是本發(fā)明所述的引物對SEQ ID Nos. 1和2、SEQ ID Nos. 3和4、以及 SEQ ID Nos. 5和6中的一對、兩對或三對引物。有益效果綜上所述，本發(fā)明從含羚羊角成分的混合物中提取了總DNA，設(shè)計了羚羊物種特異
6性引物，分別以所述羚羊物種特異性引物PCR擴增含有羚羊角或偽品成分的混合物DNA。 本發(fā)明所設(shè)計的擴增引物以及擴增方法具有較高的特異性，且檢測靈敏度高，可單獨作為一種快速檢測方法應(yīng)用于對含有羚羊角或偽品成分的混合物特別是藥材、中藥制劑進(jìn)行檢測，準(zhǔn)確地定性檢測混合物中羚羊角成分的存在情況。


圖1顯示按照本發(fā)明實施例1的方法從不同藥材中提取總DNA的瓊脂糖電泳檢測結(jié)果。圖中，M為IOObp DNA Ladder，泳道1 山羊角粉，泳道2 羚羊角粉，泳道3 塞隆骨， 泳道4:豹骨。圖2顯示從一些半成品或成品中藥制劑中提取總DNA的瓊脂糖電泳檢測結(jié)果。其中，泳道1 同仁堂再造丸半成藥(豹骨方)；泳道2:同仁堂再造丸成藥(豹骨方)；泳道3: 同仁堂再造丸半成藥(塞隆骨替代方)；泳道4 同仁堂再造丸成藥(塞隆骨替代方)；泳道 5 羚羊清肺丸半成藥(羚羊角方)；泳道6 羚羊清肺丸成藥(羚羊角方)；泳道7 羚羊清肺丸半成藥(山羊角替代方)；泳道8 羚羊清肺丸成藥(山羊角替代方)；M為DL2000。圖3顯示利用通用引物對SEQ ID Nos. 7和8以從羚羊角中提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴增的產(chǎn)物測序結(jié)果。圖中，上方序列是以山羊(Capra hircus)序列做對照，下方序列為賽加羚羊(Saiga tatarica)序列。圖4顯示依據(jù)賽加羚羊物種特異分子標(biāo)記(SNP)特征設(shè)計用于賽加羚羊物種檢測的特異引物結(jié)果。其中，上方序列為羚羊序列，下方序列為山羊序列，方框內(nèi)所標(biāo)示部分為所設(shè)計的引物部分。圖5為用本發(fā)明的羚羊物種特異性引物PCR擴增不同混合物樣品DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。其中，泳道1為羚羊清肺丸成藥(羚羊角方)，泳道2為牛黃清心丸成藥 (羚羊角方)，泳道3為羚羊清肺丸成藥(山羊角替代方)，泳道4為牛黃清心丸成藥(山羊角替代方)，泳道5為羚羊角藥材，泳道6為山羊角藥材，泳道7為空白對照。
具體實施例方式為了更清楚地理解本發(fā)明，現(xiàn)參照下列實施例及附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明。實施例僅用于解釋而不以任何方式限制本發(fā)明。實施例中未注明具體條件的實驗方法為所屬領(lǐng)域熟知的常規(guī)方法和常規(guī)條件，或按照制造商所建議的條件；實施例中所用到的各種化學(xué)試劑均可商購獲得，各試劑除標(biāo)注外，均購自北京化學(xué)試劑公司；實施例中所用引物委托hvitrogen公司合成。實施例1羚羊清肺丸(羚羊角方)中羚羊角成分檢測1、羚羊角總DNA的提取該提取步驟可以按照所屬領(lǐng)域的常規(guī)操作進(jìn)行。本實施例的具體操作如下 羚羊角經(jīng)液氮研磨成粉狀，取200 μ g加入Iml裂解液B(10mM Tris-HCl pH8. 0,0. IM EDTApH8. 0,0. 5% SDS,200y g/ml 蛋白酶 K，0.4M DTT)，55°C消化過夜，消化樣品 100°C煮 IOmin,冰浴5min，12000rpm離心15min取上清進(jìn)行酚仿抽提。之后用2倍體積無水乙醇沉
7淀DNA，再用75%乙醇洗沉淀兩遍，適量雙蒸水溶解。樣品DNA經(jīng)PCR純化試劑盒(康為世紀(jì)PCR產(chǎn)物純化試劑盒50T，貨號CW0521，具體操作按照說明書進(jìn)行)純化，得DNA提取樣品。經(jīng)0. 7%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果請參見圖1所示。另，按照上述方法以山羊角為原料提取得到DNA。此外還分別以塞隆骨、豹骨為原料，按照傳統(tǒng)方法，均分別提取得到DNA。各原料所提取的DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測請參見圖1所示。2、羚羊清肺丸(羚羊角方)中總DNA的提取選用3批次(10丸/批次)同仁堂羚羊清肺丸成藥(羚羊角方)為待測樣品。每份樣品取所述羚羊清肺丸(羚羊角方)成藥(二十四味)4g(約1丸)，其中羚羊角成分約占0.3% (質(zhì)量百分比)。將藥丸切碎，用IOml雙蒸水充分溶解后，100°C水浴30分鐘，冰浴10分鐘冷卻，4°C 12000rpm離心20分鐘，取上清；加入等體積(IOml)CTAB提取緩沖液 (3% CTAB, IOOmM Tris-HCl pH 8. 0,20mM EDTA pH 8. 0,2. 5M NaCl)，65°C水浴 3 小時；樣品冷卻至室溫后加入等體積苯酚/氯仿/異戊醇05 24 1)，緩慢顛倒混勻，12000rpm 離心20分鐘，取上清；加入等體積氯仿/異戊醇(24 1)，緩慢顛倒混勻，12000rpm離心20 分鐘，取上清；加入1/4體積IOM LiCl，緩慢顛倒混合后4°C過夜；樣品4°C 12000rpm離心 30分鐘，取上清加入等體積預(yù)冷的異丙醇，緩慢混勻后4°C 12000rpm離心20分鐘，棄上清； 用75%酒精洗滌沉淀三遍后取適量雙蒸水溶解。溶解的DNA經(jīng)PCR純化試劑盒(康為世紀(jì)PCR產(chǎn)物純化試劑盒50T，商品貨號CW0521，按照說明書的操作進(jìn)行，并增加去雜質(zhì)緩沖液洗滌體積至350 μ 1，洗滌次數(shù)增為2次純化，得到純化的DNA。純化的DNA經(jīng)0. 7%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取情況，結(jié)果請參見圖2(3批次共30例樣品提取結(jié)果電泳圖基本類似， 圖中僅示意性給出其中一例情況)。另，分別以同仁堂羚羊清肺丸半成藥(羚羊角方)(3批次，10丸/批次，每丸為一例樣品，約4g)、羚羊清肺丸半成藥(山羊角替代方)(3批次，10丸/批次，每丸為一例樣品， 約4g)、羚羊清肺丸成藥(山羊角替代方)(3批次，10丸/批次，每丸為一例樣品，約4g)、同仁堂再造丸半成藥(豹骨方)(3批次，5丸/批次，每丸為一例樣品，約4g)、同仁堂再造丸成藥(豹骨方)(3批次，5丸/批次，每丸為一例樣品，約4g)、同仁堂再造丸半成藥(塞隆骨替代方)(3批次，5丸/批次，每丸為一例樣品，約4g)、同仁堂再造丸成藥(塞隆骨替代方)(3批次，5丸/批次，每丸為一例樣品，約4g)為待測樣品，按照上述方法，均分別提取得到了總DNA，各種待測樣品的瓊脂糖凝膠電泳檢測請參見圖2所示(同樣的，由于每種樣品的多例提取結(jié)果電泳圖基本類似，圖中僅示意性給出其中一例情況)。本發(fā)明中，所述的“羚羊角方”是指該中藥中確實是以羚羊角入藥(例如，所述的羚羊清肺丸(羚羊角方)是指該羚羊清肺丸中確實是以羚羊角入藥)；所述的“山羊角替代方”是指與相應(yīng)的羚羊角方的中藥相比，差異主要在于其中是以山羊角替代羚羊角入藥，其它組分基本相同；所述羚羊清肺丸中并不含除羚羊角之外的其它羚羊組織成分；所述的“豹骨方”是指該中藥中確實是以豹骨入藥(例如，所述的再造丸(豹骨方) 是指該再造丸中確實是以豹骨入藥)；所述的“塞隆骨替代方”是指與相應(yīng)的豹骨方的中藥相比，差異主要在于其中是以塞隆骨替代豹骨入藥，其它組分基本相同；所述再造丸中并不含有羚羊或是山羊組織成分。3、物種特異性引物及PCR反應(yīng)條件
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(1)羚羊角特異性引物的設(shè)計根據(jù)NCBI上提供的山羊線粒體基因組序列(NC 005044)、賽加羚羊線粒體基因組序列部分序列(CYTB :AF064487)以及相近物種(藏羚羊DQ191^6等)線粒體基因組全序列，通過DNAstar在cytb區(qū)域設(shè)計通用引物。引物信息見表1所示，利用該引物對SEQ ID Nos. 7和8，對前述“ 1、羚羊角總DNA的提取”過程中提取得到的純化的DNA為模版，進(jìn)行PCR 擴增(反應(yīng)體系為15μ 1，其中10XPCR緩沖液(商業(yè)化產(chǎn)品，內(nèi)含Tris-HCl pH8. 5100mM、 KCl 500mM、MgC1215mM) 1· 5μ 1，dNTPs (2. 5mM) 1. 5 μ 1，上下游引物(10 μ Μ)各 0· 5 μ 1，Taq DNA聚合酶(5U/μ 1)0. 3 μ 1，DNA模板(50ng/μ 1) 1 μ 1，無菌超純水補至15 μ 1。擴增條件 95°C預(yù)變性 5min ;95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s，40 個循環(huán)；72°C延伸 lOmin)，擴增產(chǎn)物經(jīng) DNA測序(測序結(jié)果參見圖；3)，提交blastn(http://blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi) 在線比對，分析，獲得賽加羚羊物種特異分子標(biāo)記(SNP)，依據(jù)物種特異SNP特征，設(shè)計本發(fā)明的用于賽加羚羊物種檢測的特異引物，引物設(shè)計結(jié)果參見圖4所示，其中，上方序列為羚羊序列，下方序列為山羊序列，方框內(nèi)所標(biāo)示部分為所設(shè)計的引物部分。表1用于賽加羚羊Cytb區(qū)擴增的引物信息
權(quán)利要求
1.一種檢測混合物中羚羊角成分的方法，該方法主要包括 從待測混合物中提取總DNA ；以所提取的總DNA為模板，利用特異性引物進(jìn)行PCR擴增；所述特異性引物為選自SEQ ID Nos. 1和2、SEQ ID Nos. 3和4、以及SEQ ID Nos. 5和6中的一對、兩對或三對引物； 對上述擴增結(jié)果進(jìn)行分析判斷。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述從待測混合物中提取總DNA的過程包括如下步驟待測混合物經(jīng)煮沸法處理20 40分鐘； 加入CTAB提取緩沖液60V 70°C消化2 4小時； 用酚仿法抽提； 加入異丙醇沉淀富集DNA;利用PCR純化試劑盒進(jìn)行純化，得到所提取的總DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述PCR擴增反應(yīng)條件如下反應(yīng)體系為15 μ 1，其中10XPCR緩沖液1 5. 5 μ l,dNTPs (2. 5mM)0. 5 1. 8μ 1，上下游引物(10 μ Μ)各 0. 5 1. 5 μ l，Taq DNA 聚合酶(5U/μ 1)0. 2 1. 2 μ 1，DNA 模板(50ng/ μ 1)0. 8 3μ 1，無菌超純水補至15μ 1 ；擴增條件95°C預(yù)變性5min ；95°C變性30s，48 68°C退火30s, 72°C延伸30s，35 40 個循環(huán)；最后72°C延伸7 IOmin ；優(yōu)選地，所述SEQ ID Nos. 1和2的退火溫度為57°C，所述SEQ ID Nos. 3和4的退火溫度為57°C，所述SEQ ID Nos. 5和6的退火溫度為57°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述對上述擴增結(jié)果進(jìn)行分析判斷的過程包括用凝膠電泳顯示所述擴增的產(chǎn)物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述待測混合物為需要鑒別是否為羚羊角的藥材、或者以羚羊角或替代品入藥的中藥制劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，該方法還包括將待測混合物樣品的擴增結(jié)果與從羚羊角中提取DNA進(jìn)行PCR擴增的結(jié)果進(jìn)行對照， 分析判斷所測混合物中是否存在羚羊角成分。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的方法，其中，以SEQID Nos. 1和2、SEQ ID Nos. 3和4、 以及SEQ ID Nos. 5和6分別進(jìn)行PCR擴增，擴增出一個、二個或三個相應(yīng)的目的片段，則所測混合物中存在羚羊角成分。
8.用于實現(xiàn)權(quán)利要求1 7任一項所述檢測混合物中羚羊角成分的方法的引物，該引物包括選自SEQ ID Nos. 1和2、SEQ ID Nos. 3和4、以及SEQ ID Nos. 5和6中的一對、兩對或三對引物。
9.權(quán)利要求8所述的引物在檢測混合物中是否存在羚羊角成分中的應(yīng)用；優(yōu)選地，所述待測混合物為需要鑒別是否為羚羊角的藥材、或者以羚羊角或替代品入藥的中藥制劑。
10.一種檢測混合物中羚羊角成分的試劑盒，該試劑盒包含權(quán)利要求8所述的引物，優(yōu)選還進(jìn)一步包括PCR緩沖液、dNTPs和DNA聚合酶。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測混合物中羚羊角成分的方法及所用引物，所述的方法主要包括從待測混合物中提取總DNA；以所提取的總DNA為模板，利用特異性引物進(jìn)行PCR擴增；所述特異性引物為選自SEQ ID Nos.1和2、SEQ ID Nos.3和4、以及SEQ ID Nos.5和6中的一對、兩對或三對引物；對擴增結(jié)果進(jìn)行分析判斷。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含上述引物的檢測混合物特別是需要鑒別是否為羚羊角的藥材、或者以羚羊角或替代品入藥的中藥制劑中羚羊角成分的試劑盒。本發(fā)明的引物具有較高的特異性和靈敏性。
文檔編號C12N15/11GK102424845SQ20111043912
公開日2012年4月25日 申請日期2011年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月23日
發(fā)明者彭鵬, 秦晨, 胡愛平, 范國強, 趙興波, 邱落 申請人:北京中研同仁堂醫(yī)藥研發(fā)有限公司, 北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司, 北京同仁堂股份有限公司