專利名稱：一種廣譜抗病促生的芽胞菌菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種芽胞菌屬的菌株，特別是涉及一種利用微生物篩選技術(shù)，從小麥根際土壤分離獲得的對(duì)多種植物有較強(qiáng)促生和生防作用的芽胞菌菌株。
背景技術(shù)：
植物根際促生菌(plant growth promoting rhizobacteria, PGPR)是農(nóng)用生物制劑常用的微生物素材。過去十幾年間，用PGI^R菌株及其相關(guān)產(chǎn)品進(jìn)行植物促生和生防應(yīng)用已屢見不鮮，但真正能大范圍應(yīng)用的產(chǎn)品卻不多見，其原因是大多PGPR菌株環(huán)境適應(yīng)性差、在土壤中競(jìng)爭(zhēng)力不強(qiáng)。因此，篩選高效廣適的PGPR，是研發(fā)生物制劑的關(guān)鍵。迄今為止，人們篩選出的PGPR菌株通常都具有促生專一性或局限性。不少國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道了一些 PGPR菌株具有高效廣譜的促生能力，如Jetiyanon等人報(bào)道了幾株feciBm spp.菌株對(duì)番茄枯萎病、辣椒炭疽病和黃瓜花葉病等病害具有較好的生防作用；Suresh等人報(bào)道了一 mPseudoMmas spp.菌株能拮抗多種病原真菌。但這些研究都僅僅涉及PGI3R對(duì)病原菌的拮抗作用或?qū)嶋H的生防作用，這些菌株在健康土壤中是否還具有促生作用，我們不得而知。 但可以推斷，這些PGI^R大多很難適應(yīng)不同的土壤環(huán)境和植物。這是因?yàn)椋酝鶊?bào)道PGI^R的生防途徑，主要是產(chǎn)生HCN、抗生素等，對(duì)于健康土壤而言，增加這些物質(zhì)可能對(duì)植物起負(fù)面作用。目前國內(nèi)推廣應(yīng)用的一些農(nóng)業(yè)微生物制劑仍然存在產(chǎn)品作用專一性強(qiáng)、環(huán)境適應(yīng)性差等缺陷。事實(shí)上，這些問題對(duì)于微生物制劑開發(fā)人員而言可能是比較清楚的，只是出于某些原因不便明言罷了。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)以往PGI^R菌株作用局限性，應(yīng)用篩選技術(shù)，從根際土壤獲得1株真正既廣譜抗病，又高效促生的PGPR菌株，并已在水稻育秧、豇豆、番茄、蠶豆等等植物上應(yīng)用成功。本發(fā)明提供的菌株為短小芽胞桿菌(feciBm pumilus) W^ (以下簡(jiǎn)稱為WP8 菌株)，是從我國江蘇省揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)小麥根際土壤中分離、篩選出的，其已于 2011年8月31日在“中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏管理中心”保藏，保藏編號(hào)為CGMCC No. 5206。本發(fā)明所述的WP8菌株具有下述性質(zhì) A、形態(tài)特征
在肉湯瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)2天后，用光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡進(jìn)行觀察，WP8細(xì)桿狀，長度2 3微米，寬度為0. 6^0. 7微米，革蘭氏陽性，產(chǎn)芽孢，以極生鞭毛運(yùn)動(dòng)。B、培養(yǎng)特征
在肉湯瓊脂培養(yǎng)基上菌落乳白，半透明，表面粗糙但有光澤，邊緣輻射狀。C、菌株生理生化特性
WP8菌株在10%氯化鈉培養(yǎng)基上亦可緩慢生長，接觸酶、甲基紅反應(yīng)陽性，能液化明膠，產(chǎn)硫化氫，V-P反應(yīng)陰性，不能水解淀粉、尿素，不能還原硝酸。D、菌株16S rRNA基因序列如SEQ ID NO. 1所示。E、菌株鑒定結(jié)果
通過形態(tài)特征、理化特性，結(jié)合16S rRNA基因序列結(jié)果，將該菌株鑒定為短小芽胞桿菌 {Bacillus pumilus \本發(fā)明使用時(shí)僅需用該菌株浸種1(T20 min，晾干栽種即可，具有用量省、見效快、 適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，可節(jié)約209Γ70%農(nóng)藥化肥投入量，對(duì)多種病害的生防效果達(dá)60%以上，有效地解決了多種果蔬、作物生產(chǎn)中過度依賴農(nóng)藥化肥的問題。


圖1為WP8菌株對(duì)6種常見病原真菌的體外拮抗作用。圖中從左至右分別為 Botrytis cinerea Λ Bipolaris sorokiniana Λ Fusarium gram in ear um Λ Rhizoctonia cereal is Λ Rhizoc tonia so Iani Λ Fusarium monili forme。圖2為WP8菌株在水稻育秧中的促生效果。其中圖左為對(duì)照，圖右為添加WP8處理。圖3為WP8菌株在番茄青枯病生防中的效果。其中圖左為對(duì)照，圖右為添加WP8處理。圖4為WP8菌株電鏡形態(tài)(9 700 X )。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 :WP8菌株的篩選方法
采集揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)田小麥根及其附著土壤2 mm區(qū)域)，置于冰盒(溫度約 4°C )，立即帶回實(shí)驗(yàn)室。取植物根部，用無菌dH20輕柔沖洗，以去除外圍土壤，切成長約3 cm小段(利于內(nèi)生細(xì)菌釋放)，各稱取約1 g根段加入200 mL無菌dH20,150 r/min混合30 min，梯度稀釋后，分別吸取20 μ L菌液涂布于3種篩選培養(yǎng)基Jensen’ s培養(yǎng)基、King’ s B培養(yǎng)基，和NA (nutrient agar)培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)72 h，挑取共計(jì)98株形態(tài)各異的細(xì)菌， 分別編號(hào)，按照溶磷、解鉀、固氮、產(chǎn)IAA、產(chǎn)嗜鐵素、抗生素等指標(biāo)進(jìn)行PGI^R菌株的進(jìn)一步篩選，最終獲得1株高效促生能力的WP8菌株。WP8菌株于2011年8月31日送交中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCC No. 5206 ；分類命名為短小芽胞桿菌(Mcillus /7^^7^5);保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所。實(shí)施例2 :WP8促生及生防指標(biāo)測(cè)定 A、體外抑菌能力測(cè)定
用改進(jìn)的平板雙培養(yǎng)法測(cè)定WP8體外抑菌率(圖1)。在PDA平板邊緣均勻接種3滴 IO8 CFU/ mL菌液培養(yǎng)M h。從長有病原菌的PDA平板上用打孔器挖取4 mm直徑病原菌塊，轉(zhuǎn)置于長有細(xì)菌的平板中央，繼續(xù)培養(yǎng)7 d。抑菌率(%)=(平板面積一病原菌覆蓋面積)/平板面積X 100%。結(jié)果顯示，WP8 MBotrytis cinerea、Bipolaris sorokiniana > Fusarium gram in earum ^ Rhizoctonia cerealis、Rhizoctonia so Iani > Fusarium moniliforme 等原真菌的拮抗率分別為 53. 99%,64. 67%、14. 52%,30. 91%、13. 27%和 64. 94%οB、產(chǎn)嗜鐵素鑒定
將CAS培養(yǎng)基劃分成若干等分，接種供試菌株(10 μ L IO6 CFU/mL)J8°C培養(yǎng)48 h_72 h，如菌株周邊有黃綠色暈圈產(chǎn)生，即表明該菌株具產(chǎn)嗜鐵素能力。結(jié)果表明，WP8有一定的產(chǎn)嗜鐵素能力。實(shí)施例3 :WP8對(duì)豇豆幼苗促生能力測(cè)試(盆栽試驗(yàn))
將消毒過的豇豆種子在IO8 cfu/mL WP8細(xì)胞液內(nèi)浸泡20 min，于無菌操作臺(tái)上風(fēng)干后，備播種用。豇豆播種，每孔穴播入3粒種子，深度為2-3 cm，覆土后每孔穴補(bǔ)充5 mL自來水，置于室溫環(huán)境。整個(gè)試驗(yàn)期不施任何肥料，只在土表干燥時(shí)，每孔穴補(bǔ)以等量自來水。 7 d后，統(tǒng)計(jì)種子出苗率，之后間苗至1棵/穴；15 d后，將幼苗小心取出，測(cè)量根、莖長度； 自來水下沖洗洗凈后，將莖葉和根部分離，置于烘箱80°C烘8 h左右至恒重，分別稱重。試驗(yàn)中，WP8浸種處理出苗率分別比對(duì)照提高14.四％，株高比對(duì)照提高14. 39%，干物重比對(duì)照增高18. 43%，差異均達(dá)顯著水平。實(shí)施例4 :WP8對(duì)水稻塑盤旱育秧苗素質(zhì)的影響
將消毒過的水稻種子在IO8 Cfu/mL WP8細(xì)胞液內(nèi)浸泡20 min，于無菌操作臺(tái)上風(fēng)干后，備播種用。在434孔規(guī)格的塑盤旱育拋秧盤中，每盤均勻撒播45 g種子，用細(xì)土覆土 2 cm，噴灑自來水使苗盤濕潤，覆膜。齊苗后，在第一葉完全抽出1.0 cm左右時(shí)揭膜。早晚時(shí)分灑水補(bǔ)濕。20 d后，取出秧盤，測(cè)量莖長、莖基粗等；自來水下沖洗洗凈后，將莖葉和根部分離，置于烘箱80°C烘8 h左右至恒重，分別稱重。試驗(yàn)中，WP8處理的莖高比對(duì)照減少 7. 27%，莖基粗對(duì)照增粗21. 05%，差異均達(dá)顯著水平；WP8處理的地上部和地下部干重分別比對(duì)照增重8. 23%和4. 82% (如圖2)。實(shí)施例5 :WP8對(duì)番茄青枯病的生防作用
將消毒過的番茄種子在IO8 Cfu/mL WP8細(xì)胞液內(nèi)浸泡20 min，于無菌操作臺(tái)上風(fēng)干后，備播種用。在土壤中拌入IO7 cfu/g soil濃度的番茄青枯病病原菌，播種，設(shè)對(duì)照和WP8 菌株浸種2個(gè)處理，每孔播3粒種子，覆土后噴灑自來水使育苗盤濕潤，置于室外環(huán)境。12 d后間苗至每孔2株。早晚時(shí)分灑水補(bǔ)濕。12 d間苗時(shí)統(tǒng)計(jì)出苗株數(shù)，出苗率(%)=出苗株數(shù)/播種粒數(shù)X100%;35 d后，取出育苗盤，統(tǒng)計(jì)健株數(shù)，健株率(%)=健苗株數(shù)/出苗株數(shù)X 100%，防治效果(%)=(病原菌對(duì)照發(fā)病苗數(shù)一處理組發(fā)病苗數(shù))/病原菌對(duì)照發(fā)病苗數(shù)X100%，測(cè)量莖長、根長、莖基粗等；自來水下沖洗洗凈后，將莖葉和根部分離，置于烘箱 80°C烘8 h左右至恒重，分別稱重。試驗(yàn)中，WP8處理的出苗率比對(duì)照增加25. 91%，番茄健株率比對(duì)照增加180. 36%，差異達(dá)顯著水平，生防效果達(dá)52. 10% (如圖3)。實(shí)施例6 菌株的鑒定
A、形態(tài)及培養(yǎng)特征接種WP8菌株于營養(yǎng)肉湯瓊脂上培養(yǎng)2、天后，觀察菌落形狀及菌體顏色，并用光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡進(jìn)行常規(guī)菌體形態(tài)的觀察(如圖4)。B、生理生化實(shí)驗(yàn)參照《Bergey’ s Manual of Systematic Bacteriology》的內(nèi)容對(duì)菌株進(jìn)行生理生化鑒定。C、16S rRNA基因序列分析按反復(fù)凍融法提取細(xì)菌基因組DNA。以總DNA為模板， 利用特異引物27F/1492R (引物見SEQ ID NO. 2和3)擴(kuò)增16S rRNA基因近乎全長片段。 50 μ L 的反應(yīng)體系中含有 IXPCR Buffer (含 MgC12)，200 μ mol/L 的 dNTPs，0. 2 μ mol/L的引物，IXTaq DNA聚合酶(Takara，大連寶生物)和1 μ L的模板。PCR反應(yīng)程序?yàn)?94° C預(yù)變性5min;94° C變性45 s，64° C退火lmin，72° C延伸90 s，20個(gè)循環(huán)，每次循環(huán)退火溫度降低0.5° C;72° C延伸20 min0 PCR產(chǎn)物送上海生工測(cè)序。根據(jù)獲得 16S rDNA序列，在GenBank中Blast搜索同源序列。
權(quán)利要求
1. 一種廣譜抗病促生的芽胞菌菌株，是短小芽胞桿菌UaciBm pumilus) WP8保藏編號(hào)為 CGMCC No. 5206。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種芽胞菌屬的菌株，該菌株是短小芽胞桿菌(Bacilluspumilus)WP8；保藏編號(hào)為CGMCCNo.5206。本發(fā)明使用時(shí)僅需用該菌株浸種10~20min，晾干栽種即可，具有用量省、見效快、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，可節(jié)約20%~70%農(nóng)藥化肥投入量，對(duì)多種病害的生防效果達(dá)60%以上，有效地解決了多種果蔬、作物生產(chǎn)中過度依賴農(nóng)藥化肥的問題。
文檔編號(hào)C12R1/07GK102443553SQ201110351128
公開日2012年5月9日 申請(qǐng)日期2011年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月9日
發(fā)明者康貽軍, 殷仕學(xué), 程潔, 高君君 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)