專利名稱：基于腺相關(guān)病毒的山羊β-乳球蛋白基因打靶質(zhì)粒的構(gòu)建及其打靶方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體地說，是關(guān)于一種基于腺相關(guān)病毒的山羊￠-乳球蛋白基因打靶質(zhì)粒的構(gòu)建及其打靶方法。
背景技術(shù)：
按照人類的意愿對(duì)基因組進(jìn)行定向靶向修飾一直是許多科學(xué)家的夢想。在內(nèi)源的基因組上特異地刪除或加入需要的序列，一方面可以構(gòu)建各種動(dòng)物模型，用于生物學(xué)基礎(chǔ)研究和疾病機(jī)理研究，另一方面可以生產(chǎn)動(dòng)物反應(yīng)器，用于廉價(jià)生產(chǎn)人們需要而又很難從其他途徑得到的生物組分。傳統(tǒng)的基因打靶定向修飾依賴于細(xì)·胞內(nèi)自然發(fā)生的同源染色體隨機(jī)交換，然而，這種方法效率非常低，通常只有10_7。因此，這種打靶方法只有在小鼠的胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)中得到應(yīng)用，但無法應(yīng)用于體細(xì)胞和其他物種的干細(xì)胞中。腺相關(guān)病毒(AAV)屬于細(xì)小病毒科的依賴性病毒屬，是最小和最簡單的動(dòng)物病毒，也是一種具有極端寄生性的衛(wèi)星病毒。AAV通常需要腺病毒、皰疹病毒等輔助病毒的幫助，才能在其生活周期的繁殖相進(jìn)行自我復(fù)制。1998年，Russell等報(bào)道了用AAV作載體進(jìn)行基因打靶的一系列實(shí)驗(yàn)。包括AAV被用于修復(fù)人宮頸癌HeLa細(xì)胞中neo基因的復(fù)合突變，以及在HT-1080人骨肉瘤細(xì)胞和正常人成纖維細(xì)胞中介導(dǎo)單拷貝X連鎖HPRT基因的突變，并獲得了較高的打靶頻率，在最適條件下整個(gè)成纖維細(xì)胞組的大約I %在HPRT基因位點(diǎn)發(fā)生了打靶。相比之下，采用轉(zhuǎn)染或電穿孔方式獲得的基因打靶頻率范圍在10_6到10_8之間。并且，在許多打靶中，AAV介導(dǎo)的基因表達(dá)可以維持終身，充分說明了該載體的持續(xù)性。AAV載體打靶的高效率和持續(xù)穩(wěn)定的目的基因表達(dá)對(duì)基因打靶技術(shù)的發(fā)展起了很大的推動(dòng)，對(duì)科研甚至臨床應(yīng)用都有一定價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的是提供一種基于腺相關(guān)病毒為載體構(gòu)建的山羊P -乳球蛋白基因打靶質(zhì)粒及其構(gòu)建方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述山羊￠-乳球蛋白基因打靶質(zhì)粒的打靶方法。本發(fā)明提供了一種基于腺相關(guān)病毒為載體的山羊￠-乳球蛋白基因打靶質(zhì)粒，所述質(zhì)粒具有如下的序列:5’ AAV,左臂，人乳鐵蛋白cDNA, loxp-ef la-neo-pA-loxp,核糖體插入序列(IRES)，右臂3’。根據(jù)本發(fā)明，所述質(zhì)粒的載體是將pAAV-MCS質(zhì)粒的反向重復(fù)序列旁的Not I位點(diǎn)通過PCR的方法更改為BamH I位點(diǎn)獲得。根據(jù)本發(fā)明，所述質(zhì)粒除載體外的插入片段的基因順序?yàn)?5’左臂，人乳鐵蛋白cDNA, loxp-ef la-neo-pA-loxp,核糖體插入序列(IRES),右臂 3’。
根據(jù)本發(fā)明，所述左臂的序列為山羊基因組中乳球蛋白基因從翻譯起始密碼子ATG到上游366bp之間的序列。根據(jù)本發(fā)明，所述右臂的序列為山羊基因組中￠-乳球蛋白基因從翻譯起始密碼子ATG到下游380bp之間的序列。根據(jù)本發(fā)明，所述插入片段具有如SEQ ID NO:1所示的序列。本發(fā)明的基于腺相關(guān)病毒構(gòu)建的山羊￠-乳球蛋白基因打靶質(zhì)粒的打靶方法，包括以下步驟:A、將上述質(zhì)粒與pAAV-RC，pHelper共同轉(zhuǎn)染AAV-293細(xì)胞以包裝病毒；B、用上述獲得的病毒感染山羊細(xì)胞24小時(shí)；C、加G418篩選感染成功的細(xì)胞。


圖1是本發(fā)明的山羊乳球蛋白基因打靶質(zhì)粒的線性示意圖。圖2是本發(fā)明的山羊￠-乳球蛋白基因打靶質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖。圖3是pAAV_MCS質(zhì)粒不意圖。圖4是包裝AAV-mcherry病毒的AAV-293細(xì)胞的紅色熒光結(jié)果圖。圖5A是AAV-mcherry病毒滴度測定的HT1080細(xì)胞的紅色熒光結(jié)果圖。圖5B是AAV-mcherry病毒滴度測定的HT 1080細(xì)胞經(jīng)DAPI染色的紫外檢測結(jié)果圖。圖6A是G418篩選感染打靶病毒的山羊iPS克隆結(jié)果圖。圖6B是G418篩選未感染打靶病毒的山羊iPS克隆結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式以下通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不用于限定本發(fā)明的范圍。以下實(shí)施例中所使用的技術(shù)，包括PCR擴(kuò)增與檢測、細(xì)胞轉(zhuǎn)染等分子生物學(xué)技術(shù)，以及細(xì)胞培養(yǎng)、檢測技術(shù)等，除非特別說明，均為本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)；所使用的儀器設(shè)備、試劑和細(xì)胞系等，除非是本說明書特別注明，均為一般本領(lǐng)域的研究和技術(shù)人員可以通過公共途徑獲得的。實(shí)施例1、基于腺相關(guān)病毒為載體構(gòu)建山羊P -乳球蛋白基因打靶質(zhì)粒設(shè)計(jì)如下引物:1:5，GCCGGGATCCCCCAGTGCTGGCTCTGACCTG 3，；2:5， GCCGGGATCCCTCACAGGAAGAGGAAATCAGGGC 3，；

3:5， GCCGGGATCCAGGAACCCCTAGTGATGGAGT 3，；其中，引物1、2和3都具有BamH I酶切位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)室原有的打革E質(zhì)粒序列如下:leftarm (3kb)-hlf-loxp-efla-neo-pA-loxp-right arm(5kb)-me l_tk ;pAAV-MCS質(zhì)粒購自Stratagene,結(jié)構(gòu)如圖3所示。由于插入片段中含有Not I位點(diǎn)，因此將載體反向重復(fù)序列旁的Not I位點(diǎn)用PCR的方法更改為BamH I。
基于腺相關(guān)病毒為載體構(gòu)建山羊β -乳球蛋白基因打靶質(zhì)粒的具體步驟如下:如圖2所示，以本實(shí)驗(yàn)室原有的打靶質(zhì)粒為模板，1和2引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR條件為:95°C 2min，一個(gè)循環(huán)；95°C 15s，62°C 30s, 68°C 5min，35 個(gè)循環(huán)；68°C l0min，一個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增獲得大小為4809bp的插入片段，序列如下:left arm(366bp)-hlf-loxp-efla-neo-pA-loxp-right arm(380bp)；其中，左臂為山羊基因組中β-乳球蛋白基因從翻譯起始密碼子ATG到上游366bp之間的序列，hlf為人乳鐵蛋白cDNA，右臂為山羊基因組中￠-乳球蛋白基因從翻譯起始子ATG到下游380bp之間的序列。所述插入片段的序列如SEQ IDNO:1所示。以pAAV-MCS質(zhì)粒為模板，和3引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR條件為:95°C 2min, 一個(gè)循環(huán)；95°C 15s，62°C 30s, 68°C 3min，35 個(gè)循環(huán)；68°C lOmin，一個(gè)循環(huán)。PCR 擴(kuò)增獲得大小為489Ibp的AAV載體片段。將上述通過PCR獲得的AAV載體和插入片段分別用BamH I酶切，酶切產(chǎn)物用DNA純化試劑盒(購自北京天根公司，貨號(hào):DP214-03)進(jìn)行純化，然后用T41igase (購自Fermentas,貨號(hào):#EL0011)連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞,得到的質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定后和理論大小一致，表明質(zhì)粒構(gòu)建成功。實(shí)施例2、AAV病毒的包裝、轉(zhuǎn)染及滴度測定1、包裝和轉(zhuǎn)染:AAV-293細(xì)胞用DEME培養(yǎng)基培養(yǎng)，按照350萬/T75的比例鋪175培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)48h至70 80%密度時(shí)加入AAV包裝混合液，繼續(xù)培養(yǎng)12 24h后更換新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)66 72h。然后用干冰-乙醇和37°C水浴處理，來回轉(zhuǎn)換4次后室溫離心，取上清，_80°C儲(chǔ)存。轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光結(jié)果如圖4所示。所述AAV包裝混合液包括如下組分:pAAV_mcherry、pAAV-RC、pHelper質(zhì)粒各IOug,轉(zhuǎn)染試劑(Fugene) 75ul, opt1-DMEM 1.5ml。由圖4的結(jié)果可知，能在紅色熒光下觀察到感染AAV-mcherry病毒的293細(xì)胞，證明AAV病毒能有效地進(jìn)行包裝和轉(zhuǎn)染。2、滴度測定:HT1080細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基(含10%血清)培養(yǎng)，按照6萬個(gè)/孔的比例鋪24孔板，于37°C培養(yǎng)過夜。棄培養(yǎng)基，按照0,10-4,10-3,10-1的不同稀釋梯度加A 1ml的上述病毒，1 2h后加入DMEM培養(yǎng)基(含18%血清)，于37°C培養(yǎng)40 48h后加入800ug/ml的G418，繼續(xù)培養(yǎng)6天后計(jì)數(shù)或直接熒光計(jì)數(shù)，熒光結(jié)果如圖5所示。滴度計(jì)算公式如下:滴度=nX稀釋倍數(shù)；或(nX60000)/(細(xì)胞總數(shù)X微升數(shù))；其中，n代表克隆數(shù)。由圖5的結(jié)果可知，圖5A為感染AVV-mcherry病毒的HT1080細(xì)胞在紅色熒光下的克隆數(shù)，圖5B為經(jīng)DAPI染色在紫外下觀察的總細(xì)胞數(shù)，AVV-mcherry病毒體積為2ul，計(jì)算可得滴度為4.7X 106cfu/ml，證明經(jīng)包裝轉(zhuǎn)染后獲得的AVV病毒有較高的效價(jià)。實(shí)施例3、AAV病毒感染山羊iPS細(xì)朐1、確定感染復(fù)數(shù)(moi):山羊iPS細(xì)胞按照2000個(gè)/孔的比例鋪12孔板，用包裝好的pAAV-mcherry感染山羊iPS細(xì)胞進(jìn)行空載對(duì)照實(shí)驗(yàn)。按照100、500、1000、2000、4000、8000的moi梯度加入pAAV-mcherry病毒，最后確定moi為500,即每個(gè)細(xì)胞對(duì)應(yīng)加500個(gè)
有活性的病毒。
2、打靶病毒感染:山羊iPS細(xì)胞按照50萬個(gè)/孔的比例鋪12孔板，培養(yǎng)24h，加入實(shí)施例1中所述的滴度為2.5 X IO8的打靶病毒，繼續(xù)培養(yǎng)24h，加入300ug/ml的G418，培養(yǎng)8天后挑取克隆鑒定，結(jié)果如圖6所示。由圖6的結(jié)果可知，圖6A為感染病毒的山羊iPS細(xì)胞，在G418篩選下能存活，相應(yīng)地，圖6B為未感染病毒的山羊iPS細(xì) 胞對(duì)照，經(jīng)G418篩選后細(xì)胞不能存活。
權(quán)利要求
1.一種基于腺相關(guān)病毒為載體的山羊￠-乳球蛋白基因打靶質(zhì)粒，其特征在于，所述質(zhì)粒具有如下的序列:5’ AAV,左臂，人乳鐵蛋白cDNA, loxp-ef la-neo-pA-loxp,核糖體插入序列(IRES)，右臂3’。
2.按權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒，其特征在于，所述質(zhì)粒的載體是將pAAV-MCS質(zhì)粒的反向重復(fù)序列旁的Not I位點(diǎn)通過PCR的方法更改為BamH I位點(diǎn)獲得。
3.按權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒，其特征在于，所述質(zhì)粒除載體外的插入片段的基因順序?yàn)?5’左臂，人乳鐵蛋白cDNA, loxp-ef la-neo-pA-loxp,核糖體插入序列(IRES),右臂3’。
4.按權(quán)利要求3所述的左臂，其特征在于，所述左臂的序列為山羊基因組中￠-乳球蛋白基因從翻譯起始密碼子ATG到上游366bp之間的序列。
5.按權(quán)利要求3所述的右臂，其特征在于，所述右臂的序列為山羊基因組中￠-乳球蛋白基因從翻譯起始密碼子ATG到下游380bp之間的序列。
6.按權(quán)利要求3所述的插入片段，其特征在于，所述插入片段具有如SEQID N0:1所示的序列。
7.一種基于腺相關(guān)病毒為載體的山羊￠-乳球蛋白基因打靶質(zhì)粒的打靶方法，其特征在于包括以下步驟: A、將權(quán)利要求1中所述的質(zhì)粒與pAAV-RC，pHelper共同轉(zhuǎn)染AAV-293細(xì)胞以包裝病 毒； B、用上述獲得的病毒感染山羊細(xì)胞24小時(shí)； C、加G418篩選感染成功的細(xì)胞。
8.按權(quán)利要求7所述的山羊細(xì)胞，其特征在于，所述山羊細(xì)胞為山羊iPS細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于腺相關(guān)病毒為載體的山羊β-乳球蛋白基因打靶質(zhì)粒及其構(gòu)建方法。本發(fā)明還公開了所述山羊β-乳球蛋白基因打靶質(zhì)粒的打靶方法。
文檔編號(hào)C12N7/00GK103088062SQ20111035043
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2011年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月8日
發(fā)明者肖磊, 趙金龍 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院