專利名稱：一種球蛋白溶液的病毒滅活方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及病毒滅活技術(shù)，具體涉及生物制品免疫球蛋白溶 液中病毒滅活技術(shù)。
背景技術(shù)：
目前，對(duì)免疫球蛋白溶液中的病毒進(jìn)行滅活的方法有有機(jī)溶劑/清潔劑法(S/D 法)、低PH法和D50法，下面表1是各種方法的病毒滅活效果和存在的不足。表1 各種方法的病毒滅活效果和存在的不足 當(dāng)用Cohn法分離免疫球蛋白時(shí)，由于乙醇和低溫的條件有抑制、清除和殺滅病原 微生物的作用，但該作用極其有限，故不能作為一種病毒滅活方法。當(dāng)巴斯滅活法用于球蛋白病毒滅活時(shí)，回收率< 33%，因回收率過低，日趨緊張的 血源使得行業(yè)并沒有采取巴斯滅活法用于球蛋白病毒滅活。隨著血液制品在臨床上的廣泛應(yīng)用，如何保證其安全性，已成為世界醫(yī)藥衛(wèi)生界 乃至整個(gè)社會(huì)普遍關(guān)注的焦點(diǎn)。辛酸鈉，別名正辛酸鈉，英文名Sodium caprylate ；分子式CH3 (CH2) 6C00Na，辛 酸鈉屬于脂肪酸類，長期以來一直用于白蛋白溶液的穩(wěn)定劑以及某些血漿蛋白的沉淀劑， 且已被證明是安全可靠的?，F(xiàn)有技術(shù)[參見Biologicals，2003，31 (3) :213_221·]公開的辛酸鹽病毒滅活技術(shù)方案為辛酸鹽16mM，蛋白濃度10%，pH值4. 5，溫度35°C，時(shí)間1小時(shí)，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)室進(jìn) 行了條件重現(xiàn)試驗(yàn)，并對(duì)回收率作了檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示該方案的蛋白質(zhì)回收率小于10%， 蛋白質(zhì)回收率過低，沒有實(shí)用價(jià)值。血液制品對(duì)回收率的要求一直是生產(chǎn)血液制品各工藝可行性的標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)巴斯滅活 法用于球蛋白溶液病毒滅活時(shí)，蛋白質(zhì)回收率不得低于33%，但是日趨緊張的血源使得行 業(yè)并沒有采取巴斯滅活法用于球蛋白病毒滅活，因此，現(xiàn)有技術(shù)公開的技術(shù)方案由于蛋白 質(zhì)回收率過低，沒有實(shí)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的任務(wù)是提供一種球蛋白溶液的病毒滅活方法，使其具有簡(jiǎn)單、安全、快 捷、有效、蛋白質(zhì)回收率高、且不影響目的蛋白質(zhì)生物活性等特點(diǎn)。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是本發(fā)明提供的這種球蛋白溶液的病毒滅活方法，包括以下步驟1. 一種球蛋白溶液的病毒滅活方法，包括以下步驟a.計(jì)算待病毒滅活球蛋白溶液中蛋白質(zhì)的量，按辛酸鈉與待病毒滅活球蛋白溶液 中蛋白質(zhì)的重量比(mmol/g)為8 17mmol lg，優(yōu)選為14 16mmol Ig的比例計(jì)算辛 酸鈉的用量，按計(jì)算所得辛酸鈉用量稱取辛酸鈉，將稱取的辛酸鈉加入二倍于待病毒滅活 球蛋白溶液體積的稀釋液中充分溶解，配制成辛酸鈉溶液；b.用pH4. 0的醋酸緩沖液將辛酸鈉溶液的pH調(diào)至5. 0 8. 5，優(yōu)選5. 6 5. 8，將 調(diào)好PH值的辛酸鈉溶液加入待病毒滅活的球蛋白溶液中，邊加邊攪拌，配制成辛酸鈉溶液 與球蛋白溶液的混合液；C.用pH4. 0的醋酸緩沖液將辛酸鈉溶液與球蛋白溶液的混合液的pH調(diào)至4. 3 5. 5，優(yōu)選為4. 7 4. 9，置入振蕩式水浴箱，30 士 1°C保持1. 5小時(shí)后取出，澄清過濾祛除辛 酸鈉沉淀，濾液采用透析或超濾方法祛除殘留的辛酸鈉，檢測(cè)濾液中殘留的辛酸鈉含量，使 透析液或超濾液中辛酸鈉含量< 0. Olmmol。上述步驟a中所述的稀釋液是0. 9 1. 8%的NaCl溶液，也可以用注射用水作稀 釋液。在上述步驟c中，所述的檢測(cè)濾液中殘留的辛酸鈉含量的方法是采用氣相色譜法 檢測(cè)。本發(fā)明方法的全部操作要求在驗(yàn)證合格的GMP車間進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)資料〈實(shí)驗(yàn)引用標(biāo)準(zhǔn)〉《中國生物制品規(guī)程》二〇〇〇年版中國生物制品標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)《血液制品去除/滅活病毒技術(shù)方法及驗(yàn)證指導(dǎo)原則》〈實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目與目的〉1.生物活性的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)?zāi)康纳锘钚允巧镏破返闹匾獧z測(cè)項(xiàng)目，生物活性是生物制品有效性的 重要依據(jù)，生物活性的檢測(cè)就是為了觀察該實(shí)驗(yàn)是否會(huì)對(duì)生物活性產(chǎn)生影響，即實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 的合理性。
2.蛋白質(zhì)回收率的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?duì)于日趨緊張的血源和需求量日益增長的市場(chǎng)而言，蛋白質(zhì)回收率的 檢測(cè)目的是為了考察實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的可行性。3.蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡鞍踪|(zhì)的穩(wěn)定性試驗(yàn)是在一定的時(shí)間段內(nèi)，對(duì)目的蛋白質(zhì)的生物活性 及狀態(tài)進(jìn)行系列的動(dòng)態(tài)觀察，進(jìn)一步證明目的蛋白質(zhì)的生物活性的穩(wěn)定性。4.回收率的優(yōu)選實(shí)驗(yàn)?zāi)康奶嵘摪l(fā)明的實(shí)用價(jià)值。5.病毒驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)?zāi)康陌磭宜幤繁O(jiān)督管理局關(guān)于《血液制品去除/滅活病毒技術(shù)方法及驗(yàn) 證指導(dǎo)原則》對(duì)指示病毒進(jìn)行病毒滅活驗(yàn)證，考察本發(fā)明的目的是否達(dá)到。6.常用于人免疫球蛋白病毒滅活方法的比較及討論實(shí)驗(yàn)?zāi)康年U明在球蛋白病毒滅活領(lǐng)域本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)，即病毒滅活方法簡(jiǎn)單、安 全、快捷、有效。<試驗(yàn)材料與方法>1.材料靜注人免疫球蛋白，(免疫球蛋白由武漢生物制品研究所血液制劑室提供)。2.儀器和試劑檢測(cè)抗-HBs效價(jià)試驗(yàn)盒由北京北方生物技術(shù)研究所生產(chǎn)；白喉抗體國家參考品 和白喉抗體診斷血球購自中國藥品生物制品檢定所。蛋白質(zhì)的含量測(cè)定參照《中華人民共和國藥典》2005年版三部凱氏定氮法。 BUCHI-K370凱氏定氮儀由瑞士 BUCHI廠家生產(chǎn)。UV-2550型紫外分光光度計(jì)由島津公司生產(chǎn)。FM-2000型免疫計(jì)數(shù)儀產(chǎn)自西安。振蕩式水浴箱，酸度計(jì)。3.生物活性的檢測(cè)3. 1人免疫球蛋白IgG含量的測(cè)定參照《中華人民共和國藥典》2005年版三部IgG含量測(cè)定法(紫外分光光度法)。3. 2人免疫球蛋白分子大小的測(cè)定參照《中華人民共和國藥典》2005年版三部中分子排阻色譜法測(cè)定人免疫球蛋白 IgG單體加二聚體的含量。3. 3人免疫球蛋白純度的測(cè)定參照《中華人民共和國藥典》2005年版三部中醋酸纖維薄膜電泳法。3. 4白喉抗體效價(jià)的測(cè)定根據(jù)《中華人民共和國藥典》2005年版三部中人免疫球蛋白抗體效價(jià)測(cè)定法進(jìn)行 檢測(cè)。3. 5抗HBS效價(jià)的測(cè)定根據(jù)《中華人民共和國藥典》2005年版三部中RIA法進(jìn)行檢測(cè)?？笻Bs應(yīng)不低于 6.OIU/glgG。3. 6抗補(bǔ)體活性的測(cè)定
根據(jù)《中華人民共和國藥典》2005年版三部中抗補(bǔ)體活性測(cè)定法。結(jié)論經(jīng)武漢生物制品研究所質(zhì)量保證部對(duì)上述各項(xiàng)檢測(cè)，得出的試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果 均符合2005年版《中華人民共和國藥典》三部，檢測(cè)說明目的蛋白質(zhì)生物活性未受影響。4.蛋白質(zhì)回收率的檢測(cè)分別測(cè)定人免疫球蛋白在一定的病毒滅活參數(shù)條件的作用下蛋白質(zhì)的含量與未 經(jīng)五種參數(shù)處理前的蛋白質(zhì)含量，未經(jīng)五種參數(shù)處理的蛋白質(zhì)含量與經(jīng)五種參數(shù)處理后的 蛋白質(zhì)含量的百分比值為該參數(shù)條件下的蛋白質(zhì)的回收率。通過測(cè)定三批供試品中的總氮 含量以及經(jīng)鎢酸沉淀去除蛋白的供試品濾液中的非蛋白氮含量，來計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。結(jié)論經(jīng)武漢生物制品研究所質(zhì)量保證部對(duì)蛋白質(zhì)回收率的檢測(cè)，得出的試驗(yàn)檢 測(cè)結(jié)果說明，目的蛋白質(zhì)回收率大于等于90%。5.蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果20070501批、20070502批、20070503批，靜注人免疫球蛋白經(jīng)本發(fā)明提供的辛酸
鈉病毒滅活后的長期穩(wěn)定性結(jié)果分別見表2、表3、表4。(具體滅活操作過程見5.病毒滅 活)表220070501批靜注人免疫球蛋白的穩(wěn)定性 結(jié)論經(jīng)武漢生物制品研究所質(zhì)量保證部對(duì)目的蛋白穩(wěn)定性的定期檢測(cè)，結(jié)果全 部符合《中國藥典》三部(2005版)的規(guī)定要求，說明經(jīng)本發(fā)明方法處理過的目的蛋白其生 物活性的穩(wěn)定性良好。表5 《中華人民共和國藥典》2005年版三部穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果對(duì)照表 6.回收率的優(yōu)選表6當(dāng)辛酸鈉濃度為16mmol時(shí) 該組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，溫度的升高和時(shí)間的延長都會(huì)使蛋白質(zhì)的濁度升高而對(duì)回收 率則無明顯影響，辛酸鹽溶液的PH7. 6時(shí)的回收率是50%，為該實(shí)驗(yàn)組最高回收率。表 7 分析當(dāng)降低蛋白濃度至5. 5士0. 5%，溫度的升高任然會(huì)對(duì)外觀產(chǎn)生影響但對(duì)回 收率則無明顯影響，該組在辛酸鹽溶液的PH5. 8時(shí)的回收率是93%，為該實(shí)驗(yàn)組最高回收率。表8 分析繼續(xù)降低蛋白濃度至2. 5士0. 5%，溫度的升高和時(shí)間的延長還是會(huì)使蛋白 質(zhì)的濁度升高對(duì)回收率則無明顯影響，該組在辛酸鹽溶液的PH5. 6時(shí)的回收率是80%，為 該實(shí)驗(yàn)組最高回收率。表 9
8 分析當(dāng)?shù)鞍诐舛冉抵?.0士0.5%，溫度的升高和時(shí)間的延長任會(huì)使蛋白質(zhì)的濁 度升高而對(duì)回收率則無明顯影響，該組在辛酸鹽溶液的PH5. 5時(shí)的回收率是50%，為該實(shí) 驗(yàn)組最高回收率。結(jié)論從以上四組試驗(yàn)數(shù)據(jù)得出如下結(jié)論，無論待病毒滅活的球蛋白處于哪一種 濃度，辛酸鈉溶液的PH是回收率的關(guān)鍵，而溫度和時(shí)間主要影響球蛋白溶液的外觀，而對(duì) 回收率的影響不是十分明顯，關(guān)于辛酸鈉溶液PH值的控制點(diǎn)，是本發(fā)明的創(chuàng)新之一。以下表10是當(dāng)辛酸鈉處于不同濃度時(shí)，不同的稀釋液對(duì)回收率的影響，這是本發(fā) 明的創(chuàng)新之二。表 10 7.病毒滅活的驗(yàn)證由國家認(rèn)可的病毒驗(yàn)證單位——華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重 點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物病原分室分別進(jìn)行偽狂犬病毒和豬細(xì)小病毒的滅活效果驗(yàn)證。7. 1指示病毒依據(jù)國家藥品監(jiān)督管理局關(guān)于《血液制品去除/滅活病毒技術(shù)方法及驗(yàn)證指導(dǎo)原 則》的通知予以選擇。7. 2 方法將長成單層的BHK-21傳代細(xì)胞消化分散，移至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待出現(xiàn)單層細(xì)胞 后，接種下列各實(shí)驗(yàn)組的材料。7. 3試驗(yàn)組設(shè)計(jì)及驗(yàn)證方法A:酸性樣品對(duì)照即不含辛酸鈉的人免疫球蛋白半成品(酸性樣品)+指示病毒。 試驗(yàn)中，在每個(gè)滅菌EP管中，將0. 1毫升偽狂犬病毒加入到0. 9毫升不含辛酸鈉的人免疫
9球蛋白半成品，共7管。在不同時(shí)間段測(cè)定病毒的毒價(jià)，目的是觀察非辛酸鈉因素對(duì)病毒的影響。B 中性樣品即不含辛酸鈉的人免疫球蛋白半成品(中性樣品)+指示病毒。試驗(yàn) 中，在每個(gè)滅菌EP管中，將0.1毫升病毒加入到0.9毫升人免疫球蛋白(pH值中性)半成 品中，共有7管。在不同時(shí)間段測(cè)定病毒的毒價(jià)，結(jié)合A組，排除不同pH球蛋白溶液對(duì)病毒 的作用。C:辛酸鈉+人免疫球蛋白+病毒(試驗(yàn)組)在每個(gè)滅菌EP管中，將0.1毫升病 毒加入到0. 9毫升含辛酸鈉的人免疫球蛋白半成品中，共7管。在不同時(shí)間段測(cè)定病毒的 毒價(jià)，確定在設(shè)想狀態(tài)下病毒的滅活效果。D:辛酸鈉+人免疫球蛋白(酸性樣品，無病毒)在每個(gè)滅菌EP管中，將0. 1毫升 DMEM加入到0. 9毫升的試驗(yàn)樣品中(不含病毒)，共7管。觀察這試驗(yàn)樣品對(duì)細(xì)胞的影響。E 指示病毒對(duì)照在每個(gè)滅菌EP管中，將0. 1毫升病毒加入到0.9毫升DMEM培養(yǎng) 基中，共7管。在不同時(shí)間段測(cè)定病毒的毒價(jià)，觀察溫度本身是否對(duì)病毒有影響。將上述5個(gè)不同組的樣品放入30 °的水浴鍋中，在第0，5，10，30，70，90，120分鐘， 在不同組樣品中各取出1管，立即放入-80°冰箱中。從每一管中取出0. 1毫升樣品，用0. 9ml DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行10倍系列稀釋(至10_8 稀釋度)，接種96孔細(xì)胞，每個(gè)稀釋度接種8孔細(xì)胞。將接毒細(xì)胞置37°溫箱孵化，每天觀察和記錄細(xì)胞病變。按照Reed-Munich 方法計(jì)算 TCID5tl.7. 4豬細(xì)小病毒(非脂包膜病毒)驗(yàn)證病毒對(duì)照組指示病毒經(jīng)30°C作用后，其病毒滴度在0分鐘、5分鐘、10分鐘、30分 鐘、70分鐘、90分鐘、120分鐘沒有發(fā)生明顯變化，在作用5分鐘和10分鐘后，病毒滴度提高 了一個(gè) Log。陽性對(duì)照組人免疫球蛋白(酸性樣品)+病毒；人免疫球蛋白(中性樣品)+病毒 分別與細(xì)小病毒混合后，接種細(xì)胞，可觀察到細(xì)胞病變，且酸性條件對(duì)照組和中性條件對(duì)照 組對(duì)病毒的作用相當(dāng)，差別并不顯著，排除不同PH球蛋白溶液對(duì)病毒的作用；與病毒對(duì)照 組相比，酸性條件和中性條件等處理組的病毒滴度僅平均下降0. 9個(gè)Log值。陰性對(duì)照組辛酸鈉+人免疫球蛋白組，除了在10-1稀釋度對(duì)細(xì)胞有毒性外，其他 稀釋度的細(xì)胞均正常生長，總體評(píng)價(jià)辛酸鈉和人免疫球蛋白對(duì)細(xì)胞沒有損傷。試驗(yàn)組在辛酸鈉和人免疫球蛋白共存的條件下，指示病毒毒力效價(jià)為 105 4TCID50/0. Iml的細(xì)小病毒能在瞬間被滅活，即使在病毒加入后立即接種PK-15細(xì)胞測(cè) 定TCID50，仍不能出現(xiàn)細(xì)胞病變，30°C作用后5分鐘、10分鐘，直至120分鐘，接種細(xì)胞后各 組仍未出現(xiàn)細(xì)胞病變。表11不同實(shí)驗(yàn)組30°C作用后不同時(shí)間豬細(xì)小病毒效價(jià)測(cè)定 注試驗(yàn)組和陰性對(duì)照組中的“0”表示該組的細(xì)胞沒有發(fā)生細(xì)胞病變，即TCID5tl記 為0.結(jié)論華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物病原分室病毒 驗(yàn)證結(jié)論；本發(fā)明提供的含有辛酸鹽的人免疫球蛋白溶液，在酸性PH和30士 1°C條件下，試 驗(yàn)組結(jié)果顯示豬細(xì)小病毒能迅速被完全滅活，接種細(xì)胞后未觀察到細(xì)胞病變。7.5偽狂犬病毒(脂包膜病毒)驗(yàn)證病毒對(duì)照組結(jié)果與豬細(xì)小病毒類似，在作用5分鐘和10分鐘后病毒滴度提高了 一個(gè) Log {to陽性對(duì)照組結(jié)果與豬細(xì)小病毒類似，與病毒對(duì)照組相比，酸性和中性條件處理組 的病毒亦僅下降一個(gè)Log值。陰性對(duì)照組細(xì)胞正常生長，說明病毒對(duì)照組和酸性及中性的陽性對(duì)照組出現(xiàn)的 細(xì)胞病變不是由辛酸鈉和人免疫球蛋白產(chǎn)生的，總體評(píng)價(jià)辛酸鈉和人免疫球蛋白對(duì)細(xì)胞沒 有損傷。試驗(yàn)組在辛酸鈉和人免疫球蛋白共存的條件下，指示病毒毒力效價(jià)為 107-4TCID50/0. Iml的偽狂犬病毒能在瞬間被滅活，即使在病毒加入后立即接種BHK-21細(xì) 胞測(cè)定TCID50，仍不能出現(xiàn)細(xì)胞病變，30°C作用后5分鐘、10分鐘，直至120分鐘，接種細(xì)胞 后各組仍未出現(xiàn)細(xì)胞病變。表12不同實(shí)驗(yàn)組30°C作用后不同時(shí)間偽狂犬病毒效價(jià)測(cè)定
11
注試驗(yàn)組和陰性對(duì)照組中的“0”表示該組的細(xì)胞沒有發(fā)生細(xì)胞病變，即TCID5tl記 為0.結(jié)論華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物病原分室病毒 驗(yàn)證結(jié)論；武漢生物制品所提供的含有辛酸鹽的人免疫球蛋白溶液，在酸性PH和30士 1°C 條件下，根據(jù)試驗(yàn)組結(jié)果顯示偽狂犬病毒能迅速被完全滅活，接種細(xì)胞后未觀察到細(xì)胞病變。表13與現(xiàn)在常用于人免疫球蛋白病毒滅活方法的比較
病毒降低量≥4Logs，表示該步驟滅活/去除病毒有效[參見國藥監(jiān)注〔2002〕 160號(hào)文件]根據(jù)世界衛(wèi)生組織的相關(guān)規(guī)定，我國國家藥品監(jiān)督管理局已制定了《血液制品去 除/滅活病毒技術(shù)方法及驗(yàn)證指導(dǎo)原則》(國藥監(jiān)注[2002]，160號(hào))。由此可見，加強(qiáng)血液 制品的安全性問題是血液制品永恒的主題，通過加入有效的病毒去除/滅活程序，在保障 血液制品的安全性上實(shí)為一個(gè)重要的環(huán)節(jié)。在血液制品的幾種病毒滅活方法中，S/D法對(duì)脂包膜病毒的滅活效果亦較為理想， 但其也存在著一些局限性，如處理時(shí)間較長，滅活劑必須加以去除，對(duì)產(chǎn)品的回收率極生物 活性有一定的影響等。辛酸鈉作為穩(wěn)定劑用于白蛋白已有50多年的歷史，其對(duì)人體的安全 性及耐受性已無可置疑[參見 RemingtonKM，Trejo, Buczynski G, etal. Inactivation of West Nile virus, vaccinia virus and viral surrogates for relevant and emergent viralpathogens in plasma-derived products. Vox Sang,2004,87 (1) ； 10-8.]本發(fā)明通過對(duì)滅活時(shí)的各種條件如溫度、pH值、辛酸鹽濃度、蛋白質(zhì)濃度、孵放時(shí) 間進(jìn)行了大量的研究，提供了具有實(shí)用價(jià)值的辛酸鈉滅活病毒時(shí)的各種參數(shù)的最佳配比。 首先，通過生物生化等多個(gè)項(xiàng)目的檢測(cè)，其結(jié)果顯示，當(dāng)選擇16mM辛酸鈉滅活病毒時(shí)，不 影響其目的蛋白的生物活性，高回收率。又經(jīng)病毒滅活驗(yàn)證，該病毒滅活工藝對(duì)脂包膜病 毒如偽狂犬病毒的瞬間滅活率為6. 8Logs，對(duì)非脂包膜病毒如豬細(xì)小病毒的瞬間滅活率為 4. 5Logs，并且經(jīng)過細(xì)胞三代盲傳試驗(yàn)證明，病毒的確是被滅活而不是被抑制。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的球蛋白溶液的病毒滅活方法，是一種簡(jiǎn)單、安全、快捷、有 效、蛋白質(zhì)回收率高、且不影響目的蛋白質(zhì)生物活性的球蛋白溶液病毒滅活方法。血液制品的安全性日益受到人們的關(guān)注，安全有效的血液制品不僅能提高使用者 的生存質(zhì)量，而且能大大提高血液制品的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。隨著我國政府對(duì)人民健康的更加重 視，三步病毒滅活也將成為必然趨勢(shì)。總之，在保證蛋白質(zhì)的生物活性和回收率的條件下， 對(duì)病毒進(jìn)行有效滅活，不失為國內(nèi)血液制品病毒滅活的又一有效補(bǔ)充。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1取由武漢生物制品研究所提供的靜注人免疫球蛋白400ml，參照《中華人民共和國 藥典》2005年版三部凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。檢測(cè)結(jié)果蛋白質(zhì)的含量為11. 8%。滅活參數(shù)辛酸鈉濃度16mmol，待滅活蛋白質(zhì)溶液100ml，滅活時(shí)間1. 5小時(shí)，滅活 溫度30 士 1°C，辛酸鈉溶液pH 8. 5，滅活時(shí)pH 4. 9，稀釋液為0.9% NaCL溶液。滅活步驟a.計(jì)算辛酸鈉的用量按辛酸鈉與待病毒滅活球蛋白溶液中蛋白質(zhì)的重量比 (mmol/g)為 16 1 的比例計(jì)算辛酸鈉的用量為=IOOmlXll. 8% X 166X16/1000 = 31.3 克，稱取31. 3克辛酸鈉；將稱取的辛酸鈉加入200ml濃度為0. 9%的NaCL溶液中充分溶解， 配制成辛酸鈉溶液；b.用pH4. 0的醋酸緩沖液將步驟a配制的辛酸鈉溶液的pH調(diào)至8. 5，將調(diào)好pH 值的辛酸鈉溶液加入待病毒滅活的球蛋白溶液中，邊加邊攪拌，配制成辛酸鈉溶液與球蛋 白溶液的混合液；c.用pH4. 0的醋酸緩沖液將步驟b配制的辛酸鈉溶液與球蛋白溶液的混合液的 PH調(diào)至4. 8，置入振蕩式水浴箱，30士 1 °C保持1. 5小時(shí)后取出，澄清過濾祛除辛酸鈉沉淀， 濾液采用透析方法祛除殘留的辛酸鈉，采用氣相色譜法檢測(cè)濾液中殘留的辛酸鈉含量，使 透析液中辛酸鈉含量< 0. Olmmol,即完成病毒滅活，回收率20%，物理外觀呈微乳光。實(shí)施例2取由武漢生物制品研究所提供的靜注人免疫球蛋白400ml，參照《中華人民共和國 藥典》2005年版三部凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。檢測(cè)結(jié)果蛋白質(zhì)的含量為11. 8%。滅活參數(shù)辛酸鈉濃度16mmol，待滅活蛋白質(zhì)溶液100ml，滅活時(shí)間1. 5小時(shí)，滅活 溫度30 士 1°C，辛酸鈉溶液pH 5. 5，滅活時(shí)pH 4. 7，稀釋液為0.9% NaCL溶液。滅活步驟a.計(jì)算辛酸鈉的用量按辛酸鈉與待病毒滅活球蛋白溶液中蛋白質(zhì)的重量比 (mmol/g)為 16 1 的比例計(jì)算辛酸鈉的用量為=IOOmlXll. 8% X 166X16/1000 = 31.3 克，稱取31. 3克辛酸鈉，將稱取的辛酸鈉加入200ml濃度為0. 9%的NaCL溶液中充分溶解， 配制成辛酸鈉溶液；b.用pH4. 0的醋酸緩沖液將辛酸鈉溶液的pH調(diào)至5. 5，將調(diào)好pH值的辛酸鈉溶 液加入待病毒滅活的球蛋白溶液中，邊加邊攪拌，配制成辛酸鈉溶液與球蛋白溶液的混合 液；c.用pH4. 0的醋酸緩沖液將辛酸鈉溶液與球蛋白溶液的混合液的pH調(diào)至4. 7，置 入振蕩式水浴箱，30士 1°C保持1.5小時(shí)后取出，澄清過濾祛除辛酸鈉沉淀，濾液采用透析 方法祛除殘留的辛酸鈉，采用氣相色譜法檢測(cè)濾液中殘留的辛酸鈉含量，使透析液中辛酸 鈉含量< 0. Olmmol,即完成病毒滅活，回收率50%，物理外觀呈乳光。實(shí)施例3取由武漢生物制品研究所提供的靜注人免疫球蛋白400ml，參照《中華人民共和國 藥典》2005年版三部凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。檢測(cè)結(jié)果蛋白質(zhì)的含量為11. 8%。
滅活參數(shù)辛酸鈉濃度16mmol，待滅活蛋白質(zhì)溶液100ml，滅活時(shí)間1. 5小時(shí)，滅活 溫度30 士 1°C，辛酸鈉溶液pH 5.6，滅活時(shí)？!1 4. 8，稀釋液為0.9% NaCL溶液。滅活步驟a.計(jì)算辛酸鈉的用量按辛酸鈉與待病毒滅活球蛋白溶液中蛋白質(zhì)的重量比 (mmol/g)為 16 1 的比例計(jì)算辛酸鈉的用量為=IOOmlXll. 8% X 166X16/1000 = 31.3 克，稱取31. 3克辛酸鈉，將稱取的辛酸鈉加入200ml濃度為0. 9%的NaCL溶液中充分溶解， 配制成辛酸鈉溶液；b.用pH4. 0的醋酸緩沖液將辛酸鈉溶液的pH調(diào)至5. 6，將調(diào)好pH值的辛酸鈉溶 液加入待病毒滅活的球蛋白溶液中，邊加邊攪拌，配制成辛酸鈉溶液與球蛋白溶液的混合 液；c.用pH4. 0的醋酸緩沖液將辛酸鈉溶液與球蛋白溶液的混合液的pH調(diào)至4. 7，置 入振蕩式水浴箱，30士 1°C保持1.5小時(shí)后取出，澄清過濾祛除辛酸鈉沉淀，濾液采用透析 方法祛除殘留的辛酸鈉，采用氣相色譜法檢測(cè)濾液中殘留的辛酸鈉含量，使透析液中辛酸 鈉含量< 0. Olmmol,即完成病毒滅活，回收率80%，物理外觀呈微乳光。實(shí)施例4取由武漢生物制品研究所提供的靜注人免疫球蛋白400ml，參照《中華人民共和國 藥典》2005年版三部凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。檢測(cè)結(jié)果蛋白質(zhì)的含量為11. 8%。滅活參數(shù)辛酸鈉濃度16mmol，待滅活蛋白質(zhì)溶液100ml，滅活時(shí)間1. 5小時(shí)，滅活 溫度30 士 1°C，辛酸鈉溶液pH 5.8，滅活時(shí)？!1 4. 9，稀釋液(0. 9% NaCL溶液)。滅活步驟a.計(jì)算辛酸鈉的用量按辛酸鈉與待病毒滅活球蛋白溶液中蛋白質(zhì)的重量比 (mmol/g)為 16 1 的比例計(jì)算辛酸鈉的用量為=IOOmlXll. 8% X 166X16/1000 = 31.3 克，稱取31. 3克辛酸鈉，將稱取的辛酸鈉加入200ml濃度為0. 9%的NaCL溶液中充分溶解， 配制成辛酸鈉溶液；b.用pH4. 0的醋酸緩沖液將辛酸鈉溶液的pH調(diào)至5. 8，，將調(diào)好pH值的辛酸鈉溶 液加入待病毒滅活的球蛋白溶液中，邊加邊攪拌，配制成辛酸鈉溶液與球蛋白溶液的混合 液；c.用pH4. 0的醋酸緩沖液將辛酸鈉溶液與球蛋白溶液的混合液的pH調(diào)至4. 9，置 入振蕩式水浴箱，30士 1°C保持1.5小時(shí)后取出，澄清過濾祛除辛酸鈉沉淀，濾液采用透析 方法祛除殘留的辛酸鈉，采用氣相色譜法檢測(cè)濾液中殘留的辛酸鈉含量，使透析液中辛酸 鈉含量< 0. Olmmol,即完成病毒滅活，回收率93%，物理外觀呈微乳光。
權(quán)利要求
一種球蛋白溶液的病毒滅活方法，包括以下步驟a.計(jì)算待病毒滅活球蛋白溶液中蛋白質(zhì)的量，按辛酸鈉與待病毒滅活球蛋白溶液中蛋白質(zhì)的重量比(mmol/g)為8～17∶1的比例計(jì)算辛酸鈉的用量，按計(jì)算所得辛酸鈉用量稱取辛酸鈉，將稱取的辛酸鈉加入二倍于待病毒滅活球蛋白溶液體積的稀釋液中充分溶解，配制成辛酸鈉溶液；b.用pH4.0的醋酸緩沖液將辛酸鈉溶液的pH調(diào)至5.0～8.5，將調(diào)好pH值的辛酸鈉溶液加入待病毒滅活的球蛋白溶液中，邊加邊攪拌，配制成辛酸鈉溶液與球蛋白溶液的混合液；c.用pH4.0的醋酸緩沖液將辛酸鈉溶液與球蛋白溶液的混合液的pH調(diào)至4.3～5.5，置入振蕩式水浴箱，30±1℃保持1.5小時(shí)后取出，澄清過濾祛除辛酸鈉沉淀，濾液采用透析或超濾方法祛除殘留的辛酸鈉，檢測(cè)濾液中殘留的辛酸鈉含量，使透析液或超濾液中辛酸鈉含量＜0.01mmol。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于球蛋白溶液病毒滅活的方法，其特征在于，在步驟a中， 是按辛酸鈉待病毒滅活球蛋白溶液中蛋白質(zhì)的量=14 16mmol Ig的配比計(jì)算辛酸 鈉的用量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于球蛋白溶液病毒滅活的方法，其特征在于，所述的稀釋 液是注射用水。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于球蛋白溶液病毒滅活的方法，其特征在于，所述的稀釋 液是0.9 1.8%的NaCl溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于球蛋白溶液病毒滅活的方法，其特征在于，在所述的步 驟b中，是用pH4. O的醋酸緩沖液將辛酸鈉溶液的pH調(diào)至5. 6 5. 8。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于球蛋白溶液病毒滅活的方法，其特征在于，在所述的步 驟c中，是用pH4. O的醋酸緩沖液將辛酸鈉溶液與球蛋白溶液的混合液的pH調(diào)至4. 7 4. 9。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于球蛋白溶液病毒滅活的方法，其特征在于，在步驟c中， 所述的檢測(cè)濾液中殘留的辛酸鈉含量的方法是采用氣相色譜法檢測(cè)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于球蛋白溶液病毒滅活的方法，其特征在于，在步驟b中 用PH4. O的醋酸緩沖液將辛酸鈉溶液的pH調(diào)至5. 8，在步驟c中用pH4. O的醋酸緩沖液將 辛酸鈉溶液與球蛋白溶液的混合液的PH調(diào)至4. 9。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種球蛋白溶液的病毒滅活方法，本發(fā)明通過對(duì)病毒滅活時(shí)的各種條件如溫度、pH值、辛酸鹽濃度、蛋白質(zhì)濃度、孵放時(shí)間進(jìn)行了大量的研究，提供了具有實(shí)用價(jià)值的辛酸鈉滅活病毒時(shí)的各種參數(shù)的最佳配比。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的球蛋白溶液的病毒滅活方法，是一種簡(jiǎn)單、安全、快捷、有效、蛋白質(zhì)回收率高、且不影響目的蛋白質(zhì)生物活性的球蛋白溶液病毒滅活方法。
文檔編號(hào)C07K16/00GK101927011SQ200910062779
公開日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2009年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月23日
發(fā)明者葉巨兵, 張智, 彭焱, 彭良俊, 方舸, 李策生, 紐澤春, 繆燕敏, 鄒莉 申請(qǐng)人:武漢生物制品研究所