專利名稱：一種人胎盤提取液的病毒滅活方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種胎盤的消毒方法和由該方法制備的胎盤提取液，特別涉及一種應(yīng)
用化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行的消毒方法。
背景技術(shù)：
人類在戰(zhàn)勝疾病和防止過(guò)早衰老的探索中，很早就發(fā)現(xiàn)了一種能夠防止疾病和延緩衰老的特殊藥物-一紫河車即胎盤。胎盤是母體與胎兒間進(jìn)行物質(zhì)交流的器官，是胚胎與母體組織的結(jié)合體。胎兒在母體內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)全部來(lái)自胎盤，同時(shí)，母體的一些病毒如風(fēng)疹、肝炎、愛(ài)滋病毒等也會(huì)通過(guò)胎盤傳播給胎兒。所以，胎盤是一個(gè)營(yíng)養(yǎng)和病毒可能同時(shí)存在的組織。 病毒(virus)是一類個(gè)體微小，無(wú)完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)，含單一核酸(DNA或RNA)型，必須在活細(xì)胞內(nèi)寄生并復(fù)制的非細(xì)胞型微生物，由蛋白質(zhì)和核酸組成。 病毒體積非常微小，結(jié)構(gòu)極其簡(jiǎn)單，具有高度的寄生性，完全依賴宿主細(xì)胞的能量和代謝系統(tǒng)，獲取生命活動(dòng)所需的物質(zhì)和能量，離開宿主細(xì)胞，它只是一個(gè)大的化學(xué)分子，停止活動(dòng)，可制成蛋白質(zhì)結(jié)晶，為一個(gè)非生命體，遇到宿主細(xì)胞它會(huì)通過(guò)吸附、進(jìn)入、復(fù)制、裝配、釋放子代病毒而顯示典型的生命體特征，所以病毒是介于生物與非生物的一種原始的生命體。 病毒雖然不具有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，但是病毒同所有生物一樣，具有遺傳、復(fù)制、變異、進(jìn)化等生命特征。病毒根據(jù)其遺傳物質(zhì)組成及其復(fù)制方式分為DNA病毒、RNA病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒。其中DNA病毒很少，基本上都是RNA病毒。DNA病毒只要細(xì)胞表面有合適的受體，就能夠通過(guò)胞吞或膜融合的方式進(jìn)入細(xì)胞；RNA病毒的遺傳信息保存在RNA上，因此復(fù)制過(guò)程通常發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中。RNA病毒是用其自身的RNA復(fù)制酶來(lái)對(duì)基因組進(jìn)行復(fù)制；反轉(zhuǎn)錄病毒基因組的復(fù)制是采用反轉(zhuǎn)錄的方式來(lái)完成的，即利用RNA模板來(lái)合成DNA。遺傳物質(zhì)為RNA的反轉(zhuǎn)錄病毒以DNA為中間物來(lái)復(fù)制其基因組，而遺傳物質(zhì)為DNA的反轉(zhuǎn)錄病毒則以RNA為中間物來(lái)復(fù)制。反轉(zhuǎn)錄病毒常?？梢詫⑼ㄟ^(guò)反轉(zhuǎn)錄合成的DNA整合到宿主細(xì)胞的基因組中。 雖然胎盤具有抑制皮炎及抗過(guò)敏；溶解老化的角質(zhì)、美化肌膚；修復(fù)受損的器官及皮膚組織；增強(qiáng)生理功能、提高免疫力，制造抗體；調(diào)節(jié)和平衡內(nèi)分泌，延長(zhǎng)青春期；增加微循環(huán)，提高新陳代謝水平等，被稱為"神秘萬(wàn)能藥"，對(duì)人類防治疾病，提高健康水平，消除亞健康狀態(tài)，延長(zhǎng)生命和提高生命(生活)質(zhì)量等功能，但是由于胎盤中可能含有病毒，胎盤可能會(huì)對(duì)使用者的健康造成危害。因?yàn)樘ケP在隨胎兒離開母體的過(guò)程中，很可能會(huì)受到多種具有傳染性的病毒的污染，艾滋病、梅毒、乙型肝炎等病毒都可以通過(guò)胎盤傳播，而且有一些病毒在沸水中不能被殺死。因此對(duì)胎盤中可能存在的病毒進(jìn)行滅活具有重要的意義。 國(guó)內(nèi)外已研究開發(fā)出一些血液病毒滅活技術(shù)，如巴斯德液態(tài)加熱法、有機(jī)溶劑，清潔劑法、光敏劑(如亞甲藍(lán))，光照法和紫外線/補(bǔ)骨脂法。但現(xiàn)有血液制品中病毒滅活技術(shù)，大多只能滅活脂包膜病毒等，而對(duì)非脂包膜病毒無(wú)效。世界上已發(fā)現(xiàn)了能在124t:的高
溫度條件下生長(zhǎng)的細(xì)菌，大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DNA在10(TC的條件下不會(huì)斷裂。世界上現(xiàn)有
的病毒滅活技術(shù)的原理，不是特異性地針對(duì)病毒核酸，因此對(duì)病毒核酸的作用較小。 因此，只有加強(qiáng)胎盤篩查與加強(qiáng)滅活病毒相結(jié)合，才能達(dá)到胎盤使用安全的目的。
鑒于目前滅活病毒的方法的局限性、胎盤中可能存在未知病毒、目前病毒滅活效果的評(píng)價(jià)
的不準(zhǔn)確性等原因，尋求和開發(fā)一種理想的嶄新的病毒滅活方法，就具有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)上述現(xiàn)有問(wèn)題提供一種人胎盤提取液中病毒滅活的方法和由該方法制備的病毒滅活的人胎盤提取液。本發(fā)明的人胎盤提取液病毒滅活方法中核酸酶與水不溶性大分子固體材料載體結(jié)合形成固定化酶，穩(wěn)定性高，本發(fā)明的人胎盤提取液病毒滅活方法，高效、高選擇性、催化反應(yīng)條件溫和、無(wú)污染、低成本、容易操作、酶可以反復(fù)利用。 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明一方面提高一種胎盤提取液的病毒滅活方法，包
括使胎盤提取液與固定化的核酸酶進(jìn)行酶解反應(yīng)。 其中，所述的核酸酶為牛胰腺核糖核酸酶A。 本發(fā)明另一方面提高一種胎盤提取液病毒滅活方法，包括如下順序進(jìn)行的步驟
1)采用Trizol RNA抽提試劑提取牛胰腺的總RNA ;
2)牛胰腺的總RNA的RT-PCR擴(kuò)增； 3)將牛胰腺總RNA的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到細(xì)菌中，制備牛核糖核酸酶A的表達(dá)細(xì)菌； 4)對(duì)牛核糖核酸酶A的表達(dá)細(xì)菌進(jìn)行誘導(dǎo)處理，然后將細(xì)菌破碎細(xì)胞產(chǎn)生的核酸酶與水不溶性材料固定，獲得固定化牛核糖核酸酶A ; 5)胎盤提取液病毒與固定化牛核糖核酸A進(jìn)行酶解反應(yīng)，而滅活。 其中，步驟1)中所述的牛胰腺總RNA按照如下步驟提取得到 A)向牛胰腺組織中加入Trizol RNA抽提試劑，反復(fù)吹打牛胰腺組織至液體中無(wú)
細(xì)胞團(tuán)塊，制得牛胰腺組織混合物； B)將牛胰腺組織混合物進(jìn)行勻漿處理，向勻漿液中加入氯仿后進(jìn)行離心處理，獲得第一上清液； C)向第一上清液中加入異丁醇后進(jìn)行離心處理，獲得第二沉積物；
D)向第二沉積物中加入乙醇溶液，然后進(jìn)行離心處理，獲得牛胰腺總RNA。
特別是，步驟D)中所述乙醇溶液為體積質(zhì)量百分比濃度為75X的DEPC水溶液，其中，DEPC水溶液的體積質(zhì)量百分比濃度為1%。。 其中，步驟2)中所述牛胰腺總RNA的RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)包括如下進(jìn)行的步驟
A)將牛胰腺總RNA與Oligo (dT) 15、dNTP、RNasin、M_MLV反轉(zhuǎn)錄酶混合，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得逆轉(zhuǎn)錄RNA; B)向逆轉(zhuǎn)錄RNA中加入MgCl2、 dNTP、上游引物、下游引物、cDNA模板、Taq酶和水混合均勻后，進(jìn)行所述的RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，獲得牛胰腺RNA的RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物。
其中，步驟3)中所述牛核糖核酸酶A表達(dá)細(xì)菌按照如下步驟獲得
A)用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRl、限制性核酸內(nèi)切酶Hindi 11酶水解牛胰腺RNA的RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物和pET28a質(zhì)粒，獲得牛胰腺RNA的PCR產(chǎn)物DNA片段和pET28a載體DNA片段； B)將T4 DNA連接酶加入到牛胰腺RNA的PCR產(chǎn)物DNA片段、pET28a載體DNA片段中，進(jìn)行連接反應(yīng)，獲得牛胰腺DNA連接物； C)將牛胰腺DNA連接物置于于大腸桿菌的培養(yǎng)基中，進(jìn)行大腸桿菌的培養(yǎng)，獲得牛核糖核酸酶A的表達(dá)細(xì)菌。 其中，步驟4)中所述固定牛核糖核酸酶A包括如下步驟進(jìn)行 A)在牛核糖核酸酶A表達(dá)細(xì)菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，加入誘導(dǎo)劑異丙基-I3 -D-硫代半
乳糖苷，進(jìn)行誘導(dǎo)處理，獲得牛核糖核酸酶A表達(dá)細(xì)菌細(xì)胞； B)牛核糖核酸酶A表達(dá)細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行超聲處理，使細(xì)胞破碎后，進(jìn)行離心處理，收集上清液，獲得牛核糖核酸酶A粗酶液； D)將牛核糖核酸酶A粗酶液通過(guò)Ni-NTA柱，牛核糖核酸酶A固定于Ni-NTA柱上，獲得固定化牛核糖核酸酶A。 其中，步驟5)中所述胎盤提取液病毒核酸酶解滅活為使胎盤提取液與固定化牛核糖核酸酶A接觸，胎盤提取液中病毒的核酸被牛核糖核酸酶A酶解而滅活，制得病毒滅活胎盤提取液。 其中，所述胎盤提取液病毒滅活方法還包括將固定化牛核糖核酸酶A用生理鹽水清洗，使固定化牛核糖核酸酶A再生。 本發(fā)明再一方面提高一種按照上述病毒滅活方法使胎盤提取液中病毒滅活的胎盤提取液。 本發(fā)明的胎盤提取液病毒滅活方法具有如下優(yōu)點(diǎn) 1、本發(fā)明的胎盤提取液病毒滅活方法采用基因工程技術(shù)，克隆和高效表達(dá)RNA酶，使得核酸酶滅活病毒的效率高，選擇性高、催化反應(yīng)條件溫和、無(wú)污染、低成本、容易操作、酶的穩(wěn)定性提高，酶可以反復(fù)利用。 2、本發(fā)明的胎盤提取液病毒滅活方法用物理的或化學(xué)的方法，將核酸酶與水不溶性大分子固體材料載體結(jié)合，使得RNA酶固定化，提高了 RNA酶的穩(wěn)定性，使得RNA酶能夠反復(fù)利用，降低了胎盤提取液的生產(chǎn)成本。 3、本發(fā)明的胎盤提取液病毒滅活方法特異性地針對(duì)病毒核酸，能夠高效、高選擇性、完全消化RNA和DNA，催化反應(yīng)條件溫和、徹底排除病毒污染。 4、本發(fā)明的胎盤提取液病毒滅活方法中核酸酶固定后被限制在一定區(qū)域內(nèi)，酶解反應(yīng)完畢后酶不進(jìn)入液相，易從反應(yīng)系統(tǒng)中將酶分離出來(lái)，無(wú)任何酶殘留。反應(yīng)產(chǎn)物為小分子核酸，無(wú)污染，保證了酶反應(yīng)的安全性。
具體實(shí)施例方式
— 、器具、試劑、緩沖液、凝膠、材料的準(zhǔn)備
1、器具處理 1、塑料制品(包括移液槍槍頭、EP管、勻漿管) 先將塑料制品逐個(gè)浸泡于體積百分比濃度為1%。的DEPC(焦碳酸二乙酯)水中，其中移液槍的小槍頭用吸管打入DEPC水，浸泡過(guò)夜，然后加熱升溫至125°C ，保溫處理30分鐘。將高溫處理后的塑料制品烤干，備用，其中實(shí)驗(yàn)前將槍頭、EP管等放入吸頭臺(tái)，再于125t:下保溫處理30分鐘。 2、玻璃制品將剝離制品浸泡在體積百分比濃度為1%的稀鹽酸溶液中，浸泡過(guò)夜，沖洗干凈，再浸泡于體積百分比濃度為1。；的DEPC(焦碳酸二乙酯)水中過(guò)夜，然后加熱升溫至125t:，保溫處理30分鐘，最后蒙錫紙烤干備用。 3、勻漿器(剪刀、鑷子)先清水洗凈后，再加熱升溫至125°C ，保溫處理30分鐘。
2、試劑配制 1、DEPC水將lmlDEPC放入1000ml雙蒸水中，配成體積百分比濃度為1%。的DEPC水，靜置4小時(shí)備用。 2、75%乙醇將無(wú)水乙醇加入到1%。的DEPC水中，混合均勻，-2(TC保存，備用，其
中，無(wú)水乙醇與1%。的DEPC水的體積之比為75 : 100， 1%。的DEPC水為在125"下，保溫處
理30分鐘的滅菌水。 3、異丙醇放入棕色瓶中，備用 4、氯仿放入棕色瓶中，備用 5、瓊脂糖 3、緩沖液配制 1、電泳緩沖液 5 X TBE (貯存液):將Tris-CL 54g，硼酸27. 5g， 0. 5M EDTA 20ml (pH8. 0)溶解到蒸溜水1000ml中，混勻。 再將5XTBE稀釋10倍，制成0. 5XTBE在電泳時(shí)使用(即工作液濃度)，例如取50ml的5XTBE貯存液加入到450ml水中，制成500ml工作緩沖液，即為0. 5XTBE。
2、上樣緩沖液 6X上樣緩沖液將O. 25%溴酚藍(lán)，0. 25%二甲苯青FF， 30%甘油混合均勻，在4°C保存，備用。 4、瓊脂糖凝膠配制 1、配制1. 0%的瓊脂糖凝膠 將瓊脂糖加入到電泳緩沖液中，攪拌均勻，置于微波爐中，加熱至沸騰，瓊脂熔化，然后冷卻至6(TC時(shí)加入10mg/ml的溴化乙錠溶液，充分混勻后倒入已置好梳子的膠膜中，在室溫下放置30-45min，備用，其中，每100ml電泳緩沖液中加入1. Og的瓊脂糖，每100ml電泳緩沖液中加入2. 5 iU的溴化乙錠。
2、1.5%的瓊脂糖凝膠 除了瓊脂糖的用量為1.5g之外，其余與配制1.0%的瓊脂糖凝膠相同。
5、材料 Taq DNA聚合酶(含MgCl2緩沖液)200u， Promega公司 dNTP (即三磷酸脫氧核糖核苷)，dNTP包括dATP、 dGTP、 dTTP、 dCTP : 1支，Promega公司 oligo (dT) 15 (即寡聚脫氧胸苷酸):重量1. OOD， Promega公司
M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1支，Promega公司；
7[OO71]Rnasin(RNA酶抑制劑)1支，-20。C下貯存，Promega公司[OO72]DEPC(焦碳酸二乙酯)5g Promega公司 Trizol RNA抽提試劑100ml/l瓶，-4"C下貯存，Invitrogen Lifetechnologies公司 E. clli. DH5a大腸桿菌菌株；E. coli. ER2256大腸桿菌菌株，NEB公司。
pET28a質(zhì)粒Invi trogen公司。 限制性核酸內(nèi)切酶EcoRl、限制性核酸內(nèi)切酶Pstl :NEB公司
T4 DNA連接酶大連TAKARA公司 核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物(核酸分子量Marker):大連TAKARA公司。 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)物(蛋白質(zhì)分子量Marker)包含了 14. 4kD、 18. 4kD、25. OkD、
35. 0kD、45. 0kD、66. 2kD、116kD共7種純化的蛋白質(zhì):NEB公司。 6、弓|物，Invitrogen公司 上游弓l物5' -gaattcatgaggggcaccaggctgatg-3' 下游引物5' -aagcttTTATGTCAG CGTCACCTCC AC-3' 引物各合成重量50D，加1。；DEPC水稀釋，使引物含量為10pmol/iU。 二、提取總RNA 1、向去皮，去除脂肪包膜的牛胰腺組織，加入Trizol RNA抽提試劑后，用加樣器反復(fù)吹打去皮，去除脂肪包膜的牛胰腺組織，直到液體中無(wú)細(xì)胞團(tuán)塊，制得牛胰腺組織混合物； 2、向勻漿器中加入牛胰腺組織混合物，高速攪拌后制得牛胰腺組織勻漿液，接著將牛胰腺組織勻漿液轉(zhuǎn)至EP管內(nèi)，密閉后上下顛倒混勻，然后在2(TC的室溫下放置5分；
3、向EP管內(nèi)加入氯仿，密閉后上下顛倒混勻，然后在20°C的室溫下放置5分；
4、將經(jīng)過(guò)氯仿處理的牛胰腺組織勻漿液置于離心機(jī)中進(jìn)行第一次離心分離處理，去除第一沉積物，獲得第一上層清液，離心處理的溫度為4t:轉(zhuǎn)速為14000rpm，離心處理時(shí)間為15分鐘； 5、向第一上清液中加入異丙醇混勻后，置于2(TC的室溫放置10分鐘，然后在4°C
下進(jìn)行第二次離心分離處理，去除第二上清液，獲得第二沉積物，其中，第一上層清液與異
丙醇的體積之比為1 : l，第二次離心處理的轉(zhuǎn)速為14000rpm，時(shí)間為10分鐘； 6、向第二沉積物中加入用1%。 DEPC水配成的75%乙醇混合均勻，然后在4。C下進(jìn)
行第三次離心分離處理，去除第三上清液，獲得第三沉積物(即牛胰腺總RNA)，其中，75X
的乙醇溫度為4。C，第三次離心處理的轉(zhuǎn)速為10000rpm，時(shí)間為5分鐘； 7、將第三沉積物置于20°C的室溫下放置，空氣干燥5-10分鐘后加入到1%。 DEPC
水中，溶解均勻，制得牛胰腺總RNA溶液。 三、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 1、將牛胰腺總RNA溶液與濃度為0. 05ii g/iU的Oligo(dT) 15混勻后，加熱至7(TC，在7(TC下加熱處理5分鐘，獲得RNA-01igo溶液，其中牛胰腺總RNA溶液與濃度為0.05iig/ii1的01igo(dT)15的體積之比為23 : 4; 2、將裝有RNA-01igo溶液的容器置于冰水中進(jìn)行冰水浴，放置5分鐘后加入M-MLV5XBuffer、 dNTP、 RNasin、 M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，混合均勻，獲得逆轉(zhuǎn)錄混合液，其中M-MLV
85XBuffer、dNTP的濃度為10mM、Rnasin的濃度為40U/ y 1、M_MLV反轉(zhuǎn)錄酶的濃度為200U/ii 1， RNA-01 igo溶液、M-MLV 5XBuffer、 dNTP、 RNasin、 M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶的體積之比為
27 : 8 : 2 : i : 2 ; 3、將逆轉(zhuǎn)錄混合液置于離心機(jī)中進(jìn)行離心處理，獲得逆轉(zhuǎn)錄混合物，離心處理的溫度為4t:，轉(zhuǎn)速為6000rpm，離心處理時(shí)間為1分鐘； 4、將裝有逆轉(zhuǎn)錄混合物的容器置于42°C的水中進(jìn)行水浴，水浴60分鐘后，置于溫度為95°C的水中進(jìn)行水浴，水浴10分鐘，然后取出，獲得逆轉(zhuǎn)錄RNA，逆轉(zhuǎn)錄RNA在4t:保存，備用。 四、PCR反應(yīng) 1、向逆轉(zhuǎn)錄RNA中加入Taq 10XBuffer、濃度為25mM的MgCl"濃度為10mM的dNTP、濃度為10pmol/ii1的上游引物、濃度為10pmol/ii1的下游引物、cDNA模板、濃度為2. 5U/ ii 1的Taq酶和水混合均勻，獲得PCR反應(yīng)混合液； 2、將PCR反應(yīng)混合液于97t:下保溫處理10分鐘，然后取出，立即置于冰水中進(jìn)行冰水浴，冰水浴時(shí)間為2分鐘； 3、將冰水浴處理后的PCR混合液置于PCR反應(yīng)儀(Bio-Red公司)中，進(jìn)行PVCR反應(yīng)，獲得PCR反應(yīng)產(chǎn)物(即牛核糖核酸酶A的cDNA)，其中，PCR反應(yīng)產(chǎn)物于4"C保存，PCR反應(yīng)儀的設(shè)定條件為 預(yù)變性處理溫度為95°C ，預(yù)變性處理時(shí)間為5分鐘
變性處理溫度為50°C ，變性處理時(shí)間為40秒鐘
退火處理溫度為50°C ，退火處理時(shí)間為40秒鐘
延伸處理溫度為50°C ，延伸處理時(shí)間為40秒鐘
反應(yīng)循環(huán)次數(shù)為40次
在72t:下進(jìn)行終末延伸處理7分鐘； 將PCR反應(yīng)產(chǎn)物與溴芬蘭混勻后，置于電泳儀中，進(jìn)行電泳處理，其中電泳的電流為10mA，電源IOOV，電泳處理時(shí)間10分鐘；檢測(cè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物的濃度和分子量。
五、克隆 1、按照分子克隆II的方法提取pET28a質(zhì)粒； 2 、用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRl 、限制性核酸內(nèi)切酶Hindi 11分別酶水解RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物和pET28a質(zhì)粒，獲得PCR產(chǎn)物DNA片段和pET28a載體DNA片段；
3、將PCR產(chǎn)物DNA片段與pET28a載體DNA片段混合后，加入T4DNA連接酶，進(jìn)行連接反應(yīng)，獲得DNA連接物；4、將DNA連接物接種于E. coli ER 2566菌的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，DNA連接物轉(zhuǎn)入E.coli ER 2566菌株中，培養(yǎng)獲得牛核糖核酸酶A的表達(dá)細(xì)菌。
六、核酸酶固定 1、將重組表達(dá)細(xì)菌(即牛核糖核酸酶A表達(dá)細(xì)菌)接種到LB培養(yǎng)基中，于37t:下培養(yǎng)約10小時(shí)，到生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)中期，接著向培養(yǎng)液中加入摩爾濃度為0. 9mM的IPTG(異丙基-13 -D-硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)處理，誘導(dǎo)處理3. 5-4小時(shí)，然后將誘導(dǎo)處理后的培養(yǎng)液在4t:下進(jìn)行離心處理，獲得表達(dá)細(xì)菌細(xì)胞，其中離心處理轉(zhuǎn)速為6000rpm，離心時(shí)間為10min ;
2、用50mM的PIPES緩沖液(pH7. 0)洗滌表達(dá)細(xì)菌細(xì)胞2次后，再將表達(dá)細(xì)菌細(xì)胞 加入到PIPES緩沖液(pH7. 0)中，制成懸浮細(xì)胞液； 3、將懸浮細(xì)胞液試管置于冰水中，接著放置到超聲儀中，進(jìn)行超聲處理，使細(xì)胞破 碎，得到破碎的細(xì)菌細(xì)胞，其中，超聲處理的輸出功率250W、工作頻率24KHz。
4、將破碎的細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行離心處理，收集上清液，得到粗酶液，其中，離心處理轉(zhuǎn) 速為10000rpm，離心時(shí)間30分鐘; 5、分別依次用20mM Tris-HCl buffer(pH 8.0)、300mM NaCl禾P 10mM咪唑沖洗 Ni-NTA柱，平衡Ni-NTA柱； 6、將粗酶液過(guò)Ni-NTA柱，依次用20mM Tris-HCl buffer(pH 8.0)、300mM NaCl禾口 10mM咪唑進(jìn)行洗脫，去除雜蛋白，獲得RNA固定化酶； 7、采用濃度為12%的SDS-PAGE檢查固定化酶的純度，固定化酶的純度為 90% -99%。 七、胎盤病毒滅活 1、將附著有RNA固定化酶的Ni-NTA的小顆粒固體填料，裝入層析柱中，獲得核酸 固定化酶柱； 2、將胎盤提取液緩慢通過(guò)固定化酶柱，柱上固定的核酸酶與病毒核酸相遇時(shí)，病 毒粒子的核酸被酶解成小核酸分子，將胎盤提取液中的病毒滅活，制得病毒滅活胎盤提取 液，其中胎盤提取液通過(guò)固定化酶柱的流速為l-100ml/min ;
用生理鹽水清洗固定化酶柱，可讓固定化酶再生。
10
權(quán)利要求
一種胎盤提取液的病毒滅活方法，包括使胎盤提取液與固定化的核酸酶進(jìn)行酶解反應(yīng)。
2. —種胎盤提取液的病毒滅活方法，包括如下順序進(jìn)行的步驟1) 采用Trizol RNA抽提試劑提取牛胰腺的總RNA ;2) 牛胰腺的總RNA的RT-PCR擴(kuò)增；3) 將牛胰腺總RNA的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到細(xì)菌中，制備牛核糖核酸酶A的表達(dá)細(xì)菌；4) 對(duì)牛核糖核酸酶A的表達(dá)細(xì)菌進(jìn)行誘導(dǎo)處理，然后將細(xì)菌破碎細(xì)胞產(chǎn)生的核酸酶與水不溶性材料固定，獲得固定化牛核糖核酸酶A ;5) 胎盤提取液病毒與固定化牛核糖核酸A進(jìn)行酶解反應(yīng)，而滅活。
3. 如權(quán)利要求2所述的滅活方法，其特征是，步驟1)中牛胰腺總RNA按照如下步驟提取得到A) 向牛胰腺組織中加入Trizol RNA抽提試劑反復(fù)吹打牛胰腺組織至液體中無(wú)細(xì)胞團(tuán)塊，制得牛胰腺組織混合物；B) 將牛胰腺組織混合物進(jìn)行勻漿處理，向勻漿液中加入氯仿，然后進(jìn)行離心處理，獲得第一上清液；C) 向第一上清液中加入異丁醇，然后進(jìn)行離心處理，獲得第二沉積物；D) 向第二沉積物中加入乙醇溶液，然后進(jìn)行離心處理，獲得牛胰腺總RNA。
4. 如權(quán)利要求3所述的滅活方法，其特征是步驟D)中所述乙醇溶液為體積質(zhì)量百分比濃度為75%的DEPC水溶液，其中，DEPC水溶液的體積質(zhì)量百分比濃度為1%。。
5. 如權(quán)利要求2或3所述的滅活方法，其特征是步驟2)中所述牛胰腺總RNA的RT-PCR擴(kuò)增包括如下進(jìn)行的步驟A) 將牛胰腺總RNA與Oligo(dT) 15、dNTP、RNasin、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶混合，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得逆轉(zhuǎn)錄RNA;B) 向逆轉(zhuǎn)錄RNA中加入MgCl2、 dNTP、上游引物、下游引物、cDNA模板、Taq酶和水混合均勻后，進(jìn)行所述的RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，獲得牛胰腺RNA的RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物。
6. 如權(quán)利要求2或3所述的滅活方法，其特征是步驟3)中所述牛核糖核酸酶A表達(dá)細(xì)菌按照如下步驟獲得A) 用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRl、限制性核酸內(nèi)切酶Hindin酶水解牛胰腺RNA的RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物和pET28a質(zhì)粒，獲得牛胰腺RNA的PCR產(chǎn)物DNA片段和pET28a載體DNA片段；B) 將T4DNA連接酶加入到牛胰腺RNA的PCR產(chǎn)物DNA片段、pET28a載體DNA片段中，進(jìn)行連接反應(yīng)，獲得牛胰腺DNA連接物；C) 將牛胰腺DNA連接物置于于大腸桿菌的培養(yǎng)基中，進(jìn)行大腸桿菌的培養(yǎng)，獲得牛核糖核酸酶A的表達(dá)細(xì)菌。
7. 如權(quán)利要求2或3所述的滅活方法，其特征是步驟4)中所述固定牛核糖核酸酶A包括如下步驟進(jìn)行A)在牛核糖核酸酶A表達(dá)細(xì)菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，加入誘導(dǎo)劑異丙基-I3 -D-硫代半乳糖苷，進(jìn)行誘導(dǎo)處理，獲得牛核糖核酸酶A表達(dá)細(xì)菌細(xì)胞；B)牛核糖核酸酶A表達(dá)細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行超聲處理，使細(xì)胞破碎后，進(jìn)行離心處理，收集上 清液，獲得牛核糖核酸酶A粗酶液；D)將牛核糖核酸酶A粗酶液通過(guò)Ni-NTA柱，牛核糖核酸酶A固定于Ni-NTA柱上，獲得 固定化牛核糖核酸酶A。
8. 如權(quán)利要求2或3所述的滅活方法，其特征是步驟5)中所述胎盤提取液病毒核酸酶 解滅活為使胎盤提取液與固定化牛核糖核酸酶A接觸，胎盤提取液中病毒的核酸被牛核糖 核酸酶A酶解而滅活，制得病毒滅活胎盤提取液。
9. 如權(quán)利要求2或3所述的滅活方法，其特征是還包括將固定化牛核糖核酸酶A用生 理鹽水清洗，使固定化牛核糖核酸酶A再生。
10. —種胎盤提取液，其特征是按照如權(quán)利要求1-9任一所述病毒滅活方法使胎盤提 取液中病毒滅活而成。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種胎盤提取液病毒滅活方法，包括如下順序進(jìn)行的步驟1)采用Trizol RNA抽提試劑提取牛胰腺的總RNA；2)牛胰腺的總RNA的RT-PCR擴(kuò)增；3)克隆制備牛核糖核酸酶A的表達(dá)細(xì)菌；4)牛核糖核酸酶A固定；5)胎盤提取液病毒核酸酶解滅活。本發(fā)明方法采用基因工程技術(shù)，克隆和高效表達(dá)RNA酶，并將RNA酶固定化，使胎盤提取液通過(guò)固定化RNA酶，使得胎盤提取液中的病毒粒子的核酸被特異性的酶解而失活，達(dá)到純化胎盤提取液的目的，本發(fā)明方法高效、高選擇性、催化反應(yīng)條件溫和、無(wú)污染、低成本、容易操作、酶可以反復(fù)利用，產(chǎn)品單一。
文檔編號(hào)A61K35/48GK101716357SQ20091021033
公開日2010年6月2日 申請(qǐng)日期2009年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月30日
發(fā)明者葛龍海 申請(qǐng)人:葛龍海