專利名稱：表達乙肝病毒包膜中蛋白轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)方法及產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及表達乙型肝炎病毒包膜中蛋白轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)方法，并進而通過直接食用或腸道給藥的方式利用這些含有乙型肝炎病毒包膜中蛋白的轉(zhuǎn)基因植物及其衍生物從而引起人或哺乳動物對該抗原蛋白的免疫應(yīng)答反應(yīng)。
乙型肝炎(HBV)是一種廣泛傳播、世界性分布的傳染性疾病，根據(jù)世界衛(wèi)生組織1996年的報告，1995年全世界死于乙型肝炎的人數(shù)約有110萬，居各種傳染病死亡人數(shù)的第四位，而且近年來有逐漸增加的趨勢。中國也是乙型肝炎的高發(fā)區(qū)，50-70％的人群受過HBV的感染，全國至少有1.2億人為乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)攜帶者，其中顯現(xiàn)臨床癥狀的病人約有3千萬人。
乙型肝炎病毒的感染，不僅可以引起急、慢性病毒性肝炎，而且還與肝硬化和肝細胞癌的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。乙肝病毒的頑固性和多途徑的易傳性，使乙肝成為一個嚴重的公共衛(wèi)生問題。迄今為止，由于仍缺乏根治乙型肝炎的特效藥，因此，在日常生活中，如何保護健康人群，預防乙型肝炎的發(fā)生就成為人們要考慮的主要問題之一。
預防乙型肝炎的發(fā)生現(xiàn)在可以選擇注射疫苗，目前廣泛使用的乙肝疫苗依其來源可分為血源性的和基因重組多肽疫苗兩類。
血源性的乙肝疫苗最初是從無癥狀的乙肝病毒攜帶者的血漿中提取22nm的病毒球形蛋白顆粒(HBsAg)，經(jīng)福爾馬林滅活或加熱滅活制備而成的。1982年，美國和法國率先在高危人群和醫(yī)務(wù)人員中推廣使用血源性的乙肝疫苗，并取得了很好的預防效果。但是，應(yīng)該指出，在使用血源性乙肝疫苗過程中還存在著一些問題有待解決(1)安全性由于乙肝病毒不能在人工組織培養(yǎng)基中增殖，疫苗來源最初是從無癥狀的乙肝病毒攜帶者的血漿中提取22nm的球形蛋白顆粒(HBsAg)經(jīng)福爾馬林滅活或加熱滅活制備而成，盡管大規(guī)模地接種已經(jīng)證實其是安全的，但接種者還是擔心疫苗可能沒有被完全滅活或污染有其它的病毒和致病因子。
(2)血源來源有限由于乙肝表面抗原攜帶者不是健康人群，不宜長期持續(xù)取血供生產(chǎn)乙肝疫苗使用，因此，生產(chǎn)疫苗的血源來源有限。
(3)價格昂貴由于其制備過程、工藝要求嚴格，造成價格長期居高不下。盡管最近幾年乙肝疫苗的成本和接種費用在逐漸減少，但兒童一劑接種費用在加拿大仍在12-28美元之間，在美國為7美元，中國約需40元人民幣。
(4)接種也較麻煩，需經(jīng)多次注射，且會引起局部疼痛和其它不適如發(fā)燒、惡心、嘔吐、腹痛和腹瀉等。
鑒于存在上述問題，中國衛(wèi)生部在1997年10月已下文停止了血源性乙肝疫苗的生產(chǎn)和使用。
隨著DNA重組技術(shù)的發(fā)展，在原核生物(大腸桿菌和芽胞桿菌)和真核生物(多種鼠LM細胞、Hala和酵母細胞)中表達HBsAg及HBcAg獲得了成功。1986年，第一個基因工程疫苗-酵母菌表達的重組乙肝疫苗在美國被批準使用。中國也在九十年代初期研制成功了具有世界先進水平的基因工程重組乙肝疫苗。但這類疫苗仍需多次接種，價格較高，且一些人群在接種后不能夠產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。
對乙型肝炎病毒粒體結(jié)構(gòu)組成的研究表明，其最外層的包膜含有三種蛋白，依據(jù)分子量的大小，分別稱謂主要蛋白、中蛋白和大蛋白(1)。
主要蛋白也稱小蛋白，由226個氨基酸殘基組成，由S基因編碼，是病毒包膜及亞單位顆粒(HBsAg)的主要成分，因其分子量最小，因此稱之為小蛋白。小蛋白是一種疏水性蛋白，包括糖基化的GP27和非糖基化的P24兩種形式，分子量分別為27kD和24kD而得名。在GP27的N末端146位的天門冬酰胺上連接著一種復雜的糖基，在122位賴氨酸殘基處有胰酶切割位點。S蛋白有三個疏水區(qū)段，分別位于7-23、80-98和169-226，被二個親水區(qū)段分開。疏水區(qū)段的氨基酸比較保守，氨基酸的變異主要發(fā)生在親水區(qū)段。HBsAg是一種構(gòu)象性抗原，兩個小蛋白分子由二硫鍵連在一起，構(gòu)成二聚體，代表著結(jié)構(gòu)單位，具有完整的HBsAg活性，其中第二個親水區(qū)段，即122和155殘基之間的主要蛋白片段含有大多數(shù)HBsAg組和亞型的決定簇。
中蛋白含有281個氨基酸殘基，由前S2和S基因共同編碼，它實際上是在小蛋白的N端又增加了55個氨基酸殘基的S2蛋白區(qū)段，因分子量居中，因此稱為中蛋白。中蛋白有一種非糖基化形式P31，兩種糖基化形式GP33和GP36。GP33含有一個配糖體，GP36有兩個配糖體，這兩個糖基位于S蛋白的146位和前S2區(qū)段。由前S2基因編碼的55個氨基酸通常是親水性的，富含不依賴二硫鍵的連續(xù)抗原決定簇，具有比小蛋白更強的免疫原性，但易被胃蛋白酶消化而喪失其活性。前S2蛋白還有一種多聚人血清白蛋白受體(PHSA-R)，能特異性地與人和黑猩猩血清的多聚白蛋白(PHSA)結(jié)合，肝細胞本身也有該受體，多聚人血清白蛋白介導HBV附著肝細胞，這就是HBV易感染肝細胞的一個重要原因，也是決定HBV嗜肝特點的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
大蛋白含有389-400個氨基酸殘基，由前S1、前S2和S基因三部分共同編碼，其分子量在三種包膜蛋白中分子量最大，因此稱其為大蛋白。大蛋白也有兩種不同的形式，糖基化的GP42和非糖基化的P39，分子量分別為42kD和39kD。根據(jù)亞型的不同在長度上有所變化，ay亞型和ad亞型的變化范圍在389-400個氨基酸之間，在GP42有一個與N末端相連的糖基，由前S1區(qū)編碼的N末端位于包膜蛋白的表面。
一個完整的病毒粒體，含有300-400個S蛋白分子，40-80個中蛋白和大蛋白分子，管狀顆粒的蛋白質(zhì)組成與病毒粒體相同，而直徑為22nm球形顆粒的蛋白質(zhì)成份則完全不同在有病毒復制的慢性攜帶者血清里，S蛋白和中蛋白的含量與在HBV顆粒中的含量大約有同樣的比例(10∶1)，但大蛋白少于1/20；而在病毒的非復制期，則22nm的球形顆粒所含有的幾乎全是S蛋白，中蛋白少于1％，無大蛋白。
對前S2蛋白的免疫原性的研究，提供了一些制備高效乙肝疫苗的依據(jù)，目前世界上大多數(shù)血源疫苗的純化都經(jīng)胃蛋白酶處理，喪失了許多前S2蛋白的免疫原性，因此，有必要在未來的、新的乙肝疫苗中，添加適量的中蛋白或前S2蛋白的成份，以提高其免疫原性。特別是對S蛋白免疫應(yīng)答差的機體，在接受前S2蛋白以后，有希望獲得中和抗體，這已在動物實驗中得到了很好的證實。
現(xiàn)在人們已經(jīng)認識到普遍接種乙肝疫苗是控制乙型肝炎發(fā)生的唯一方法，在一些發(fā)達國家，已對乙肝病毒感染高危人群進行接種。在加拿大和美國，普遍接種的對象是嬰幼兒和青少年，采用這種免疫方式使乙肝病毒感染的新病例減少90％以上，因此，如何使乙肝疫苗更加安全、經(jīng)濟、有效和更容易推廣使用將是今后各國研究的主要方向。
大量的實驗研究表明人或其它哺乳動物在受到病原侵染后會產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)以抵御這種病原的入侵。這一過程至少涉及以下三種免疫機制之一粘膜、體液或細胞。粘膜免疫應(yīng)答產(chǎn)生分泌型抗體IgA，可保護呼吸道、消化道、生殖系統(tǒng)和腺體表面不受侵染。粘膜抗體可阻止病原在粘膜表面定居從而構(gòu)成第一道防御屏障。粘膜抗體的產(chǎn)生可通過分泌性腺體和組織的局部免疫而獲得，也可通過刺激腸道和呼吸道淋巴組織產(chǎn)生。另一方面，體液免疫主要涉及IgG和IgM，它們在血液中參與侵入病原的吞噬，病毒中和或有補體介導的細胞毒性。
研究人員已經(jīng)注意到口服接種可誘導血液和粘膜抗體的產(chǎn)生，通常的情況是口服接種需要比較多的抗原，這是因為抗原被實際吸附和利用的數(shù)量比較低。因此，口服接種所需要的抗原數(shù)量遠遠超過注射接種(2)。然而，也有例外，業(yè)已發(fā)現(xiàn)，一些蛋白只需口服少量就能產(chǎn)生體液和粘膜免疫應(yīng)答，這些蛋白常常能夠與粘膜細胞膜表面的糖脂或糖蛋白特異性結(jié)合，因此，這些蛋白也被稱為粘膜性抗原，例如病毒性血凝素?？诜图∪庾⑸鋭┝勘容^實驗表明，粘膜類抗原也能夠非常有效地引起體液免疫，與肌肉注射相比，二者之間只有輕微的差別。乙型肝炎病毒包膜蛋白可能也屬于粘膜抗原。
基因工程研究領(lǐng)域的最新進展使植物表達外源基因成為可能。含有外源基因的植物細胞可再生出完整植株，并將外源基因穩(wěn)定地遺傳給后代。迄今有些單子葉和雙子葉植物都已經(jīng)進行了成功的轉(zhuǎn)化。例如煙草、馬鈴薯、番茄、大豆和玉米等。
農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導的雙子葉植物轉(zhuǎn)化已有眾多報道。農(nóng)桿菌介導的葉盤轉(zhuǎn)化法可有效地進行基因轉(zhuǎn)移、選擇和再生。
單子葉植物經(jīng)農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化比較困難，但也可以利用其它的轉(zhuǎn)化方法如PEG和電融合法。有人成功地將外源基因?qū)胗衩?、水稻和小麥的原生質(zhì)體中。然后從轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體再生出完整的植株。一些新的轉(zhuǎn)化方法如微管注射法和基因槍法在單子葉植物轉(zhuǎn)化和再生中可能更加有效。
植物是一種多樣化、低成本和可再生的材料資源，而生物技術(shù)的迅速發(fā)展則使我們進一步拓寬了植物的使用范圍，國外在植物中采用這種“分子農(nóng)業(yè)”的方法，已經(jīng)成功地生產(chǎn)了越來越多的有用物質(zhì)，其中包括一些高價值藥用蛋白多肽，如人的細胞生長因子、促紅細胞生成素、干擾素、生長激素、單克隆抗體和可作為疫苗用的抗原蛋白等，一些研究機構(gòu)和公司已經(jīng)開始從這些藥物蛋白的生產(chǎn)中獲得巨大的經(jīng)濟效益。
特別值得指出的是，1998年4月，美國國家過敏癥和傳染病研究所(NationalInstitute of Allergy and Infectious Diseases,NIAID)首次報道了人食用轉(zhuǎn)基因馬鈴薯后體內(nèi)能夠產(chǎn)生針對大腸桿菌熱不穩(wěn)定毒素B亞基的特異性抗體，在11個志愿者中有10人(91％)血清中抗體增加了4倍，有6人(55％)粘膜抗體也增加了4倍。這一研究結(jié)果清楚地表明(1)在植物中高效表達一些病原蛋白基因是可行的。
(2)病原蛋白在植物中可完成翻譯后加工過程，如糖基化和高級結(jié)構(gòu)的空間折疊，從而使這種重組蛋白多肽與天然蛋白具有相同的免疫原性，這是原核生物表達系統(tǒng)無法比擬的，后者無法對源自真核生物的蛋白進行糖基化。
(3)植物中產(chǎn)生的抗原蛋白可安全地通過動物的消化道而不會被胃蛋白酶降解，原因是它們能夠與腸粘膜細胞膜表面上的糖蛋白分子受體結(jié)合并刺激動物機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。這類蛋白也被稱謂粘膜性抗原(mucosal immunogen)，但并不是所有的蛋白都具有這種能力，現(xiàn)僅發(fā)現(xiàn)少數(shù)病毒和細菌含有這種抗原。
(4)研究也證實了粘膜性抗原只需要口服少量蛋白，就可以產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答反應(yīng)，并不比肌內(nèi)注射所需要量大。
這些研究結(jié)果預示植物將成為繼微生物發(fā)酵系統(tǒng)和動物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)之后又一個新的蛋白表達系統(tǒng)。
利用植物表達系統(tǒng)生產(chǎn)乙型肝炎病毒包膜蛋白抗原具有以下優(yōu)點(1)更安全轉(zhuǎn)基因植物中除只增加了乙肝病毒重組抗原蛋白外，沒有改變植物其它的遺傳組成，因此，它絕不會含有對人體有害的成份，也完全排除了污染其它病毒的可能性。
(2)價格更低廉因為它不需要純化和冷藏，抗原蛋白的生產(chǎn)可能只是簡單地種植農(nóng)作物，因此可大大降低生產(chǎn)成本。
(3)使用更方便接種方式只是簡單地食用含有該抗原蛋白的植物組織或由該植物組織加工而成的某種膠囊、沖劑或其它制劑，省去了較麻煩的注射過程，這種接種方式非常適用于中國或其它發(fā)展中國家。
(4)免疫力更持久人或動物每隔一定時間服用含該抗原蛋白的膠囊或沖劑，可使體內(nèi)抗體始終維持在一個較高的水平，增強了對乙肝病毒感染的抵抗能力。
已有人嘗試在植物中表達乙型肝炎病毒包膜小蛋白(S)，發(fā)現(xiàn)在植物中產(chǎn)生的HBsAg抗原與源自人血液或基因工程酵母中的HBsAg具有相似的抗原特性和物理特性，并進而提出了“食物疫苗”的概念，為此，還申請了相關(guān)專利(3)。然而，在本發(fā)明之前，還沒有人利用植物表達乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原，而該蛋白具有比小蛋白更強的免疫原性，正如前文所述，因為中蛋白分子中除含有S蛋白多肽外，它還含有前S2蛋白區(qū)段，它克服了此前血源性和基因工程酵母乙型肝炎疫苗不含有S2蛋白的一些缺點，特別是對S蛋白免疫應(yīng)答差的人群，在接受前S2蛋白以后，有希望獲得針對乙型肝炎病毒的中和抗體，從而獲得更好的保護。
在本發(fā)明之前，盡管已有人提出“食物疫苗”的概念，但在具體操作中存在很大困難，因為植物中的表達的抗原蛋白含量不確定，且植物不同個體或同一植物個體的不同器官之間存在很大差異，人或動物直接食用這種轉(zhuǎn)基因植物就會產(chǎn)生很大風險，長時間食用含少量抗原蛋白的植物材料會引起免疫耐受性，而短時間食用過多抗原又會引起超敏反應(yīng)。本發(fā)明首次提出將含有乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原的轉(zhuǎn)基因植物加工成膠囊、沖劑或其它制劑的方法，對其中所含的抗原蛋白進行嚴格定量，從而對人或哺乳動物的食用間隔和食用量有了明確的規(guī)定，由此克服了直接食用轉(zhuǎn)基因植物存在的上述缺點。
在已經(jīng)有血源性和基因工程酵母乙肝疫苗可供利用的情況下，仍有必要尋找其它新的更加安全和廉價的抗原蛋白生產(chǎn)途徑。利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)疫苗用抗原重組蛋白是一種較好的選擇，它可能為人類和哺乳動物抵御各種傳染性疾病提供一條新途徑。
本發(fā)明提供表達乙型肝炎病毒重組包膜中蛋白抗原轉(zhuǎn)基因植物的構(gòu)建方法以及如何應(yīng)用含該重組抗原蛋白轉(zhuǎn)基因植物的方法。本項發(fā)明特別適用于中國或其它發(fā)展中國家。
本發(fā)明利用可以食用的轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)病毒抗原蛋白，這些重組抗原蛋白在免疫原性方面與天然蛋白類似。按照一個優(yōu)先的實施方案，就是本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因植物、與人或動物疾病相關(guān)的病毒重組抗原蛋白的生產(chǎn)方法以及如何具體應(yīng)用這種含重組抗原蛋白轉(zhuǎn)基因植物的方法。這里所指的疾病是指那些具有在自然狀態(tài)下能夠引起免疫應(yīng)答、特別是粘膜免疫應(yīng)答反應(yīng)抗原的病毒病原。按照一個優(yōu)先的實施方案，病毒病原指的是乙型肝炎病毒，植物指的是人們?nèi)粘Ｊ秤玫闹参铩?br> 本發(fā)明克服了以前一些病毒抗原蛋白生產(chǎn)方法如微生物發(fā)酵和動物細胞培養(yǎng)的缺點，它利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)病毒抗原蛋白，如果將其加工成口服膠囊、沖劑或其它制劑，則具有廉價、安全和使用方便的特點，會使更多的人或動物得到保護。按照一個優(yōu)先的實施方案，人或哺乳動物只需食用這些轉(zhuǎn)基因植物的果實、汁液、根、莖、葉或植物的其它部分，或以腸道給藥的方式利用這些轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物粗提取物制備的膠囊、沖劑或其它制劑便可獲得對疾病的免疫能力。這里的植物是指人們?nèi)粘Ｋ秤玫?，同時由于避免了提純過程，降低了生產(chǎn)成本和存在的其它一些不利因素。
按照一個實施方案，本發(fā)明涉及利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)含抗原蛋白膠囊、沖劑或其它制劑的方法。生產(chǎn)這種膠囊、沖劑或其它制劑的轉(zhuǎn)基因植物材料可以有多種方式，可以是完整植物，或植物的一部分如果實、葉子、莖和塊莖，或植物某一部分的粗提物、或經(jīng)完全純化以及部分純化源自轉(zhuǎn)基因植物的病毒抗原蛋白?？傊?，采用何種方式主要取決于抗原蛋白本身的免疫原性，產(chǎn)生粘膜免疫應(yīng)答反應(yīng)所需這種源自轉(zhuǎn)基因植物的抗原的劑量以及在這種成份中所含的干擾免疫應(yīng)答反應(yīng)的物質(zhì)的多少，如糖類、熱原和毒素等，并盡量降低免疫耐受性的產(chǎn)生。
本發(fā)明所指的抗原蛋白是指在轉(zhuǎn)基因植物中生產(chǎn)的，首先是編碼病原抗原蛋白的基因被分離出來，然后插入到一個含有選擇標記的質(zhì)粒上，啟動子位于該基因的上游，它操縱該基因在植物中的表達。外源基因在植物各器官或可食用部分中表達后，人或動物可食用這部分植物組織。
本發(fā)明提供了在植物細胞中生產(chǎn)病毒重組蛋白的方法，而該蛋白已知在天然狀態(tài)下可引起哺乳動物產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)?；蛘哒f，本發(fā)明所指的病毒重組蛋白可作為抗原，具有與源自哺乳動物血液和其它常規(guī)表達系統(tǒng)產(chǎn)生的該抗原蛋白如酵母和細菌一樣的免疫原性。或者更確切說，本發(fā)明的抗原蛋白與源自哺乳動物血液和其它常規(guī)表達系統(tǒng)產(chǎn)生的該抗原蛋白一樣，均能夠通過口服和腸道給藥的方式引起免疫應(yīng)答反應(yīng)。按照一個優(yōu)先的實施方案，這種病毒重組蛋白是一種抗原蛋白，它可以在植物細胞中表達產(chǎn)生，且具有與源自哺乳動物或其它常規(guī)表達系統(tǒng)所產(chǎn)生的該抗原蛋白相似的免疫原性。
本發(fā)明的抗原源自一種哺乳動物的病毒，它可在植物中表達產(chǎn)生。按照一個優(yōu)先的實施方案，抗原源自一種哺乳動物病毒病原。因此，可以說在植物中表達產(chǎn)生的最有用的病毒抗原是那些來源自哺乳動物如人的病毒病原的抗原。
本發(fā)明的抗原可在植物中表達產(chǎn)生，而表達產(chǎn)生該抗原的植物至少有一部分是可以直接食用或經(jīng)過粗加工后可以食用。這種植物或植物的食用部分不應(yīng)具有毒性，因此，許多常見的食用植物都包括在本發(fā)明所定義的植物范圍之內(nèi)。此外，在某些情況下，如馬鈴薯，在這里也被認為是可食用植物，盡管它的某些部分被認為是有毒的(馬鈴薯塊莖部分是無毒的，因此屬于本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)，但它的果實是有毒的)，在這種情況下，這種植物也應(yīng)包括在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
按照一個優(yōu)先的實施方案，本發(fā)明的抗原應(yīng)該是一個粘膜性抗原。它具有引起粘膜免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的能力。按照一個更加優(yōu)先的實施方案，這些粘膜抗在一定的劑量范圍之內(nèi)能夠引起粘膜和體液產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，而不會導致產(chǎn)生免疫耐受性和過敏反應(yīng)。免疫耐受性在這里被定義為在人或哺乳動物多次食用該抗原之后，導致隨后的特異性抗原-抗體反應(yīng)能力消失。當然，本發(fā)明中的抗原也有可能產(chǎn)生粘膜系統(tǒng)免疫耐受性，但如果改為注射后，該抗原仍能保持它的免疫原性。
本發(fā)明的重組抗原蛋白可以是病毒天然抗原蛋白的全部。然而，在某些具體實施方案中，抗原也可能只是該天然蛋白分子的一部分。有時，抗原可與另外一個多肽或蛋白分子如細菌病原蛋白多肽結(jié)合在一起形成融合蛋白。蛋白的融合可以通過蛋白翻譯后加工、共價結(jié)合的方式，或者通過DNA重組技術(shù)使基因在翻譯前就連接在一起。這兩種技術(shù)是本領(lǐng)域?qū)＜以缫咽熘募夹g(shù)。
在某些實施方案中，本發(fā)明的抗原將指的是來自一種肝炎病毒的抗原，在某些更優(yōu)先的實施方案中，將選擇使用乙肝病毒包膜中蛋白抗原。因此，按照一個進一步的實施方案，乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原基因在植物中表達，而該重組抗原可引起免疫應(yīng)答反應(yīng)、特別是粘膜免疫應(yīng)答反應(yīng)就如同天然蛋白或其它表達系統(tǒng)產(chǎn)生的抗原蛋白一樣。
在本發(fā)明的其它實施方案中，一種表達哺乳動物病毒重組抗原蛋白的轉(zhuǎn)基因植物被構(gòu)建。就本發(fā)明而言，一種轉(zhuǎn)基因植物至少應(yīng)該在該植物的部分細胞中表達了某種病毒抗原。按照本發(fā)明的某些優(yōu)先實施方案，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物至少有一部分是可以食用的，其所表達的抗原是乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原，它能夠引起免疫應(yīng)答反應(yīng)，特別是粘膜免疫應(yīng)答反應(yīng)，就如同天然蛋白或其它表達系統(tǒng)產(chǎn)生的抗原蛋白一樣。
本發(fā)明涉及到了一種食物的組成問題，該食物中至少含有轉(zhuǎn)基因植物的某些食用部分，這里的轉(zhuǎn)基因植物應(yīng)能夠表達乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原。就本發(fā)明而言，植物或植物的某一部分被認為應(yīng)該具有某些營養(yǎng)價值，它能夠為人或其它哺乳動物提供代謝所需的能量，維生素和其他輔助因子。盡管萵苣并不大量提供能量、蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂肪，但就因為它含有重組抗原蛋白而被人們特意食用的話，萵苣也應(yīng)包括在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍內(nèi)。萵苣的粗纖維對哺乳動物的健康是有利的，即使哺乳動物并不能夠消化萵苣的粗纖維。
本發(fā)明涉及到了一種膠囊、沖劑或其它制劑的組成成份問題，膠囊、沖劑或其它制劑中至少含有轉(zhuǎn)基因植物的某些食用部分，這里的轉(zhuǎn)基因植物應(yīng)能夠表達一種重組病毒抗原蛋白。就本發(fā)明而言，膠囊、沖劑或其它制劑中含有的抗原蛋白應(yīng)該能夠精確定量，以避免人或動物食用后產(chǎn)生免疫耐受性。按照本發(fā)明的一個優(yōu)先實施方案，本發(fā)明的膠囊、沖劑或其它制劑所含有的抗原是乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原，它能夠引起免疫應(yīng)答反應(yīng)，特別是粘膜免疫應(yīng)答反應(yīng)，就如同天然蛋白或其它表達系統(tǒng)產(chǎn)生的抗原蛋白一樣。
正如上述所述，按照本發(fā)明的某些實施方案，這里的食物將包括含有粘膜性抗原蛋白的食物，這種粘膜性抗原蛋白能夠與粘膜細胞表面糖基化分子受體結(jié)合，它可以是一種融合蛋白或者是源自某種肝炎病毒的抗原。因此，按照一個更加具體的實施方案，本發(fā)明所指的食物將至少包括轉(zhuǎn)基因植物的一部分，它具有某些營養(yǎng)價值，并含有乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原，而該抗原能夠與粘膜細胞表面的糖基化分子受體結(jié)合。在任何情況下，本發(fā)明的食物都包括植物的根、莖、葉、果實或所說的植物種子。
對本發(fā)明所使用的方法和其它相關(guān)事項極為重要的是一些質(zhì)粒載體的構(gòu)建，它們在獲得本發(fā)明所指的轉(zhuǎn)基因植物以及轉(zhuǎn)基因植物的加工應(yīng)用中起重要作用。用于轉(zhuǎn)化植物的質(zhì)粒載體由編碼哺乳動物病毒抗原的DNA序列和操縱該DNA序列在所說的植物中表達的一個植物啟動子組成。在某些具體實施方案中，質(zhì)粒載體還包括一個選擇或標記基因，主要用于轉(zhuǎn)基因植物或細胞的檢測。在某些具體實施方案中，本發(fā)明的植物啟動子是花椰菜花葉病毒35S啟動子。正如上面所述，按照某些具體的實施方案，本發(fā)明的質(zhì)粒載體用于轉(zhuǎn)化可食用植物，它編碼的抗原是一種粘膜抗原，更進一步說，質(zhì)粒載體所編碼的抗原能夠誘導免疫應(yīng)答反應(yīng)，特別是粘膜性免疫應(yīng)答反應(yīng)，就象天然蛋白和源自其它表達系統(tǒng)所產(chǎn)生的該抗原蛋白一樣。在一個優(yōu)先的實施方案中，本發(fā)明用于轉(zhuǎn)化植物的質(zhì)粒載體含有編碼乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原的基因以及一個植物啟動子，該基因編碼的蛋白抗原可引起免疫應(yīng)答反應(yīng)、特別是粘膜免疫應(yīng)答反應(yīng)就如同天然蛋白或源自其它表達系統(tǒng)的該抗原蛋白一樣，而植物啟動子主要是操縱該基因在植物中的表達。在一個類似的實施方案中，本發(fā)明提供的DNA片段可用于基因槍法轉(zhuǎn)化植物。
本發(fā)明也提供了獲得轉(zhuǎn)基因植物細胞的方法，它包括以下步驟1．構(gòu)建一個質(zhì)粒載體或者一段DNA序列，其中都含有編碼病毒抗原的基因，而且該基因被置于一個植物啟動子的操縱之下；2．用質(zhì)粒載體或上述DNA片段轉(zhuǎn)化植物細胞。按照一個優(yōu)先的實施方案，還包括從轉(zhuǎn)化的植物細胞再生出完整的轉(zhuǎn)基因植株的方法。
本發(fā)明提供了各種植物細胞或植物的轉(zhuǎn)化方法。盡管在下面描述的某些優(yōu)先實施方案中僅利用了特定的轉(zhuǎn)化方法，但顯而易見的是，本領(lǐng)域?qū)＜宜缫咽熘钠渌参镛D(zhuǎn)化方法也應(yīng)包括在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)，這些方法包括微管注射、PEG融合、電融合。按照某些優(yōu)先實施方案，使用的是農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化方法，特別指Ti質(zhì)粒參與的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。在其它一些優(yōu)先實施方案中，還可以使用基因槍法轉(zhuǎn)化植物細胞或植物。
本發(fā)明在詳細介紹轉(zhuǎn)化方法時僅提到了馬鈴薯和番茄，然而，正如本領(lǐng)域?qū)＜宜缫咽熘闹参镛D(zhuǎn)化方法那樣，許多種植物都可以利用本發(fā)明提供的方法進行轉(zhuǎn)化。因此，所有這些植物都應(yīng)包括在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)，這些植物可以是了單子葉植物或雙子葉植物。
就象下面實例中所要詳細描述的那樣，本發(fā)明植物轉(zhuǎn)化方法中所用的質(zhì)粒載體是一個雙元載體系統(tǒng)。按照一個實施方案，本發(fā)明使用的質(zhì)粒是一個整合性載體。按照一個更加優(yōu)先的實施方案，本發(fā)明所使用的質(zhì)粒是pBI121。
本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因食物的生產(chǎn)方法。它包括以下步驟1．構(gòu)建一個質(zhì)粒載體或者一段DNA序列，其中都含有編碼病毒抗原的基因，而且該基因被置于一個植物啟動子操縱之下；2．用質(zhì)粒載體或上述DNA片段轉(zhuǎn)化植物細胞；3．從轉(zhuǎn)基因植物細胞中再生出完整的轉(zhuǎn)基因植物；4．收獲轉(zhuǎn)基因植物的食用部分；5．食用一定量的這種轉(zhuǎn)基因植物，盡量避免產(chǎn)生免疫耐受性，以達到預防疾病的效果。
本發(fā)明也提供了含確定數(shù)量抗原蛋白膠囊、沖劑或其它制劑的生產(chǎn)方法，它包括以下步驟1．構(gòu)建一個質(zhì)粒載體或者一段DNA序列，其中都含有編碼病毒抗原蛋白的基因，而且該基因被置于一個植物啟動子操縱之下；2．用質(zhì)粒載體或上述DNA片段轉(zhuǎn)化植物細胞；3．從轉(zhuǎn)基因植物細胞中再生出完整的轉(zhuǎn)基因植物；4．自轉(zhuǎn)基因植物細胞或完整植物中提取出抗原蛋白加工成膠囊、沖劑或其它制劑。按照一個優(yōu)先的實施方案，含有抗原蛋白的完整轉(zhuǎn)基因植物或者其某些食用部分可直接進行冷凍、干燥和粉碎，然后加工成膠囊、沖劑或其它制劑，并確定其中含有的抗原蛋白數(shù)量。
為了詳細描述本發(fā)明的某些優(yōu)先實施方案，并以相應(yīng)的繪圖作參考


圖1A乙肝病毒包膜中蛋白基因的克隆。
圖1B乙肝病毒包膜中蛋白的組成結(jié)構(gòu)。
圖2乙肝病毒包膜中蛋白基因的核苷酸及其編碼蛋白的氨基酸序列。
圖3質(zhì)粒pSS2L的構(gòu)建過程，它含有乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原基因。
圖4質(zhì)粒pSS2L所含的2個結(jié)構(gòu)基因及其調(diào)控表達序列。
圖5A不同轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株葉片中乙肝病毒包膜中蛋白mRNA的含量。
圖5B不同轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株葉片中乙肝病毒包膜中蛋白的含量。
圖6A轉(zhuǎn)基因馬鈴薯葉片乙肝病毒包膜中蛋白原位雜交結(jié)果。
圖6B轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖乙肝病毒包膜中蛋白原位雜交結(jié)果。
圖7 PCR檢測乙肝病毒包膜中蛋白基因在不同番茄中的整合情況。
圖8轉(zhuǎn)基因番茄葉片和果實中的RNA含量。
圖9重組抗原蛋白(S2&S)在植物汁液中的穩(wěn)定性測定。
圖10重組抗原蛋白在高溫下的穩(wěn)定性測定。
本發(fā)明包括以下幾個組成部分1．利用DNA重組技木構(gòu)建質(zhì)粒表達載體，它含有乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原基因或其衍生物，人或其它哺乳動物在食用該抗原蛋白后有可能產(chǎn)生針對乙型肝炎病毒的特異性中和抗體；2．選擇適宜的受體植物進行轉(zhuǎn)化，使編碼抗原蛋白的基因穩(wěn)定地整合入受體植物的染色體中并可遺傳給后代；3．從轉(zhuǎn)化的受體植物細胞中再生出完整的轉(zhuǎn)基因植物，而且該植物能夠穩(wěn)定、高效地產(chǎn)生乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原；4．人或哺乳動物直接食用這種轉(zhuǎn)基因植物或以腸道給藥的方式口服以該轉(zhuǎn)基因為主要活性成份加工而成的膠囊、沖劑或其它制劑后，有可能預防乙型肝炎病毒的侵染。
本發(fā)明提供了表達乙型肝炎病毒包膜中蛋白或其衍生物轉(zhuǎn)基因植物的構(gòu)建方法，這種轉(zhuǎn)基因植物作為食物或加工成膠囊、沖劑或其它制劑后被人們食用有可能引起人或哺乳動物的免疫應(yīng)答。這種免疫應(yīng)答的結(jié)果使人或哺乳動物對乙型肝炎病毒的感染具有抵抗能力。這種免疫應(yīng)答是由于在轉(zhuǎn)基因植物中表達乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原后而產(chǎn)生的結(jié)果，而乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原的產(chǎn)生則是由于該抗原蛋白基因整合入植物的基因組中并在啟動子調(diào)控下能夠穩(wěn)定地表達的結(jié)果。1．利用植物生產(chǎn)外源蛋白除了乙型肝炎病毒包膜中蛋白外，本發(fā)明還可用于生產(chǎn)其它一些病毒、細菌、真菌或寄生蟲等人類或哺乳動物疾病病原的抗原蛋白。這些抗原蛋白在直接食用后或加工成膠囊、沖劑以及其它制劑并以腸道給藥的方式能夠為人和哺乳動物提供相應(yīng)的免疫能力，則其基因都可以在本發(fā)明中應(yīng)用。
編碼病毒、細菌、真菌或寄生蟲抗原蛋白的基因在經(jīng)過缺失或變異之后也可以應(yīng)用在本發(fā)明中。例如，表達載體含有經(jīng)過修飾的抗原基因，結(jié)果造成抗原蛋白一個或多個氨基酸殘基改變，從而也改變了該抗原蛋白的免疫能力。表達載體也可以只含有抗原蛋白的部分編碼序列，結(jié)果只產(chǎn)生一小段多肽或作為融合蛋白的一小部分，在這種情況下，它們也屬于本專利的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
實際上，早在現(xiàn)代醫(yī)學產(chǎn)生之前，人們便已經(jīng)自覺或不自覺地利用植物或植物中的某些天然成份來醫(yī)治人類疾病。
隨著生物技術(shù)的發(fā)展，過去只能從稀有植物乃至其它生物體才能夠獲得，或者收獲量甚微的一些具有商業(yè)價值的物質(zhì)，現(xiàn)在已有可能利用栽培作物來進行生產(chǎn)了。可以這樣說，基因工程領(lǐng)域的研究進展，使得植物體正在成為具有重要經(jīng)濟價值的異源蛋白的生產(chǎn)體系。據(jù)不完全統(tǒng)計，迄今為止，國外已經(jīng)有幾十種藥用蛋白質(zhì)或多肽在植物中得到成功表達，其中包括了人的細胞生長因子、表皮生長因子、促紅細胞生成素、干擾素、生長激素、單克隆抗體和可作為疫苗用的抗原蛋白等(見表1)。一些研究機構(gòu)或公司已開始從這些藥物蛋白的生產(chǎn)中獲得巨大經(jīng)濟效益。
在植物中生產(chǎn)藥用蛋白多肽最早的例子之一是利用植物貯藏蛋白天然的高水平表達特性，生產(chǎn)人的神經(jīng)肽-亮氨酸腦啡肽。它是一個含有5個氨基酸殘基的小分子多肽，在油菜中先以種子貯藏蛋白2S清蛋白的形式被生產(chǎn)出來，后經(jīng)胰蛋白酶水解被從貯藏蛋白質(zhì)上切割下來，再通過HPLC予以回收，在臨床上可作為止痛劑或鎮(zhèn)靜劑使用。
繼早期的研究之后，在植物中表達人和動物的抗體又成為人們關(guān)注的焦點。免疫球蛋白如IgG、IgM、IgG/IgA嵌合抗體、Fab片段、單鏈抗體和單域抗體等均已實現(xiàn)了表達，表達產(chǎn)物含量最高達植物可溶性蛋白的2％以上。這類抗體具有生物學活性，在純化后可用作藥物、診斷試劑和親合劑等。此外，在植物中表達抗體還有可能增強作物的抗病毒能力、提高產(chǎn)量以及改良其它農(nóng)藝性狀等。
在植物中生產(chǎn)藥用蛋白的另外一條途徑是使用基因工程植物病毒作為表達載體，這類裁體可瞬時高效表達大量外源蛋白，是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)等所不能做到的，已有十幾種植物病毒被改造成不同類型的外源蛋白表達載體，包括花椰菜花葉病毒(CaMV)、煙草花葉病毒(TMV)和豇豆花葉病毒(CpMV)等，其中超過150多種的蛋白多肽在TMV載體中成功表達(4)。利用融合抗原表達策略已生產(chǎn)出含有瘧疾、動物口蹄疫病毒、鼻病毒及人免疫缺陷病毒(HIV)抗原決定簇的嵌合外殼蛋白，這類融合蛋白的生產(chǎn)方式將來可能是生產(chǎn)疫苗的一條重要和經(jīng)濟有效的途徑。
本發(fā)明不僅允許在一種植物中生產(chǎn)一種抗原蛋白，而且可以在一種植物中同時生產(chǎn)多種抗原蛋白。將多種抗原蛋白的基因構(gòu)建在同一個表達載體上，然后用其轉(zhuǎn)化植物，從而在一個轉(zhuǎn)基因植物中可同時表達多種抗原蛋白。此外，轉(zhuǎn)基因植物也可以通過多次轉(zhuǎn)化或者同時用多個含有不同抗原基因的表達載體同時轉(zhuǎn)化的方法獲得。例如，輪狀病毒至少有4個不同的亞型，每一種亞型的抗原蛋白是不同的。如在一種轉(zhuǎn)基因植物中同時表達這幾種不同亞型的抗原蛋白，則食用這種轉(zhuǎn)基因植物或以該轉(zhuǎn)基因植物為主要成份加工而成的膠囊、沖劑及其它制劑后，可以同時抵御不同病毒亞型的感染。表1利用植物表達的外源蛋白外源蛋白 商業(yè)應(yīng)用表達方式參考文獻乙肝病毒表面抗原(HBsAg)疫苗轉(zhuǎn)基因 [5]大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素B亞基(LT-B)口服疫苗轉(zhuǎn)基因[6]諾沃克病毒外殼蛋白(Norwalk virus)口服疫苗轉(zhuǎn)基因[7]蓋氏13單克隆抗體(Guys’13mAb)預防齲齒轉(zhuǎn)基因[8]谷氨酸脫羧酶(GAD) 預防糖尿病 轉(zhuǎn)基因 [9]粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF) 預防感染轉(zhuǎn)基因[10]Leu-腦啡肽(Leu-Enkephalin) 鎮(zhèn)痛轉(zhuǎn)基因 [11]水蛭素(Hirudin)凝血酶抑制因子 轉(zhuǎn)基因 [12]表皮生長因子(EGF) 刺激上皮細胞分裂轉(zhuǎn)基因 [13]促紅細胞生成素(EPO)調(diào)節(jié)紅細胞水平 轉(zhuǎn)基因 [14]紅鱒生長激素(Growth hormone)刺激生長 轉(zhuǎn)基因[15]人血清白蛋白(Human serum albumin) 血漿成分 轉(zhuǎn)基因[16]人干擾素(HIFN-α-D)抗病毒 CaMV(a) [17]α-天花粉蛋白(α-trichosantin)抑制艾滋病病毒 TMV(b)[18]血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACE1)抗過敏反應(yīng) TMV [19]流感病毒血凝索(Influenza virus HA)疫苗 TMV [20]＆艾滋病毒抗原(HIV-1 gp120)瘧疾抗原疫苗 TMV [21]口蹄疫病毒抗原(FMDV-VP1) 疫苗 CpMV(c) [22]＆鼻病毒抗原(HRV-14)水貂腸炎病毒抗原(MEV-VP2) 疫苗 CpMV [23]犬細小病毒抗原(CPV-CP-VP2)疫苗 PPV(d)[24]注(a)CaMV為花椰菜花葉病毒表達裁體；(b)TMV為煙草花葉病毒表達載體；(c)CpMV為豇豆葉病毒表達載體；(d)PPV為李痘病毒表達載體。2．受體植物的選擇利用不同的外源DNA轉(zhuǎn)移技術(shù)，現(xiàn)已轉(zhuǎn)化了多種植物，包括許多雙子葉植物和一些單子葉植物?？紤]到遺傳轉(zhuǎn)化操作的難易程度，本發(fā)明更傾向于使用雙子葉植物作為受體植物，盡管某些單子葉植物如小麥、玉米和水稻可能更適于作為人們的食物或加工成膠囊、沖劑或其它制劑。
選擇受體植物進行遺傳轉(zhuǎn)化要考慮到抗原蛋白是否能夠在它的食用部分中表達。因為，抗原蛋白在植物的某一部分如果實、葉子、莖、種子、或根中表達后，人或哺乳動物可直接食用該部分的植物組織或者在加工以后做成膠囊、沖劑或其它制劑供人們口服。按照一個并不優(yōu)先的實施方案，抗原蛋白也可在不能食用的植物中表達，然后從中完全純化出所需的抗原蛋白加工成膠囊、沖劑和其它制劑。
在選擇受體植物時，還要考慮其它一些因素。受體植物的食用部分最好不需加熱就可以食用，因為加熱會引起抗原蛋白變性，從而降低它的免疫原性。此外，因為乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原在人或動物剛出生時最易誘導免疫應(yīng)答反應(yīng)的產(chǎn)生，因此，含有該抗原蛋白的植物部分最好能加工成液體的方式被飲用。
適于本發(fā)明轉(zhuǎn)化的受體植物包括所有可作為人或動物食物的雙子葉植物和單子葉植物，植物的一部分或全部可食用，這些植物包括馬鈴薯、番茄、胡蘿卜、萵苣、黃瓜、小麥、大豆、水稻、玉米和香蕉等，但不僅限于此。3．植物轉(zhuǎn)化方法有許多種方法可以將外源基因?qū)雴巫尤~植物和雙子葉植物。將外源基因穩(wěn)定整合入植物染色體基因組DNA的主要方法包括1)農(nóng)桿菌介導法；2)DNA直接攝入法，包括PEG介導的原生質(zhì)融合法、電激法、微管注射法以及使用基因槍將DNA直接送入植物細胞和組織等。
農(nóng)桿菌介導法是利用質(zhì)粒載體將特定的DNA片段整合入植物染色體基因組DNA。植物組織的轉(zhuǎn)化方法因植物和農(nóng)桿菌系統(tǒng)而異。最常用的方法是葉盤法，它適用于任何易于再生成完整植株的植物外植體。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法特別適用于雙子葉植物的轉(zhuǎn)化。
正如上面已提到的各種DNA直接攝入轉(zhuǎn)化方法，電激法是先將原生質(zhì)體置于放在一個強電場中，在電流作用下將外源DNA送入原生質(zhì)體內(nèi)。微管注射法是用微管將DNA直接注射入細胞中?；驑尫ㄊ菍NA先吸附在硫酸鎂或鎢粒上，這些顆粒被加速射入植物細胞或組織中。
按照本發(fā)明的一個優(yōu)先實施方案，農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒系統(tǒng)被選用。農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒中含有一段叫做轉(zhuǎn)移DNA(T-DNA)的，它可以進入植物細胞中并整合入植物的染色體中。轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建分為兩步，首先是構(gòu)建一個可以在大腸桿菌中復制的質(zhì)粒，這個質(zhì)粒含有目的基因(在這里專指乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原基因)；抗原基因的兩端含有T-DNA邊界序列，它負責目的基因在植物基因組中的插入位點。通常另外一個選擇標志基因(如抗卡那霉素抗性基因)也被包含在T-DNA的左右邊界序列中，該基因在植物細胞中表達后可提供一個選擇標記證實植物或植物細胞是否含有整合的T-DNA序列。載體構(gòu)建的第二步是將質(zhì)粒從大腸桿菌轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌中。這可以通過三親交配的方式或DNA直接導入方式完成。為了T-DNA的轉(zhuǎn)移，所用的農(nóng)桿菌菌株中還要含有一套誘導基因，它們在T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細胞中起重要作用。
熟悉植物遺傳轉(zhuǎn)化的人應(yīng)該知道轉(zhuǎn)化用的農(nóng)桿菌菌株可以有多種選擇，質(zhì)粒構(gòu)建也有多種方式，其目的都是為了更有利于植物的遺傳轉(zhuǎn)化。同樣，人們也應(yīng)該知道除了根癌農(nóng)桿菌外，在有些情況下，還有其它農(nóng)桿菌如發(fā)根型農(nóng)桿菌更適于一些植物的轉(zhuǎn)化。
植物組織的轉(zhuǎn)化方法因植物和農(nóng)桿菌介導系統(tǒng)而異。最常用的是植物葉盤轉(zhuǎn)化法，它適于多種易于再生的植物外植體。在某些情況下，還需要加入一些輔助細胞。其他的轉(zhuǎn)化方法包括原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，繼而由原生質(zhì)體再生出植物細胞及完整植株。
本發(fā)明不僅僅限于使用農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，還應(yīng)包括其它物理性的手段將外源基因直接導入植物細胞或原生質(zhì)體的方法以及其它將外源基因?qū)胫参锛毎姆椒ā?．基因表達啟動子在受體植物和轉(zhuǎn)化方法確定之后，一個組成型的、發(fā)育調(diào)節(jié)型的或組織特異型的表達啟動子被選擇以便外源基因能夠在植物中表達。
所有已知能操縱外源基因在植物細胞中轉(zhuǎn)錄的啟動子都可以在應(yīng)用在本發(fā)明中。這些啟動子可從植物或病毒中獲得，如花椰菜花葉病毒35S啟動子(包括經(jīng)過拼接、加倍和突變改造后的35S啟動子)；光誘導基因啟動子如核糖二磷酸羧化酶小亞基(rbcS)；逆境誘導基因如乙醇脫氫酶(Adhl)或玉米肌動蛋白基因啟動子等，但不僅限于此。本發(fā)明也可利用已知在植物可食部分高效表達的啟動子如馬鈴薯質(zhì)體基因啟動子。
用于植物轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒通常含有一個選擇標志基因。許多有此功能的基因已被開發(fā)出來。
下面以轉(zhuǎn)基因馬鈴薯和番茄生產(chǎn)乙肝病毒包膜中蛋白抗原為例，描述一個優(yōu)先的實施方案，但本發(fā)明的應(yīng)用不僅限于此。
選擇乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原基因在轉(zhuǎn)基因植物中表達是因為乙型肝炎是世界性分布的傳染性病毒病，它可以引起人的急、慢性肝炎和肝硬化。選擇馬鈴薯和番茄作為受體植物是為了舉例說明在植物的不同部分可表達乙肝病毒表面抗原。
實施例11．乙肝病毒包膜中蛋白抗原植物表達載體pSS2L的構(gòu)建如
圖1所示，乙型肝炎病毒核酸(adr亞型)被從乙肝患者的血清中分離出來作為模版，根據(jù)已知的乙肝病毒DNA核酸序列(25)合成特定的引物，并通過多聚酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增獲得了乙肝病毒包膜中蛋白基因。因為在5’端和3’端引物中分別引入了Bam HⅠ和Sac Ⅰ位點，所以擴增片段經(jīng)Bam HⅠ和Sac Ⅰ雙酶切后，被直接定向插入到質(zhì)粒pUC19中的相應(yīng)位點內(nèi)。得到質(zhì)粒pUCS2&S，然后，通過核苷酸序列分析，確定乙肝病毒包膜中蛋白基因是否正確和完整。
質(zhì)粒pUCS2&S含有乙肝病毒包膜中蛋白抗原基因，用限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ和Sac Ⅰ雙酶切可將包膜中蛋白基因切下來，通過瓊脂糖凝膠電泳分離獲得該DNA片段，隨后插入到質(zhì)粒pBI121原GUS基因位點上(Bam HⅠ和Sac Ⅰ雙酶切)便構(gòu)建成雙元表達載體pSS2L。
質(zhì)粒pBI121購自美國Clonetech公司，它的Bam HⅠ和Sac Ⅰ限制性酶切位點分別位于花椰菜花葉病毒35S啟動子和GUS基因起始密碼之間以及GUS基因終止序列和NOS終止子之間。選用質(zhì)粒pBIl21是因為用Bam HⅠ和Sac Ⅰ雙酶切可將GUS基因刪除，而隨后可插入另外一個蛋白基因。新基因?qū)⒛軌蛟谥参锛毎麅?nèi)表達。質(zhì)粒pBI121還含有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ基因(NPT Ⅱ)，它編碼的酶可為植物細胞提供卡那霉素抗性，從而可將含有T-DNA的細胞和組織篩選出來。NPT Ⅱ基因有自己的啟動子和多聚腺酸信號序列，它們源自胭脂堿(Nopaline)合成酶(NOS)基因。
質(zhì)粒pSS2L含有1)新霉素合成酶基因Ⅱ(NPT Ⅱ)，它提供給植物細胞卡那霉素抗性；2)乙肝病毒包膜中蛋白抗原基因及操縱該基因的花椰菜花葉病毒35S啟動子；3)T-DNA左右邊界序列，它可將NPT Ⅱ基因和乙肝病毒包膜中蛋白抗原基因轉(zhuǎn)移到植物體內(nèi)并整合到植物染色體中。pSS2L的結(jié)構(gòu)如圖2所示。2．將表達載體pSS2L導入農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)含有乙肝病毒包膜中蛋白抗原基因的質(zhì)粒pSS2L被通過三親交配的方式轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌LBA4404菌株中，該菌株購自美國Clonetech公司。菌株LBA4404現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用是因為它是一改造后的農(nóng)桿菌，它含有完整Vir基因，但T-DNA已經(jīng)被刪除。Vir基因可反式調(diào)節(jié)T-DNA自質(zhì)粒pSS2L向植物細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移。
農(nóng)桿菌在含有25mg/L鏈霉素50ml YEP培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，在OD600nm值達到0.4-0.7時，4000g離心收集細菌細胞，將農(nóng)桿菌細胞重新懸浮在1ml不含任何抗生素的YEP培養(yǎng)基中待用。含有表達載體pSS2L的DH5α和含有輔助質(zhì)粒pRK2013的HB101分別接種在含有50mg/L卡那霉素50ml LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，在OD600nm值達到0.4-0.7時，4000g離心收集細菌細胞，然后將細胞分別懸浮在1ml不含任何抗生素的LB培養(yǎng)基中待用。取上述三種細胞懸浮液各200ul，置于同一1.5ml離心管中，28℃靜置培養(yǎng)過夜，取該培養(yǎng)物5-10ul，均勻涂抹在YEP固體培養(yǎng)基平板上，該培養(yǎng)基中同時含有25mg/L鏈霉素和50mg/L卡那霉素，28℃培養(yǎng)2天后，含有pSS2L質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌落開始產(chǎn)生。
用堿裂解法從農(nóng)桿菌中提取質(zhì)粒DNA，并用限制性內(nèi)切酶酶切可檢測pSS2L質(zhì)粒DNA是否存在。3．農(nóng)桿菌介導的植物遺傳轉(zhuǎn)化植物的遺傳轉(zhuǎn)化首先是植物組織器官或細胞與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，在培養(yǎng)約2天后，將植物外植體移置相應(yīng)的選擇培養(yǎng)基中。植物外植體可以是原生質(zhì)體、愈傷組織或其它器官組織，因植物而異。選用帶葉子的器官是最常用的方法。
葉片轉(zhuǎn)化主要依據(jù)Horsch等人的方法(26)。馬鈴薯無菌苗[品種為費烏瑞它(Favorita)，中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所提供]保存在22℃光照培養(yǎng)箱中，輔之以中等光照強度下，每隔3個星期剪取頂端幼芽，重新扦插在不含任何抗生素的MS固體培養(yǎng)基中，生長2星期的葉片最適于轉(zhuǎn)化。番茄(中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所提供)則以7-10日齡的子葉或下胚軸無菌外植體進行轉(zhuǎn)化。
無論馬鈴薯還是番茄均以葉片進行轉(zhuǎn)化為最好。含有表達載體pSS2L的農(nóng)桿菌LBA4404接種在50ml YEP培養(yǎng)基(含50mg/ml卡那霉素和25mg/ml鏈霉素)中28℃培養(yǎng)2天，4000g離心5分鐘收集菌體，用25ml液體MS培養(yǎng)液(不含抗生素)洗滌一次，再用MS重新懸浮至OD600nm=0.2-0.4。將有傷口的葉片浸入稀釋后的農(nóng)桿菌培養(yǎng)液中數(shù)分鐘，用無菌濾紙吸干葉片上多余的菌液，然后將葉片移置不含任何抗生素的再生培養(yǎng)基上23-25℃共培養(yǎng)2天。將葉片移置新鮮的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中含有100-200ug/ml卡那霉素和500ug/ml羧芐青霉素，以后每兩周更換一次培養(yǎng)基。當葉片傷口處愈傷有幼芽形成并長至足夠大時，將幼芽切下(通常在轉(zhuǎn)化后6-10星期)轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上生長。當根出現(xiàn)后，將再生植株移置無菌條件下生長或轉(zhuǎn)移到土壤中，給予適宜的溫度、光照和營養(yǎng)條件下生長。4．表達乙型肝炎病毒包膜中蛋白基因工程植株的篩選在轉(zhuǎn)化大約四個月后(番茄產(chǎn)生果實需10個月)?？蓹z測轉(zhuǎn)基因植株是否含有乙型肝炎病毒包膜中蛋白。
1)生物化學和免疫學檢測從轉(zhuǎn)基因植物的葉片、莖、塊莖或果實采集樣品。并將樣品在水或緩沖液(如PBS磷酸緩沖液，pH7.4含0.2g KH2PO4,2.9g Na2HPO4·12H2O,8.0gNaCl,0.2gKCl)中磨碎后，勻漿液在10000g離心10分鐘，取上清液，除留一小部分用于Lowry法定量可溶性蛋白外，其余用于乙肝病毒包膜中蛋白含量的測定。通過酶聯(lián)免疫法測定乙肝病毒包膜中蛋白含量，Hepanostika HBsAg Uni-Form ⅡMicroelisa System試劑盒購自荷蘭Organon Teknika公司。
2)乙型肝炎包膜中蛋白基因的檢測轉(zhuǎn)基因植物中乙型肝炎包膜中蛋白基因的整合情況可通過PCR擴增目的片段基因或Southern雜交印跡反應(yīng)進行檢測，自轉(zhuǎn)基因植物和對照植物中分別提取其基因組DNA，依此作為模版，用特異性的包膜中蛋白引物進行擴增，或用BamH Ⅰ和Sac Ⅰ雙酶切后，電泳分離DNA片段，在轉(zhuǎn)移到尼龍膜上后，以地高辛(Digoxigenin)標記的包膜中蛋白核酸編碼序列作為探針。此外，可收集轉(zhuǎn)基因植株自交種子，通過卡那霉素抗性萌發(fā)實驗或PCR分析其后代的外源基因純合情況。5．表達乙型肝炎病毒包膜中蛋白轉(zhuǎn)基因植物的繁殖和培育在篩選出高效和穩(wěn)定表達乙型肝炎病毒包膜中蛋白的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯或番茄植株后，為生產(chǎn)該抗原蛋白必須大量繁殖該轉(zhuǎn)基因植株。馬鈴薯是通過營養(yǎng)繁殖的，因此，可通過扦插的方法，在短時間內(nèi)便可獲得大量幼苗和微型薯，且不必擔心由于有性生殖而引起后代的遺傳重組問題。番茄或其它依靠種子繁殖的轉(zhuǎn)基因植物要獲得穩(wěn)定表達的后代，則需要較長時間，因為種子繁殖有缺點，其后代缺乏均一性，外源基因按照孟德爾遺傳規(guī)律傳給后代?；旧希總€種子遺傳上是不同的，具有它自己的遺傳特性。因此，轉(zhuǎn)基因植物最好要經(jīng)過幾代篩選，在得到純系后，外源基因才能穩(wěn)定地傳給后代。6．含乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原轉(zhuǎn)基因食品的制備乙型肝炎病毒包膜中蛋白可通過大量繁殖轉(zhuǎn)基因植物進行生產(chǎn)，植物在收獲后可直接食用或加工成膠囊、沖劑以及其它制劑。馬鈴薯塊莖雖然不能夠生吃，但在冷凍干燥后，磨成細粉并加工成膠囊、沖劑或其它制劑。而番茄果實則可以加工成瓶裝番茄汁方便飲用。在一定時間內(nèi)，人們通過口服一定量的膠囊、沖劑或番茄汁或直接食用番茄(在一定時間內(nèi)一次或多次)，其中含有的乙型肝炎病毒包膜中蛋白有可能激發(fā)人體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，人們也就具備了對乙型肝炎病毒的免疫能力。
實施例21．馬鈴薯的轉(zhuǎn)化在農(nóng)桿菌介導下，利用葉盤法轉(zhuǎn)化馬鈴薯，然后通過在選擇培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)和篩選，完整的卡那霉素抗性馬鈴薯植株被再生出來。
按照Horsch等人的方法，利用葉盤法轉(zhuǎn)化馬鈴薯。馬鈴薯無菌苗在重新扦插于MS固體培養(yǎng)基中生長2周后，用剪刀自葉柄與莖相連部位處將葉片剪下。含有表達載體pSS2L的農(nóng)桿菌菌株LBA4404接種在50ml YEP中，28℃培養(yǎng)2天，4000g離心5分鐘，收集菌體，然后重新懸浮在液體的MS培養(yǎng)基中至OD600nm=0.4，將剪下葉片浸入稀釋后的農(nóng)桿菌中5分鐘，然后取出，用濾紙吸干，葉面朝上置于MS固體培養(yǎng)基上，28℃共培養(yǎng)2天。然后將葉片移置新鮮的選擇培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基含有200ug/ml卡那霉素和500ug/ml羧卞青霉素，可抑制農(nóng)桿菌細胞的生長并可使轉(zhuǎn)化的植物細胞有選擇的生長。以后每隔2個星期更換一次選擇性培養(yǎng)基直到葉柄傷口處長出愈傷并分化出幼苗。當幼苗出現(xiàn)并長到足夠大時，將幼苗切下來(通常在共培養(yǎng)后4-8個星期)，移到生根培養(yǎng)基上(含有100ug/ml卡那霉素)，當根長出后，幼苗被移到無菌的營養(yǎng)土中生長并輔之以適當?shù)臏囟群凸庹諚l件。2．轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的RNA分析利用地高辛標記的包膜中蛋白基因探針，對pSS2L表達載體轉(zhuǎn)化后的卡那霉素抗性馬鈴薯植株RNA進行了雜交分析。
轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株的葉片總RNA被提取，方法見參考文獻(27)。大約1.0g葉片在液氮中用研缽磨成粉末，加入10ml RNA提取緩沖液(0.2MTris-HCl,pH6.8；0.2M NaCl；20mM EDTA；2％SDS)，隨即加入10ml飽和酚緩沖液(10mMTris-HCl,pH8.0；1mM EDTA飽和)進行抽提，然后用10ml的氯仿抽提。3000g離心，收集上層水相，加入0.3M醋酸鉀(pH5.2)緩沖液和2.5倍體積的無水乙醇，10000g離心收集沉淀，風干后，沉淀重新懸浮在2ml的水中，隨后加入2ml6M的醋酸銨緩沖液和10ml無水乙醇，10000g離心收集沉淀。沉淀在干燥后，重新懸浮在0.4ml水中，RAN濃度可通過測定260nm的吸光值進行估算，假定1mg/ml的RNA吸光值是25單位。
取10ug RNA樣品，約5ul，與2倍體積RNA樣品緩沖液(10ml去離子甲酰胺，3.5ml 37％甲醛，2ml 5× MOPS)混合后，65℃加熱5分鐘，冷卻后，加入3ulRNA加樣緩沖液(50％甘油，1mM EDTA,0.4％溴酚藍)，然后經(jīng)過1％的RNA瓊脂糖凝膠電泳。核酸通過毛吸管法轉(zhuǎn)移到尼龍膜(Hybond N+)上，所用的緩沖液為20×SSC,pH7.2(3M氯化鈉，0.3M檸檬酸鈉)，轉(zhuǎn)移時間為16小時。核酸通過紫外線照射后被交連在尼龍膜上，將膜置于預雜交液中[5×SSC,0.1％(w/v)N-Lauroylsarcosine,0.02％SDS,100ug/ml鮭魚精DNA],68℃預雜交3小時，然后更換新的雜交液[5×SSC,0.1％(w/v)N-Lauroylsarcosine,0.02％SDS,1％的封閉劑(BM試劑盒中提供)，5ml雜交液中加入變性的地高辛標記的DNA探針60ng進行雜交，探針長933bp，它是來自質(zhì)粒pUCS2&S的Bam HⅠ和Sac Ⅰ的酶切片段，包括了乙肝病毒包膜中蛋白基因的全部編碼序列。在雜交液中68℃雜交24小時后，取出雜交膜，于200ml 2×SSC,0.1％SDS緩沖液中室溫下洗膜2次，然后于100ml 0.1×SSC,0.1％SDS緩沖液中68℃洗膜2次。顯色反應(yīng)基本依據(jù)試劑盒中提供的方法(BM)，尼龍膜先于洗脫緩沖液
中平衡5分鐘，然后用50ml 1×封閉緩沖液封閉30分鐘，加入堿性磷酸酶標記的地高辛抗體至濃度為75mU/ml，室溫下反應(yīng)30分鐘，用洗脫緩沖液2次，每次15分鐘。將膜移置20ml顯色緩沖液(0.1M Tris-HCl，pH9.5；0.1M NaCl；50mM MgCl2)中平衡5分鐘，更換新的底物緩沖液(200ul NBT/BCIP底物加入10ml顯色緩沖液)，遮光條件下顯色16小時，待所期望的條帶出現(xiàn)后，用水終止反應(yīng)。
攜帶有質(zhì)粒pUCS2&S轉(zhuǎn)基因植株和陰性對照植物的RNA雜交結(jié)果如圖示5A。不同轉(zhuǎn)基因植株的RNA雜交信號變異很大，這可能是由于基因的插入位點和基因的拷貝數(shù)不同引起的。和標準RNA分子量相比，轉(zhuǎn)錄的RNA約有1kb長，與預先估計的相一致。陰性對照植物的RNA沒有觀察到雜交信號。mRNA的穩(wěn)定、大量表達并能夠與編碼乙肝病毒包膜中蛋白核酸探針特異性雜交的結(jié)果表明mRNA的穩(wěn)定性在某些轉(zhuǎn)基因植株中不會成為包膜中蛋白在馬鈴薯中表達的一個問題。3．不同轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株乙肝病毒包膜中蛋白含量的測定取不同轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株葉片0.1g，各加入1.5ml去離子水，在4℃下用玻璃勻漿器磨碎。勻漿液10000g 4℃離心5分鐘，利用Lowry法(蛋白測定試劑盒購自Sigma公司，貨號為P5656)，取部分上清液測定可溶性蛋白含量。依據(jù)Hepanostika HBsAg Uni-Form Ⅱ Microelisa System試劑盒(購自荷蘭Organon Teknika公司)中提供的方法，測定上清液中乙肝病毒包膜中蛋白的含量。以CHO細胞提取的標準含量的重組HBsAg蛋白(中國衛(wèi)生部生物制品鑒定所提供，因為無法獲得標準含量的乙肝病毒包膜中蛋白，以下所測定的植物包膜中蛋白表達量為近似值)為陽性對照。陽性對照被稀釋成不同蛋白水平(0.02-3.2ng)，在顏色反應(yīng)后，讀取450nm光吸收值，制備一條標準吸收曲線。如圖5B中所示，通過比較發(fā)現(xiàn)，陰性對照植物中(柱1)沒有發(fā)現(xiàn)含有乙肝病毒包膜中蛋白，而在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株中則可以檢測到不同含量的乙肝病毒包膜中蛋白，含量約為植物可溶性蛋白4-15ng/mg(柱2至柱7)。不同轉(zhuǎn)基因馬鈴薯之間差異比較大這可能是由于基因插入的拷貝數(shù)和插入位點不同引起的。4．轉(zhuǎn)基因馬鈴薯不同組織器官乙肝病毒包膜中蛋白含量的測定取轉(zhuǎn)基因馬鈴薯葉片、莖和塊莖組織各0.1g，處理和測定方法同上。表2中列出了轉(zhuǎn)基因馬鈴薯不同組織器官中乙肝病毒包膜中蛋白的含量。
馬鈴薯葉子中的乙肝病毒包膜中蛋白表達量最高約為可溶性蛋白的0.0015％，為80ng/g鮮重。莖中的乙肝病毒包膜中蛋白盡管表達量占植物可溶性蛋白的0.003％，但因莖中含有的可溶性蛋白量比較低，故每g鮮重只含有40ng包膜中蛋白，約為葉片的一半。馬鈴薯塊莖中的包膜中蛋白含量最高，約為380ng/g鮮重，這就為加工和利用馬鈴薯塊莖提供了極大的方便。表2。馬鈴薯葉子、莖和塊莖中的包膜中蛋白含量器官ng/mg可溶性蛋白(％)ng/g鮮重葉子15(0.0015％) 80莖 33(0.0033％) 40塊莖111(0.011％) 3805．原位雜交法檢測轉(zhuǎn)基因馬鈴薯葉片和塊莖中乙肝病毒包膜中蛋白摘取轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株葉片，在細沙紙上按一下，然后朝向沙紙的一面在硝酸纖維素膜上按下。馬鈴薯塊莖則用干凈的手術(shù)刀片切開，然后按在硝酸纖維素膜上30秒種。用3％的BSA(溶解在1×PBST緩沖液中)在37℃包被該膜2小時，然后加入HBsAg小鼠抗體(1∶1000倍稀釋在PBST中，含2％BSA)，37℃反應(yīng)5小時。洗膜后，依次加入堿性磷酸酶標記的羊抗鼠IgG 37℃反應(yīng)1小時，最后加入底物緩沖液液進行顏色反應(yīng)。
原位雜交反應(yīng)結(jié)果如圖6A和6B。它直接證實了乙肝病毒包膜中蛋白存在于轉(zhuǎn)基因馬鈴薯組織中。因為抗體并不能夠與SDS變性的乙肝病毒包膜中蛋白反應(yīng)，所以不可能通過SDS-PAGE電泳進行蛋白印跡檢測包膜中蛋白的大小。圖6A是轉(zhuǎn)基因馬鈴薯和陰性對照植物葉子的原位雜交反應(yīng)結(jié)果。右邊的陰性對照植物葉片也有一些顏色，但主要是來自葉綠素。左邊的葉子都顯示了紫色，表明有特異的抗原抗體反應(yīng)。圖6B是轉(zhuǎn)基因馬鈴薯和陰性對照植物塊莖的原位雜交反應(yīng)結(jié)果，與葉片雜交獲得的結(jié)果相類似。6．乙肝病毒包膜中蛋白轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的繁殖轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的繁殖已在實施例1中描述。
實施例31．番茄的轉(zhuǎn)化番茄(Lycopersicom esculentum)品種中蔬5號(購自中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所)的轉(zhuǎn)化方法如同實施例2的1中所描述的那樣，也是在農(nóng)桿菌LBA4404介導下利用葉盤法進行遺傳轉(zhuǎn)化。農(nóng)桿菌侵染生長7-10天后子葉或下胚軸無菌外植體，該外植體不需預培養(yǎng)，而是在切下后立即浸入農(nóng)桿菌菌液中5-10分鐘，取出后用濾紙吸干多余的菌液，后移置Z1培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基中加入1mg/L玉米素)，25℃遮光條件下共培養(yǎng)2天。然后將外植體轉(zhuǎn)移到SM培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基中加入1mg/L玉米素，100mg/L卡那霉素和500mg/L羧芐青霉素)誘導愈傷組織形成和幼苗分化(28)。切下的幼苗在RM培養(yǎng)基(1/2MS基本培養(yǎng)基中加入0.2mg/L NAA,100mg/L卡那霉素和500mg/L羧芐青霉素)誘導生根，待長至一定高度，然后轉(zhuǎn)移到滅菌土壤中，給予適宜的條件培養(yǎng)生長。2．PCR檢測乙肝病毒包膜中蛋白基因在番茄中的整合情況番茄基因組DNA的提取方法基本依據(jù)Chee的方法(29)。取3g番茄鮮葉片，放入研缽中用液氮研磨，磨碎后的粉末移置20ml離心管中，然后加入9ml CTAB提取液(100mM Tris-HCl,pH7.5含5M NaCl,10mM EDTA,10ml/L β-巰基乙醇，10g/L CTAB)，劇烈振蕩1分鐘，使之充分混勻。在60℃水浴中溫浴90分鐘，期間每30分鐘振蕩一次。從水浴中取出離心管，室溫下放置4-5分鐘，使之冷卻，然后加入4.5ml氯仿，輕輕搖動，使之充分混勻。室溫下5000g離心10分鐘。收集上清液于另一20ml離心管中，加入4.5ml氯仿，重復上述步驟。收集上清液，加入10ml冰冷的異丙醇，輕搖10-15分鐘，5000g離心5分鐘，收集沉淀，用3ml 76％乙醇含0.2M NaOAc和2ml 76％乙醇含10mM NH4OAc各洗沉淀一次，最后加入TE(pH8.0)緩沖液溶解DNA，將DNA濃度調(diào)至1ug/ul。
取上述番茄基因組DNA 1ug約1ul作為模版，加入乙肝病毒包膜中蛋白基因核酸編碼序列特異性引物各1ul,10×PCR緩沖液3ul,dNTP(各2.5mM)3ul,Taq酶0.5ul約1.5U，加水至總體積30ul。94℃30秒，50℃45秒，72℃1.5分鐘，共進行35個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，取5ul擴增樣品進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。如圖7所示，陰性對照植物中(泳道2-3)沒有發(fā)現(xiàn)特異性的條帶，而在轉(zhuǎn)基因番茄植株中則可擴增出1個約900bp的特異性條帶(泳道4-10)，該結(jié)果表明乙肝病毒包膜中蛋白基因已整合進入番茄基因組DNA中。3．轉(zhuǎn)基因番茄的RNA分析轉(zhuǎn)基因番茄葉片和未成熟果實中RNA的提取方法如同實施例2中的2。RNA樣品被倍比稀釋后，通過點雜交裝置(Schleicher&Schuell Manifold SpotBlotting)轉(zhuǎn)移到尼龍膜上(NYTRAN SuperCharge Nylon)，紫外光照射3分鐘進行交連，風干。雜交與顯色反應(yīng)如同實施例2中的2。
乙肝病毒膜中蛋白基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達量可以通過RNA印跡反應(yīng)進行評估。分別從轉(zhuǎn)基因番茄葉子、綠色果實和非轉(zhuǎn)基因番茄植株葉片中提取的總RNA，通過點雜交裝置被轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，用地高辛標記的乙肝病毒膜中蛋白編碼序列DNA探針進行雜交。圖8是轉(zhuǎn)基因番茄葉子和果實中總RNA與探針雜交的結(jié)果，從雜交信號的強度比較來看，葉子中乙肝病毒包膜中蛋白mRNA含量是果實中的2-3倍。而非轉(zhuǎn)基因番茄的葉子總RNA在高濃度下有較弱的雜交信號產(chǎn)生，但與轉(zhuǎn)基因番茄葉子相比可以認為是非特異性的。由于在雜交中同時加入了已知含量的pUCS2&S質(zhì)粒DNA(含乙肝病毒包膜中蛋白編碼序列)作為陽性對照，相互比較發(fā)現(xiàn)，包膜中蛋白基因在轉(zhuǎn)基因番茄葉子和被忠實轉(zhuǎn)錄并積累到較高水平，約占植物mRNA的0.01％，屬豐富mRNA。在成熟果實中RNA的含量很低，不能通過RNA印跡分析。3．葉子和果實中乙肝病毒包膜中蛋白含量的測定用研缽將植物組織磨碎，在磨碎過程中加入液氮，植物組織粉末中加入10倍體積滅菌無離子水進行稀釋。植物勻漿液10000g 4℃離心5分鐘，依據(jù)試劑盒(Sigam,p5656)提供的方法，取部分上清液測定可溶性蛋白含量。依據(jù)Hepanostika HBsAg Uni-Form Ⅱ Microelisa System試劑盒(購自荷蘭OrganonTeknika公司)中提供的方法，測定上清液中乙肝病毒包膜中蛋白的含量。以CHO細胞提取的標準含量的重組HBsAg蛋白(中國衛(wèi)生部生物制品鑒定所提供)為陽性對照。陽性對照被稀釋成不同蛋白水平(0.02-3.2ng)，在顏色反應(yīng)后，讀取450nm光吸收值，制備一條標準吸收曲線。
表3中列出了轉(zhuǎn)基因番茄葉子和果實中包膜中蛋白的含量。取在溫室中生長的轉(zhuǎn)基因番茄的綠葉和紅色果實進行可溶性蛋白和乙肝病毒包膜中蛋白含量的測定，就象上述所描述的那樣。非轉(zhuǎn)基因植物葉子和果實中檢測不到乙肝病毒包膜中蛋白。
表3番茄葉子和果實中的包膜中蛋白含量器官ng/mg可溶性蛋白(％)ng/g鮮重葉子21(0.0021％) 95果實(紅)35(0.0035％) 71
番茄葉子中的包膜中蛋白含量略高于馬鈴薯葉片，表達量為可溶性蛋白的0.0021％。在成熟果實中包膜中蛋白的含量約占可溶性蛋白的0.0035％，或為71ng/g鮮重。因為果實的密度比較高，番茄果實中的包膜中蛋白表達量集中了番茄植株包膜中蛋白的大部分，一個重100克的番茄果實含有大約7ug包膜中蛋白重組抗原。
實施例41．重組乙肝病毒包膜中蛋白在植物組織中的穩(wěn)定性測定重組乙肝病毒包膜中蛋白抗原(S2&S)在完整的植物細胞中，可長時間保存。如以馬鈴薯塊莖方式4℃下低溫保存，保存期長達一年，抗原也不會有任何損失。但當植物細胞結(jié)構(gòu)破壞后，細胞器中的各種蛋白酶就會被釋放出來，它們能降解植物汁液中所含的重組抗原蛋白。因此，檢測重組抗原蛋白在植物汁液中的穩(wěn)定性，對于今后在加工過程中盡可能保證抗原蛋白不受損失至關(guān)重要。從圖9中可以看出，重組的乙肝病毒包膜中蛋白抗原在植物汁液中放置的時間越長，蛋白的損失就會越大。在室溫下放置1天后與新研磨的汁液中抗原蛋白含量差別不大，但從第2天起，抗原蛋白的量會急劇減少，到第七天后，基本上檢測不到抗原蛋白了。該結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖加工過程中，應(yīng)盡快使其脫水干燥，才可以有效防止重組抗原蛋白不會被細胞中釋放出的蛋白酶降解破壞。
盡管高溫可加速轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖脫水干燥，但重組乙肝病毒包膜中蛋白抗原對高溫的忍受能力是有限的。從
圖10可以看出，當溫度超過50℃時，處理時間達5小時，植物汁液中能夠檢測到的抗原蛋白的數(shù)量急劇下降，這表明該抗原蛋白可忍受的極限高溫是50℃。超過此溫度，蛋白會變性，從而失去與特異性抗體的反應(yīng)能力。
綜合上述，可以得出如下結(jié)論，干燥馬鈴薯塊莖以低溫、快速最為適宜，在此條件下可有效保護重組抗原蛋白不受損失。2．含乙肝病毒包膜中蛋白抗原膠囊的制備馬鈴薯塊莖不便于食用，可考慮加工成膠囊。1000g鮮重馬鈴薯塊莖在冷凍干燥后可獲得干物質(zhì)約140g，該干物質(zhì)進而在低溫下被磨成150-200目的干粉，經(jīng)測定，每100mg這種轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖制成的干粉中約含有280ng乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原。該干粉可直接灌入腸溶性或胃溶性的膠囊外殼內(nèi)。根據(jù)具體情況，每個膠囊可灌入100-500mg轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖制成的干粉，例如，一個300mg的膠囊約含有840ng抗原蛋白。成人一次需服用至少10粒，才有可能獲得足夠的免疫劑量。
為了提高每個膠囊內(nèi)乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原的含量，新鮮馬鈴薯塊莖也可在加入等重量水后，在4℃低溫情況下進行徹底粉碎，低速離心收集上清液，經(jīng)迅速冷凍干燥后，每100mg這種提取物中約含有30-45ug乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原。成年人每次只需服用1粒100mg的膠囊，就有可能達到足夠的免疫劑量。3．含乙肝病毒包膜中蛋白抗原沖劑的制備膠囊的容積比較小，如果直接灌入轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖制成的干粉，則每粒膠囊所含有的重組抗原蛋白較少，成人每次需服用多粒膠囊才能夠達到足夠的免疫劑量，因此，增加一次性食用量在某些情況下可能是必需的。此時，可采用沖劑包裝形式，每袋內(nèi)裝入5-20g由轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖制成的干粉。以10g包裝為例，含有乙型肝炎病毒包膜重組中蛋白抗原28ug。成人每次只需服用1袋，便可獲得足夠的免疫劑量。在服用時，為避免高溫導致蛋白變性，可伴以溫開水稀釋后服下。4．含重組乙肝病毒包膜中蛋白抗原的其它制劑含重組乙型肝炎病毒包膜中蛋白的轉(zhuǎn)基因番茄果實在直接食用時存在一些問題，因為不可能對每個番茄中的抗原蛋白含量進行測定，因而也就無法確定人每次食用幾個番茄果實較為適宜。在這種情況下，可考慮將番茄果實加工成果茶或其它飲料方式，只需對每批產(chǎn)品進行抽樣檢測，便可作為人服用劑量的指導依據(jù)。當然，馬鈴薯塊莖或其它轉(zhuǎn)基因植物也可以加工成飲料的方式便于服用，其前提是必須保證在液體情況下重組乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原不會被蛋白酶所降解，在室溫條件下能夠長期儲存。
植物來源的重組乙肝病毒包膜中蛋白抗原還可以有其它應(yīng)用方式，例如，抗原蛋白在經(jīng)過完全純化或部分純化后，可作為食品添加劑，摻入奶粉、豆粉果汁和酸奶等食物和飲料中制備成各種特殊功能性食品。
參考文獻1．成軍和楊守純主編，現(xiàn)代肝炎病毒分子生物學，人民軍醫(yī)出版社，1997年2．de Aizpurua and Russell-Jones,J.Exp.Med.,1988,167:440-4513．Man-kit,L.D.,Arntzen,C.J.and Mason,H.S.,WO 94/20135,19944．Mason,H.S.,Man-kit,L.D.and Arntzen,C.J.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1992,89:11745-117495．Grill,L.K.,PBI Bulletin,1998,1:13-146．Haq,K.I.,et al.,Science,1995,268:714-7167．Mason,H.S.,et al.,Proc.Nati.Acad.Sci.USA,1996,93:5335-53408．Ma,J.K.,et al.,Science,1995,268:716-7199．Ma,S.W.and Jevnnikar,A.M.,PBI Bulletin,1998,1:6-810．Gans,P.R.,et al.,In Transgenic Plant:A Production System forIndustrial and Pharmaceutical Proteins,edited by M.R.L.Owen andJ.Pan.,John Wiley and Sons Ltd.,New York,NY.1996,pp281-29711．Krebbers,E.and van de Kerckhove,L.,Trends in Bioechnology,1990,8:1-312．Parmenter,D.L.,et al.,Plant Molecular Biology,1995,29:1167-118013．Higo,K.I.,Saito,Y.and Higo,H.,Biosci.Biotechnol.Biochem,1993,8:1-314．Matsumomo,S.,et al.,Biosci.Biotechnol.Biochem,1993,57:1249-125215．Bosch,D.,Smal.J.and Krebbers,E.,Transgenic Research,1994,3:304-31016．Sijmons,P.C.,et al.,Bio/Technology,1990,8:217-22117．Dezoeen,G.A.,et al.,Virology,1989,172:213-22218．Kumagai,M.H.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1993,90:427-43019．Hamamoto,H.,et al.,Bio/Technology,1993,11:930-93220．Sugiyama,Y.,et al.,FEBS Letters,1995,359:247-25021．Turpen,T.H.,et al.,Bio/Technology,1995,13:53-5722．Porta,C.,et al.,Virology,1994,202:949-95523．Dasgaard,K.,et al.,Nature Biotechnology,1997,15:248-25224．Fernandez-Fernandez,M.R.,et al.,FEBS Letters,1998,427:229-23525．琦組和等，中國科學B輯，1988,12:1300-130426．Horsch,R.B.,et al.,Science,1985,227:1229-123127．Mason,H.,et al.,Plant Molecular Biology,1988,11:845-85628．王躍駒，碩士研究生論文，1998，中國農(nóng)業(yè)科學院29．Chee,P.P.,Drong,R.F.and Slightom,J.L.,Plant Molecular BiologyManual,1991,C3:1-28
本發(fā)明的進一步描述只是一些特別的優(yōu)先實施方案，是按照專利申請要求和為了解釋和說明本專利的內(nèi)容。很顯然，在不背離本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)，可在此基礎(chǔ)上，做進一步的改進和變化。
權(quán)利要求
1．一種引起哺乳動物對病毒抗原蛋白產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，該方法包括使用有效和確定免疫劑量的、來源于能產(chǎn)生該抗原蛋白或其衍生物的轉(zhuǎn)基因植物的植物材料或其加工提取物對該哺乳動物進行口服或腸道給藥。
2．如權(quán)利要求1中的方法，其中所說的植物至少有一部分是可以食用的。
3．如權(quán)利要求1中的方法，其中所說的病毒抗原蛋白是乙型肝炎病毒包膜中蛋白。
4．一種抗原來自一種肝炎病毒，其中所說的抗原可以在植物中表達生產(chǎn)，且該抗原為蛋白質(zhì)，在自然狀態(tài)下具有免疫原性。
5．如權(quán)利要求4中的抗原，其中所說的植物至少有一部分是可以食用的。
6．如權(quán)利要求4中的抗原，其中所說的肝炎病毒是乙型肝炎病毒。
7．一種轉(zhuǎn)基因植物是能夠表達一種肝炎病毒蛋白的植物，該蛋白在自然狀態(tài)下具有免疫原性。
8．如權(quán)利要求7中的轉(zhuǎn)基因植物，其中所說的植物至少有一部分是可食用的。
9．如權(quán)利要求7中的轉(zhuǎn)基因植物，其中所說的肝炎病毒是乙型肝炎病毒。
10．一種乙型肝炎病毒包膜抗原在植物中表達，其中所說的抗原為蛋白質(zhì)，它在天然狀態(tài)下具有免疫原性，且可以作為一種藥物的有效組成部分。
11．一種食物至少是由轉(zhuǎn)基因植物的某一部分所組成，它被食用是因為它具有一定的營養(yǎng)價值，其中所說的植物是一種能夠表達乙型肝炎病毒包膜重組中蛋白抗原的植物，該抗原在天然狀態(tài)下具有免疫原性。
12．如權(quán)利要求11中的任何食物，其中所說的植物食用部分包括果實、葉子、莖、根或所說的植物種子。
13．一個用于轉(zhuǎn)化植物的質(zhì)粒載體包括一段編碼肝炎病毒蛋白抗原的DNA序列，該蛋白在天然狀態(tài)下具有免疫原性。一個與所說的DNA序列連接的植物啟動子，該啟動子操縱所說的基因在所說的植物中表達。
14．如權(quán)利要求13中的質(zhì)粒載體，它含有一個選擇或標記基因。
15．如權(quán)利要求13中的質(zhì)粒載體，其中所說的植物啟動子是花椰菜花葉病毒35S啟動子。
16．如權(quán)利要求13中的質(zhì)粒載體，其中所說的植物至少有一部分是可食用性的。
17．如權(quán)利要求13中的質(zhì)粒載體，其中所說的肝炎病毒蛋白抗原是乙型肝炎病毒包膜中蛋白。
18．一段用于基因槍法轉(zhuǎn)化植物的DNA序列包括一段編碼肝炎病毒蛋白抗原的DNA序列，該蛋白在天然狀態(tài)下具有免疫原性。一個與所說的DNA序列連接的植物啟動子，該啟動子操縱所說的基因在所說的植物中表達。
19．如權(quán)利要求18中的DNA序列，它含有一個選擇或標記基因。
20．如權(quán)利要求18中的DNA序列，其中所說的植物啟動子是花椰菜花葉病毒35S啟動子。
21．如權(quán)利要求18中的DNA序列，其中所說的植物至少有一部分是可食性的。
22．如權(quán)利要求18中的DNA序列，其中所說的肝炎病毒蛋白抗原是乙型肝炎包膜中蛋白。
23．一種構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物細胞的方法包括構(gòu)建一個質(zhì)粒載體或一段DNA序列，其中都含有編碼乙型肝炎病毒包膜中蛋白的基因和可操縱該基因在所說的植物中表達的植物啟動子，該蛋白在天然狀態(tài)下具有免疫原性。用該質(zhì)粒載體或該DNA序列轉(zhuǎn)化植物細胞。
24．如權(quán)利要求23中的方法，它包括從所說的轉(zhuǎn)基因植物細胞中再生出完整的轉(zhuǎn)基因植株。
25．生產(chǎn)一種膠囊、沖劑或其它制劑的方法包括構(gòu)建一個質(zhì)粒載體或一段DNA序列，其中都含有編碼乙型肝炎病毒包膜中蛋白的基因和可操縱該基因在所說的植物中表達的植物啟動子，該包膜蛋白在天然狀態(tài)下具有免疫原性。用該質(zhì)粒載體或該DNA序列轉(zhuǎn)化植物細胞。將轉(zhuǎn)基因植物的食用部分冷凍、干燥和磨碎后制作成膠囊、沖劑或其它制劑。
26．如權(quán)利要求25的方法，其中還包括在利用轉(zhuǎn)基因植物作為食物以及加工成膠囊、沖劑或其它制劑之前，應(yīng)從所說的轉(zhuǎn)基因植物細胞中再生出完整的轉(zhuǎn)基因植株。
27．如權(quán)利要求25中的方法，其中還包括從所說的植物細胞中部分純化或完全純化出所說的抗原蛋白作為膠囊、沖劑或其它制劑的活性組成部分。
28．如權(quán)利要求26中的方法，其中包括至少收獲所說的轉(zhuǎn)基因植物的某一部分。
29．如權(quán)利要求25中的方法，其中所說的植物細胞是通過農(nóng)桿菌系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的。
30．如權(quán)利要求29中的方法，其中所說的農(nóng)桿菌系統(tǒng)是農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒系統(tǒng)。
31．如權(quán)利要求25中的方法，其中所說的植物是番茄、馬鈴薯、萵苣、胡蘿卜、黃瓜或其它可食用的植物。
32．如權(quán)利要求25中的方法，其中所說的質(zhì)粒載體是一個雙元載體系統(tǒng)。
33．如權(quán)利要求25中的方法，其中所說的質(zhì)粒載體是一個整合性載體。
34．如權(quán)利要求25中的方法，其中所說的質(zhì)粒載體是pBI121。
35．如權(quán)利要求25中的方法，其中所說的植物細胞是通過除農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)以外的其它轉(zhuǎn)化方法如基因槍法、微管注射法、PEG吸收法以及電融合法等方法轉(zhuǎn)化的。
36．如權(quán)利要求25中的方法，其中所說的植物細胞是一個雙子葉植物的細胞，或是一個單子葉植物的細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及表達乙型肝炎病毒包膜中蛋白轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)方法,并進而通過直接食用或腸道給藥的方式利用這些含有乙型肝炎病毒包膜中蛋白的轉(zhuǎn)基因植物或者自這些轉(zhuǎn)基因植物中部分或完全純化出乙型肝炎病毒包膜中蛋白作為膠囊、沖劑或其它制劑的主要活性成份從而引起人或哺乳動物對該抗原蛋白的免疫應(yīng)答反應(yīng)。
文檔編號C12N15/31GK1308967SQ00109799
公開日2001年8月22日 申請日期2000年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月10日
發(fā)明者劉德虎, 李剛強 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所