專利名稱：與脂肪酸合成相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中與脂肪酸合成相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
裂壺藻是一種海洋微藻，與硅藻、褐藻等微藻同屬Stramenopiles門。裂壺藻的脂肪酸組成簡(jiǎn)單，DHA含量高，分離純化簡(jiǎn)單，是獲取天然高濃度DHA的良好資源。在脂肪酸合成過程中，乙酰輔酶A經(jīng)乙酰輔酶A羧化酶催化轉(zhuǎn)變?yōu)楸］o酶A 后，生物體內(nèi)的一系列脂肪酸合成酶就以丙二酰輔酶A為底物，繼續(xù)進(jìn)行脂肪酸的合成。丙二酰輔酶A在丙二酰輔酶A ?；d體蛋白轉(zhuǎn)酰基酶(MCAT)的催化作用下，將丙二酰輔酶 A上的丙二酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到完全?；d體蛋白(ACP)末尾的硫醇上，形成丙二酰-ACP蛋白復(fù)合物(Malonyl ACP)，作為第一步的反應(yīng)底物參與脂肪酸的合成與延伸。MCAT蛋白在脂肪酸的體內(nèi)合成過程中發(fā)揮了重要的功能，研究結(jié)果表明，在生物體內(nèi)MACT蛋白對(duì)于脂肪酸合成是必須的。在裂壺藻體內(nèi)，不飽和脂肪酸DHA的合成是通過一種全新的PKS合成途徑調(diào)控的，該途徑不需要多種脫氫酶和碳鏈延長(zhǎng)酶的參與，而是由一個(gè)類似聚酮合成酶O3KS) 的基因簇控制的，MCAT基因在裂壺藻的PKS合成途徑中發(fā)揮了重要的功能，為該途徑的合成提供必須的前提物質(zhì)。此外，MCAT還涉及到生物體內(nèi)聚酮類化合物的生物合成，MCAT與?；d體蛋白(ACP)、聚酮合酶和鏈長(zhǎng)因子異質(zhì)二聚體一起，組成了 II型聚酮的多聚乙酰合酶。MACT蛋白被認(rèn)為是連接生物體內(nèi)脂肪酸合成與聚酮合成之間的關(guān)鍵蛋白。因此，裂壺藻MACT蛋白基因的克隆與功能研究，將有助于進(jìn)一步的闡明裂壺藻體內(nèi)的DHA合成途徑的機(jī)制，并且對(duì)產(chǎn)油微生物及油料作用的基因工程改造具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供與脂肪酸合成相關(guān)的蛋白及其編碼基因。本發(fā)明所提供的與脂肪酸合成相關(guān)的蛋白，名稱為MCAT，來(lái)源于裂壺藻 (Schizochytrium sp.) TI01101，是如下 1)或 2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；幻將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與脂肪酸合成相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。上述與脂肪酸合成相關(guān)蛋白的編碼基因(命名為MCAT基因)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述與脂肪酸合成相關(guān)蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?)-3)中任一所述的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列1 ；2)在嚴(yán)格條件下與1)的基因雜交且編碼所述蛋白的基因；3)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的基因。上述嚴(yán)格條件可為用6XSSC，0. 5% SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2XSSC， 0. 1 % SDS 和 1 X SSC, 0. 1 % SDS 各洗膜一次。
序列表中序列1由1176個(gè)堿基組成，其開放閱讀框?yàn)樾蛄斜碇行蛄?自5’端第 1位至第1176位堿基，編碼具有序列表中序列2所示的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。序列表中序列2由391個(gè)氨基酸殘基組成。擴(kuò)增所述與脂肪酸合成相關(guān)蛋白的編碼基因全長(zhǎng)或其任一片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；所述引物對(duì)中，一條引物序列如序列表中序列6所示，另一條引物序列如序列表中序列7所示。含有所述與脂肪酸合成相關(guān)蛋白的編碼基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述表達(dá)盒是由啟動(dòng)子TEF1、權(quán)利要求2或3所述編碼基因和終止子CYCl依次連接而成；所述啟動(dòng)子TEFl的核苷酸序列如序列表中序列3所示；所述終止子CYCl的核苷酸序列如序列表中序列4所示。所述重組表達(dá)載體為在雙元載體pCAMBIA2301的多克隆位點(diǎn)間插入所述表達(dá)盒得到的重組表達(dá)載體。所述重組表達(dá)載體為在酵母表達(dá)載體pYES2. 0的多克隆位點(diǎn)間插入所述編碼基因得到的重組表達(dá)載體。所述重組菌為將所述與脂肪酸合成相關(guān)蛋白的編碼基因?qū)胨拗骶玫降闹亟M菌；所述與脂肪酸合成相關(guān)蛋白的編碼基因是通過所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主菌中；所述宿主菌為裂壺藻 Gchizochytrium sp.) TI01101CGMCC No. 4603。裂壺藻(Schizochytriumsp. ) TI01101CGMCC No. 4603 已在中國(guó)專利公報(bào)中公布， 公布日為2011年09月28日，公布號(hào)為CN 102188M1A。所述重組菌為將所述與脂肪酸合成相關(guān)蛋白的編碼基因?qū)胨拗骶玫降闹亟M菌；所述與脂肪酸合成相關(guān)蛋白的編碼基因是通過所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主菌中；所述宿主菌為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株INV&1。所述與脂肪酸合成相關(guān)的蛋白、所述與脂肪酸合成相關(guān)蛋白的編碼基因、所述表達(dá)盒、所述重組表達(dá)載體、所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或所述重組菌在合成脂肪酸中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。將本發(fā)明所提供的與脂肪酸合成相關(guān)蛋白的編碼基因MCAT轉(zhuǎn)入裂壺藻體內(nèi)后， 轉(zhuǎn)基因藻株的脂肪酸含量較野生型藻株提高了 38%以上，說(shuō)明MCAT基因在裂壺藻的脂肪酸合成過程中發(fā)揮了重要的功能，并且該基因的導(dǎo)入并不影響其原本的脂肪酸組成。該基因?qū)⒃诋a(chǎn)油微生物及油料作用的基因工程改造中發(fā)揮重要作用。


圖1為裂壺藻MCAT基因在大腸桿菌體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)及純化結(jié)果。圖2為裂壺藻MCAT基因?qū)︶劸平湍干锪康挠绊懡Y(jié)果。圖3為裂壺藻MCAT基因?qū)︶劸平湍钢舅峤M成及含量的影響結(jié)果。圖4為重組質(zhì)粒pCAMBIA2301-MCAT的結(jié)構(gòu)示意圖。圖5為裂壺藻基因工程藻株中MCAT基因的mRNA表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果。
圖6為裂壺藻MCAT基因?qū)α褖卦迳锪康挠绊懡Y(jié)果。圖7為裂壺藻MCAT基因?qū)α褖卦逯舅岷康挠绊懡Y(jié)果。圖8為裂壺藻MCAT基因?qū)α褖卦逯舅峤M成的影響結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、裂壺藻MCAT編碼基因的克隆及其功能驗(yàn)證一、裂壺藻MCAT編碼基因的克隆根據(jù)裂壺藻的EST文庫(kù)中MCAT基因的部分序列信息，利用已經(jīng)建立的裂壺藻EST 文庫(kù)，通過序列比對(duì)分析獲得了丙二酰輔酶A酰基載體蛋白轉(zhuǎn)?；?Malonyl-CoA :acyl carrier protein transacylase, MCAT)的部分序列，在MCAT基因的兩側(cè)設(shè)計(jì)反向引物 Reverse-MCAT-F/Reverse-MCAT-R，引物序列如下 Reverse-MCAT-F 5’ -AAGTAAATGTGACGATGCTGAAGC-3 ’，Reverse-MCAT-R 5’ -ATGGAATGGTGCAGAAACTCTTAG-3 ’。提取裂壺藻(Schizochytriumsp.) TI01101CGMCC No. 4603 (該裂壺藻已在中國(guó)專利公報(bào)中公布，公布日為2011年09月觀日，公布號(hào)為CN 102188541A)的基因組，以常規(guī)的 8 種限制性內(nèi)切酶(EcoRI，Hindi11，EcoRV, PstI, BglII, XhoI, KpnI, BamHI)對(duì)裂壺藻基因組進(jìn)行酶切后，利用T4DNA連接酶對(duì)酶切基因組進(jìn)行環(huán)化處理，以環(huán)化后的裂壺藻基因組為模板，利用Reverse-MCAT-F/Reverse-MCAT-R引物進(jìn)行反向PCR擴(kuò)增，具體的PCR擴(kuò)增程序如下:94°C預(yù)變性 5min，然后經(jīng) 30 個(gè)循環(huán)(94°C 30s,60°C lmin、72°C 5min)，72°C IOmin0裂壺藻Gchizochytrium sp. ) TI01101CGMCC No. 4603,以下簡(jiǎn)稱裂壺藻 S. TI01101。結(jié)果表明以HindIII的酶切環(huán)化產(chǎn)物為模板的PCR產(chǎn)物條帶單一，且大小大于 2000bp，故利用HindIII的酶切環(huán)化產(chǎn)物為模板擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，獲得裂壺藻 MCAT基因的側(cè)翼未知序列，結(jié)合MCAT的部分已知序列，獲得MCAT基因的全基因組序列。將MCAT基因的基因組序列利用軟件Genescan軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)，以去除其中可能的內(nèi)含子序列，結(jié)果表明MCAT基因的基因組序列中，不存在內(nèi)含子，獲得了 MCAT的理論編碼基因序列。根據(jù)MCAT的理論編碼基因序列，設(shè)計(jì)引物MCAT-F/MCAT-R擴(kuò)增MCAT基因的全長(zhǎng)序列，引物序列如下MCAT-F :ATGCGGACGTCGATTCTTG，MCAT-R TTACATTATATCTGAAAAA。提取裂壺藻S.TI01101的總RNA后，以隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得裂壺藻 S. TI01101的cDNAo以裂壺藻S. TI01101的cDNA為模板，利用引物MCAT-F/MCAT-R擴(kuò)增 MCAT基因序列，具體的PCR反應(yīng)條件如下94°C預(yù)變性5min，然后經(jīng)30個(gè)循環(huán)(94°C 30s、 58 °C lmin、72°C 2min),72°C IOmin0將PCR產(chǎn)物連接至pMD18_T載體(購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為D101A)中，獲得載體pMD-MCAT，測(cè)序后獲得了具有完整編碼區(qū)的裂壺藻MCAT的基因序列，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，其序列信息與理論預(yù)測(cè)結(jié)果完全一致。裂壺藻MCAT基因的cDNA序列全長(zhǎng)為1176bp，其開放閱讀框?yàn)樾蛄斜碇行蛄?自 5’端第1位至第1176位堿基，編碼具有序列表中序列2所示的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。 序列表中序列2由391個(gè)氨基酸殘基組成。二、裂壺藻MCAT基因功能驗(yàn)證1、裂壺藻MCAT基因的體外表達(dá)以質(zhì)粒pMD-MCAT為模板，利用引物BamHI-MCAT_F/EcoRI-MCAT-R引物，擴(kuò)增獲得兩側(cè)帶有BamHI/EcoRI酶切位點(diǎn)的裂壺藻MCAT基因的全長(zhǎng)序列。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物利用 BamHI/EcoRI進(jìn)行雙酶切，回收目的片段；同時(shí)用BamHI/EcoRI對(duì)表達(dá)載體pGEX_6P_l (購(gòu)自通用電氣醫(yī)療集團(tuán)，GE Healthcare Life Sciences，產(chǎn)品目錄號(hào)為沘-卯46_48)進(jìn)行雙酶切，回收載體中較大的片段，將回收的目的片段與載體大片段進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌Dffia(購(gòu)自Invitrogen，產(chǎn)品目錄號(hào)為1擬63_012)中，抗性篩選，挑取陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果表明在載體 PGEX-6P-1的BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)間插入了序列表中序列1所示的裂壺藻MCAT基因片段，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確，將重組載體命名為pGEX-MCAT。其中引物序列如下BamHI-MCAT-F CGGGATCCATGCGGACGTCGATTCTTG (序列表中序列 6)，EcoRI-MCAT-R GGAATTCTTACATTATATCTGAAAAA (序列表中序列 7)。將重組載體pGEX-MACT轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)自Invitrogen， 產(chǎn)品目錄號(hào)為C6000-0;3)中，挑取菌落接種至含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(lOOug/ml)中， 置37°C搖床過夜培養(yǎng)。過夜菌按接種量接種于新鮮的含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中， 在37°C，200rpm的情況下，培養(yǎng)至OD為0. 6-0. 8，加入終濃度為0. 2mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，于不同的時(shí)間(0小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí))取樣，離心收集菌體，進(jìn)行電泳檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果檢測(cè)結(jié)果見圖1 (圖1中，泳道M為Marker ；泳道1為誘導(dǎo)0小時(shí)；泳道2為誘導(dǎo)3小時(shí)；泳道3為誘導(dǎo)6小時(shí)；泳道4為經(jīng)GST純化后的目的蛋白)，從圖中可見，在加入IPTG誘導(dǎo)3小時(shí)后，即可檢測(cè)到明顯的電泳條帶(70Kda)。增加誘導(dǎo)時(shí)間(誘導(dǎo)6小時(shí)) 后，電泳檢測(cè)目標(biāo)蛋白的含量無(wú)顯著增加。此結(jié)果表明，克隆獲得的裂壺藻MCAT基因能夠在大腸桿菌體內(nèi)成功的獲得表達(dá)。將誘導(dǎo)3小時(shí)后的菌體離心收集后，利用Lysis buffer重懸菌體后，于_80°C冰箱中靜止1小時(shí)，對(duì)細(xì)胞壁進(jìn)行預(yù)處理。其中Lvsis buffer的組成為Tris 6. 057g/L, EDTA-2Na · 2H20 1.86g/L，NaCl 5. 84g/L，DTT 0. 77g/L,PMSF 0. 17g/L, Triton X-IOOlOml/ L ；pH 8. 0。將菌體取出后，在冰浴中超聲破碎至澄清，將裂解的菌液用12000rpm，4°C離心 15min,收集上清。利用預(yù)冷的平衡緩沖液PBS平衡GST純化柱10個(gè)柱體積后，將上述超聲破碎后的上清液加入GST純化柱，利用PBS緩沖液充分洗滌后，再用洗脫緩沖液洗脫約 10-15個(gè)柱體積，收集洗脫液進(jìn)行電泳檢測(cè)。其中PBS緩沖液的組成如下NaCl 8g/L, KCl 0. 2g/L, Na2HPO4L 44g/L, KH2PO4O. 24g/L ；pH 7. 4 ；洗脫緩沖液的組成如下
Tris 6. 057g/L，還原型谷胱甘肽 3. 08g/L ；pH 8. 0 ；電泳結(jié)果檢測(cè)如圖1所示，從圖中可見，通過GST純化柱獲得了純度較高的重組蛋白，通過電泳檢測(cè)其大小約為70Kda，與理論預(yù)測(cè)分子量一致，進(jìn)一步說(shuō)明成功克隆獲得了裂壺藻的MCAT基因。2、裂壺藻MCAT基因在酵母中的功能研究為了進(jìn)一步的驗(yàn)證裂壺藻MCAT基因的功能，將上述獲得的引入BamHI/EcoRI酶切位點(diǎn)的裂壺藻MCAT基因的全長(zhǎng)序列用BamHI/EcoRI酶切位點(diǎn)進(jìn)行雙酶切，回收目的片段；同時(shí)用BamHI/EcoRI對(duì)酵母表達(dá)載體pYES2. 0 (購(gòu)自hvitrogen公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為 V82520)進(jìn)行雙酶切，回收載體大片段，將回收的目的片段與載體大片段連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌Dffia(購(gòu)自^witrogen公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為1擬63_012)中，抗性篩選，挑取陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果表明在酵母表達(dá)載體PYES2. O的BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)間插入了序列表中序列1所示的裂壺藻 MCAT基因片段，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確，將重組載體命名為pYES-MACT。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株 INVScl (購(gòu)自hvitrogen公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為C810-00)，通過尿嘧啶缺陷型選擇性培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆子pYES-MCAT，同時(shí)以轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pYES2. O的釀酒酵母尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株 INVScl作為陰性對(duì)照(Control)。在尿嘧啶缺陷型選擇性培養(yǎng)基(購(gòu)自北京泛基諾科技有限公司，商品名稱為 Sc-Ura培養(yǎng)基)中，加入棉籽糖作為碳源，以利于外源基因裂壺藻MCAT在酵母細(xì)胞中的誘導(dǎo)表達(dá)，將過夜培養(yǎng)的酵母菌按照2%的接種量接種于200ml培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)3天后，收集菌體，計(jì)算干重以及細(xì)胞中的脂肪酸組成和含量。利用GC-MS分析脂肪酸組成，根據(jù)內(nèi)標(biāo)法計(jì)算其脂肪酸的含量。 脂肪酸含量測(cè)定過程如下準(zhǔn)確稱取待測(cè)樣品0. Ig于50mL比色管中，加入IOmL 0. 5M KOH-甲醇溶液振搖， 使之甲脂化，然后加入IOmLV(苯)％ V(正己烷)=1 1混合溶液萃取，超聲振蕩40min， 加入IOmL去離子水，搖勻，靜置分層，取上清液于3000rpm下離心5min，移取上清液待測(cè)。GC-MS分析采用安捷倫氣相色譜儀(689N0，America)，配有FID氫火焰檢測(cè)器， HP-IN-NOffxa polyethylene glyeol 極性柱(30. OmXO. 32mnX0. 50um)。柱溫采用四列段升溫程序150°C保持 Imin，150 升溫至 200°C (15°C /min)，200°C升溫至 250°C (3C°C /min)， 250°C保持5min。檢測(cè)器溫度。上樣模式不分流。載氣氮?dú)猓?0mL/min恒流。采用毛細(xì)管氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定樣品中脂肪酸的含量，以十七烷酸(C17:0)甲酯作為內(nèi)標(biāo)物，利用峰面積積分方法對(duì)脂肪酸的含量進(jìn)行定量分析。結(jié)果裂壺藻MCAT基因?qū)︶劸平湍干锪康挠绊懡Y(jié)果如圖2所示；裂壺藻MCAT 基因?qū)︶劸平湍钢舅峤M成及含量的影響結(jié)果如圖3所示，圖3中A為裂壺藻MCAT基因?qū)︶劸平湍钢舅峤M成的影響結(jié)果，圖3中B為裂壺藻MCAT基因?qū)︶劸平湍钢舅岷康挠绊懡Y(jié)果。從圖中可見，轉(zhuǎn)入裂壺藻MCAT基因的釀酒酵母細(xì)胞(pYES-MCAT)中，其生物量為1. 18g/L，陰性對(duì)照(Control)的生物量為1. 04g/L，結(jié)果表明，裂壺藻MCAT基因在釀酒酵母細(xì)胞INVkl中表達(dá)后能夠明顯提高其生物量(13% )；利用GC-MS分析脂肪酸組成， 表明裂壺藻MCAT基因過表達(dá)后不影響酵母細(xì)胞的脂肪酸組成。根據(jù)內(nèi)標(biāo)法計(jì)算其脂肪酸含量，轉(zhuǎn)入裂壺藻MCAT基因的釀酒酵母細(xì)胞(pYES-MCAT)中，其脂肪酸含量為1.3%，陰性對(duì)照(Control)的脂肪酸含量?jī)H為0. 85% ；利用相對(duì)脂肪酸含量的計(jì)算方法，以陰性對(duì)照 (Control)的脂肪酸含量為1，轉(zhuǎn)入裂壺藻MCAT基因的釀酒酵母細(xì)胞(pYES-MCAT)的脂肪酸含量為1.53。，結(jié)果表明，裂壺藻MCAT基因過表達(dá)后，酵母體內(nèi)的脂肪酸含量提高了 50% 以上。上述結(jié)果表明，裂壺藻MCAT基因能夠明顯提高酵母細(xì)胞的生物量和脂肪酸含量，但是不改變其原來(lái)的脂肪酸組成。實(shí)施例2、裂壺藻MCAT基因在提高裂壺藻脂肪酸含量中的應(yīng)用一、表達(dá)載體的構(gòu)建1、丙二酰輔酶A?；d體蛋白轉(zhuǎn)?；妇幋a基因(MCAT)的克隆以實(shí)施例1構(gòu)建得到的質(zhì)粒pMD-MCAT為模板，用EcoRI-MCAT-F和PstI-MCAT-R 組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。EcoRI-MCAT-F 5' -GGAATTCATGCGGACGTCGATTCTTG-3‘；PstI-MCAT-R 5' -AACTGCAGTTACATTATATCTGAAAAA-3‘。PCR反應(yīng)條件94 °C預(yù)變性5min，然后經(jīng)30個(gè)循環(huán)(94 °C 30s,58 °C 30s、 72°C 2min)，72°C IOmin0用限制性內(nèi)切酶EcoRI和I3StI雙酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收1200bp 的酶切產(chǎn)物。同時(shí)，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和I3StI雙酶切克隆載體pBluescript II SK+(購(gòu)自Mratagene公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為212205)，回收載體骨架(約3000bp)。將上述酶切產(chǎn)物及載體骨架連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a(購(gòu)自Invitrogen，產(chǎn)品目錄號(hào)為 18263-012)中，抗性篩選，挑取陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果表明在載體pBluescript II SK+的EcoRI和I^stI酶切位點(diǎn)間插入了序列表中序列1第1位-1176位所示的裂壺藻MCAT基因片段，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確，將重組載體命名為pBS-MCAT。2、MCAT基因表達(dá)模塊的構(gòu)建(1)以質(zhì)粒pGAPZaA(購(gòu)自hvitrogen公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為V205-20)為模板，用 TEF-F和TEF-R組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，即組成型啟動(dòng)子TEFljB 序列表的序列3所示。TEF-F 5' -CCCAAGCTTCCCACACACCATAGCTTC-3‘；TEF-R 5' -GGAATTCGGTTTAGTTCCTCACCTT-3‘。PCR反應(yīng)條件95 °C預(yù)變性5min，然后經(jīng)30個(gè)循環(huán)(94 °C 30s,56 °C 30s、 72°C lmin)，72°C IOmin。(2)用限制性內(nèi)切酶HindIII和EcoRI雙酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。(3)用限制性內(nèi)切酶HindIII和EcoRI雙酶切重組質(zhì)粒pBS_MCAT，回收載體骨架 (約 3800bp)。(4)將步驟⑵的酶切產(chǎn)物和步驟(3)的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒 pBS-TEF1-MCAT。(5)以質(zhì)粒pGAPZaA為模板，用CYCl-F和CYCl-R組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，即終止子CYC1，如序列表的序列4所示。CYCl-F 5' -AACTGCAGCACGTCCGACGGCGGCC-3’ ；CYCl-R 5' -CGGGATCCAGCTTGCAAATTAAAGCCT-3‘。
PCR反應(yīng)條件95 V預(yù)變性5min，然后經(jīng)30個(gè)循環(huán)(94 V 30s,56 V 30s、 72°C lmin)，72°C IOmin。(6)用限制性內(nèi)切酶I3StI和BamHI雙酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。(7)用限制性內(nèi)切酶I3StI和BamHI雙酶切重組質(zhì)粒pBS_TEFl-MCAT，回收載體骨架(約 4700bp)。(8)將步驟(6)的酶切產(chǎn)物和步驟(7)的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒 pBS-TEF1-MCAT-CYC1。3、重組質(zhì)粒 pCAMBIA2301_MCAT 的構(gòu)建(1)用限制性內(nèi)切酶HindIII和BamHI雙酶切重組質(zhì)粒pBS_TEFl-MCAT_CYCl，回收5000bp的酶切產(chǎn)物(MCAT基因的表達(dá)模塊TEFl-MCAT-CYC1)。(2)用限制性內(nèi)切酶見11(1111和83111!11雙酶切雙元載體？0六1^認(rèn)2301 (購(gòu)自 CAMBIA, Canberra, Australia.)，回收載體骨架(約 11600bp)。(3)將步驟⑴的酶切產(chǎn)物和步驟(2)的載體骨架連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌 DH5a(購(gòu)自Irwitrogen公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為18263-012)中，抗性篩選，挑取陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果表明在載體PCAMBIA2301 的HindIII和BamHI酶切位點(diǎn)間插入了序列表中序列5所示的基因片段(即MCAT基因的表達(dá)模塊TEF1-MCAT-CYC1)，其中，第1位到479位為組成型啟動(dòng)子TEFl序列，第486位到 1661位為MCAT基因序列，第1668位到1985位為終止子CYCl序列，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確，將重組載體命名為PCAMBIA2301-MCAT。重組質(zhì)粒pCAMBIA2301-MCAT的結(jié)構(gòu)示意圖見圖4。二、農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)裂壺藻的基因轉(zhuǎn)化1、農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備1)將農(nóng)桿菌LBA4404(購(gòu)自Invitrogen，產(chǎn)品目錄號(hào)為18313-015)在含利福平 40ug/ml，鏈霉素100ug/ml的YEB固體培養(yǎng)基上劃線，28°C培養(yǎng)48h ；2)挑取菌落到含利福平40ug/ml，鏈霉素100ug/ml的YEB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至 0D600 為 0. 5。3)冰上預(yù)冷菌體30min，在4200rpm，4°C離心IOmin收集菌體。4)利用ImM的pH 7. O的HEPS洗滌菌體三次，再用10 %的甘油洗滌一次后，利用 10%的甘油重懸菌體，分裝后保存與-80°C。2、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化將200ng的質(zhì)粒pCAMBIA2301-MCAT與40ul的農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞混合后按以下條件進(jìn)行電轉(zhuǎn)化U 1. 8kV ；R 200 Ω ；C 25uF。電擊完成后，加入900ul預(yù)冷的YEB培養(yǎng)基，
培養(yǎng)2- 后，取200ul涂布在含有利福平和鏈霉素的YEB平板上，28°C倒置培養(yǎng)48h。3、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的裂壺藻轉(zhuǎn)化1)裂壺藻原生質(zhì)體的制備將裂壺藻S.TI01101接種于YPD培養(yǎng)基中搖床中培養(yǎng)過夜。次日按照 (體積比)的接種量轉(zhuǎn)接入50ml新鮮的液體YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。以 4000rpm的轉(zhuǎn)速4°C離心5min收集藻細(xì)胞，利用預(yù)冷的無(wú)菌水洗滌藻細(xì)胞一次后加入IOml 酶處理液，28°C搖床中消化5-6小時(shí)，顯微鏡觀察裂壺藻形成原生質(zhì)體的狀態(tài)，當(dāng)90%以上裂壺藻細(xì)胞轉(zhuǎn)化為原生質(zhì)體時(shí)即可停止消化。
所述酶處理液組成如下由溶質(zhì)和溶劑組成；所述溶劑為20mM磷酸鹽緩沖液 (PH5.8)；所述溶質(zhì)及其濃度如下2% (質(zhì)量百分比)纖維素酶，2% (質(zhì)量百分比)蝸牛酶和 0. 7M KCl。2)農(nóng)桿菌細(xì)胞LBA4404的準(zhǔn)備挑取含有pCAMBIA2301-MCAT質(zhì)粒的重組農(nóng)桿菌至液體YEB培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，離心收集菌體，利用誘導(dǎo)培養(yǎng)基IM重懸稀釋調(diào)整農(nóng)桿菌的濃度為0D600 =0. 6-0. 8，并加入終濃度為250umol/L的乙酰丁香酮，28°C預(yù)誘導(dǎo)4_5小時(shí)。3)裂壺藻的轉(zhuǎn)化離心收集制備好的的原生質(zhì)體，用誘導(dǎo)培養(yǎng)基IM重懸后，加入得到的重組農(nóng)桿菌菌液中，28°C震蕩侵染14小時(shí)。離心獲得藻細(xì)胞與菌體混合培養(yǎng)物，涂布于固體YPD篩選培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)2-3天。挑取固體YPD篩選培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)化子克隆，得到轉(zhuǎn)基因藻株M5 和Mil。設(shè)未轉(zhuǎn)化的裂壺藻S.TI01101為野生型對(duì)照藻株。同時(shí)，用上述方法將空白雙元載體00六1^認(rèn)2301轉(zhuǎn)入裂壺藻5.1101101中，得到轉(zhuǎn)空載體對(duì)照裂壺藻株Al。4、轉(zhuǎn)基因藻株的鑒定轉(zhuǎn)基因藻株中MCAT基因的表達(dá)水平檢測(cè)為了檢測(cè)轉(zhuǎn)基因藻株中裂壺藻MCAT基因的表達(dá)水平，分別提取野生型藻株和轉(zhuǎn)基因藻株M5和Mll的總RNA，利用隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后獲得其cDNA，利用半定量引物 Q-MCAT-F/Q-MCAT-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)MCAT基因在mRNA表達(dá)水平的變化情況，其中利用 18S rRNA基因作為上樣對(duì)照。引物Q-MCAT-F/Q-MCAT-R 的序列如下Q-MCAT-F 5 ’ -GACGTCGATTCTTGCTAGTC-3 ’
Q-MCAT-R 5，-GACTAGCAAGAATCGACGTC-3，。結(jié)果如圖5所示，從圖中可見，轉(zhuǎn)基因藻株的MCAT基因的表達(dá)水平較野生型裂壺藻顯著提高，M5與Mll的MCAT基因的表達(dá)水平分別提高了 50%和60%，說(shuō)明MCAT基因已經(jīng)成功的轉(zhuǎn)入裂壺藻體內(nèi)，并提高了其在裂壺藻中的表達(dá)水平。5、轉(zhuǎn)基因藻株中生物量及脂肪酸含量的檢測(cè)將轉(zhuǎn)基因藻株M5和Mll在海水YPD中培養(yǎng)3天，離心收集藻體后進(jìn)行冷凍干燥， 計(jì)算其生物量，取Ig干藻粉利用Bligh-Dyer方法提取脂肪酸，計(jì)算其脂肪酸含量，并利用 GC-MS分析轉(zhuǎn)基因藻株的脂肪酸組成，分析條件與實(shí)施例1中相同，其中野生型裂壺藻作為對(duì)照。結(jié)果裂壺藻MCAT基因?qū)α褖卦迳锪康挠绊懡Y(jié)果如圖6所示；裂壺藻MCAT基因?qū)α褖卦逵椭康挠绊懡Y(jié)果如圖7所示。從圖6中可見，將裂壺藻MCAT基因轉(zhuǎn)入裂壺藻體內(nèi)后，轉(zhuǎn)基因藻株M5的生物量為14. 38g/L，轉(zhuǎn)基因藻株Mll的生物量為14. 56g/L，野生型裂壺藻的生物量為13. 45g/L ；轉(zhuǎn)基因藻株M3和Mll較野生型裂壺藻略微提高，分別提高了 6. 8%和8. 2%。從圖7中可見，轉(zhuǎn)基因藻株M5的油脂含量為59. 2%，轉(zhuǎn)基因藻株Mll 的油脂含量為61.1%，野生型裂壺藻的油脂含量為42. 6% ；與野生型裂壺藻相比，轉(zhuǎn)基因藻株M5與Mll的油脂含量顯著提高，分別比野生型裂壺藻的油脂含量提高了 38%和43%，并且GC-MS分析結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因裂壺藻的脂肪酸組成與野生型裂壺藻類似(圖8)，其中DHA
10的含量在43%左右。轉(zhuǎn)空載體對(duì)照裂壺藻株Al的生物量和油脂含量均與野生型裂壺藻無(wú)顯著差異。上述結(jié)果表明，裂壺藻中的MCAT基因在裂壺藻的脂肪酸合成過程中發(fā)揮了重要的功能，并且該基因的導(dǎo)入并不影響其原本的脂肪酸組成。
權(quán)利要求
1.一種蛋白，是如下1)或幻的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與脂肪酸合成相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因?yàn)槿缦?)-3)中任一所述的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列1；2)在嚴(yán)格條件下與1)的基因雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因；3)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。
4.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)盒，其特征在于所述表達(dá)盒是由啟動(dòng)子TEF1、權(quán)利要求 2或3所述編碼基因和終止子CYCl依次連接而成；所述啟動(dòng)子TEFl的核苷酸序列如序列表中序列3所示； 所述終止子CYCl的核苷酸序列如序列表中序列4所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體為在雙元載體pCAMBIA2301的多克隆位點(diǎn)間插入權(quán)利要求4或5所述的表達(dá)盒得到的重組表達(dá)載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體為在酵母表達(dá)載體pYES2. 0的多克隆位點(diǎn)間插入權(quán)利要求2或3所述編碼基因得到的重組表達(dá)載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組菌，其特征在于所述重組菌為將權(quán)利要求2或3所述的編碼基因?qū)胨拗骶玫降闹亟M菌；所述權(quán)利要求2或3所述的編碼基因是通過權(quán)利要求6所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主菌中；所述宿主菌為裂壺藻(khizochytrium sp.) TI01101CGMCC No. 4603。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組菌，其特征在于所述重組菌為將權(quán)利要求2或3所述的編碼基因?qū)胨拗骶玫降闹亟M菌；所述權(quán)利要求2或3所述的編碼基因是通過權(quán)利要求7 所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主菌中；所述宿主菌為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) 尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株INVkl。
10.權(quán)利要求1所述的蛋白、權(quán)利要求2或3所述的編碼基因和/或權(quán)利要求4-9中任一所述的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在合成脂肪酸中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了與脂肪酸合成相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的與脂肪酸合成相關(guān)的蛋白，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與脂肪酸合成相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。將本發(fā)明所提供的與脂肪酸合成相關(guān)蛋白的編碼基因MCAT轉(zhuǎn)入裂壺藻體內(nèi)后，轉(zhuǎn)基因藻株的脂肪酸含量較野生型藻株提高了38％以上，說(shuō)明MCAT基因在裂壺藻的脂肪酸合成過程中發(fā)揮了重要的功能，并且該基因的導(dǎo)入并不影響其原本的脂肪酸組成。該基因?qū)⒃诋a(chǎn)油微生物及油料作用的基因工程改造中發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102373189SQ201110350898
公開日2012年3月14日 申請(qǐng)日期2011年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月8日
發(fā)明者李科, 楊善軍, 林汝榕, 林祥志, 王昭凱, 程汝濱, 榮輝, 陳水波, 馬涌, 馬瑞娟 申請(qǐng)人:國(guó)家海洋局第三海洋研究所