專利名稱：獲得大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織的方法及其培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及獲得大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織的方法及其培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
大豆遺傳轉(zhuǎn)化方法有許多，其中以根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍介導(dǎo)法為主。但是，不管是根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法還是基因槍介導(dǎo)法，其遺傳轉(zhuǎn)化效率依舊低下，且轉(zhuǎn)化周期長。另一方面，隨著大豆EST序列等相關(guān)數(shù)據(jù)的不斷豐富以及基因組測序的完成，從大豆中克隆基因會變得更加容易，而對于基因功能驗(yàn)證的需求會更加迫切。低效、費(fèi)時(shí)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)難以滿足大豆基因功能驗(yàn)證日益增長的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種獲得大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織的方法。本發(fā)明所提供的獲得大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織的方法，包括以下步驟以大豆轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根為外植體I，用下述誘導(dǎo)大豆愈傷組織的培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)所述外植體I，即得到大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織。所述方法還包括用下述成套培養(yǎng)基中的繼代培養(yǎng)基培養(yǎng)大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織的步驟。所述大豆轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根是通過包括如下步驟的方法制備得到( I)以大豆子葉節(jié)為外植體II，用含有外源目的DNA的發(fā)根農(nóng)桿菌浸染所述外植體II，得到經(jīng)過所述發(fā)根農(nóng)桿菌浸染后的外植體II ；(2)將上述步驟⑴得到的經(jīng)過所述發(fā)根農(nóng)桿菌浸染后的外植體II用共培養(yǎng)基進(jìn)行共培養(yǎng)，得到共培養(yǎng)后的外植體II ;(3)將上述步驟(2)得到的所述共培養(yǎng)后的外植體II用根誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，即得到大豆轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根。所述步驟(2)中所述共培養(yǎng)基由以下成分組成NH4N03>KN03>KH2PO4,CaCl2 ·2H20,MgSO4 ·7Η20,KI,Na2MoO4 ·2Η20、H3BO3'CuSO4 ·5Η20、MnSO4 · Η20、CoCl2 · 6Η20、ZnSO4 · 7Η20、Na2EDTA · 2Η20、FeSO4 · 7Η20、煙酸、肌醇、鹽酸硫胺素、
鹽酸吡哆醇、甘氨酸、乙酰丁香酮、赤霉素、L-半胱氨酸、二硫蘇糖醇、蔗糖、瓊脂和水；以上成分在所述共培養(yǎng)基中濃度分別為NH4NO3O. 825g/L、KNO3O. 95g/L、KH2PO4O. 085g/L、CaCl2 · 2H20 0. 22g/L、MgSO4 · 7H200. 185g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3B036 . 2mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 ·Η20 16. 9mg/L、CoCl2 ·6Η20 0. 025mg/L、ZnS04 ·7Η20 8. 6mg/L,Na2EDTA ·2Η20 27. 8mg/L、FeSO4 · 7H20 37. 3mg/L、煙酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、鹽酸硫胺素 0. lmg/L、鹽酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸 2. Omg/L、乙酰丁香酮 40mg/L、赤霉素 O. 25mg/L、L-半胱氨酸 400mg/L、二硫蘇糖醇154mg/L、鹿糖30mg/L和瓊脂7g/L ；所述共培養(yǎng)基的pH值為5. 4 ;
所述步驟(3)中所述根誘導(dǎo)培養(yǎng)基由包括以下成分的物質(zhì)組成NH4N03>KN03>KH2PO4,CaCl2 .2H20、MgS04.7H20、K1、Na2Mo04 .2H20、H3BO3XuSO4 .5H20、MnSO4 H20、CoCl2 6H20、ZnSO4 7H20、Na2EDTA 2H20、FeSO4 7H20、煙酸、肌醇、鹽酸硫胺素、
鹽酸吡哆醇、甘氨酸、特美汀、頭孢噻肟、羧芐青霉素、蔗糖和水；以上成分在所述根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中濃度分別為NH4NO3O. 825g/L、KNO3O. 95g/L、KH2PO4O. 085g/L、CaCl2 2H20 0. 22g/L、MgSO4 7H200. 185g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 2H20 0. 25mg/L、H3B036 . 2mg/L、CuSO4 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 *H20 16. 9mg/L、CoCl2 *6H20 0. 025mg/L、ZnS04 *7H20 8. 6mg/L,Na2EDTA *2H20 27. 8mg/L、FeSO4 7H20 37. 3mg/L、煙酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、鹽酸硫胺素 0. lmg/L、鹽酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸2. Omg/L、特美汀50mg/L、頭孢噻廂100mg/L、羧節(jié)青霉素100mg/L和鹿糖30mg/L ；所述根誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基的pH值為5. 7。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供誘導(dǎo)大豆愈傷組織的培養(yǎng)基。本發(fā)明所提供的誘導(dǎo)大豆愈傷組織的培養(yǎng)基，由下述質(zhì)量份的營養(yǎng)成分組成大量元素以NH4NO3計(jì)825份、微量元素以KI計(jì)0. 83份、鐵鹽以FeSO4 *7H20計(jì)37. 3份、有機(jī)成分以煙酸計(jì)0. 5份、生長素、6-芐氨基嘌呤0. 5份-1. 0份和蔗糖30份；所述生長素為2，4- 二氯苯氧乙酸1. 0份`-3. 0份或萘乙酸1. 0-3. 0份；所述大量元素由下述質(zhì)量份的物質(zhì)組成NH4N03825 份、KN03950 份、KH2P0485 份、CaCl2 2H20 220 份和 MgSO4 7H20 185 份；所述微量元素由下述質(zhì)量份的物質(zhì)組成KI 0. 83 份、Na2MoO4 2H20 0. 25 份、H3B036. 2 份、CuSO4 5H20 0. 025 份、MnSO4 .H2O16. 9 份、CoCl2 6H20 0. 025 份和 ZnSO4 7H20 8. 6 份;所述鐵鹽由下述質(zhì)量份的物質(zhì)組成Na2EDTA 2H20 27. 8 份和 FeSO4 7H20 37. 3 份；所述有機(jī)成分由下述質(zhì)量份的物質(zhì)組成煙酸0. 5份、肌醇100份、鹽酸硫胺素0.1份、鹽酸吡哆醇0. 5份和甘氨酸2. 0份。所述培養(yǎng)基由以下成分組成NH4N03>KN03>KH2PO4,CaCl2 2H20,MgSO4 *7H20,KI,Na2MoO4 *2H20,H3B03>CuS04 .5H20、MnSO4 H20、CoCl2 6H20、ZnSO4 7H20、Na2EDTA 2H20、FeSO4 7H20、煙酸、肌醇、鹽酸硫胺素、
鹽酸吡哆醇、甘氨酸、生長素、6-芐氨基嘌呤、蔗糖和水；所述生長素為2，4_ 二氯苯氧乙酸或萘乙酸；以上成分在所述培養(yǎng)基中濃度分別為NH4NO3O. 825g/L、KNO3O. 95g/L、KH2PO4O. 085g/L、CaCl2 2H20 0. 22g/L、MgSO4 7H200. 185g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 2H20 0. 25mg/L、H3B036 . 2mg/L、CuSO4 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 *H20 16. 9mg/L、CoCl2 *6H20 0. 025mg/L、ZnS04 *7H20 8. 6mg/L,Na2EDTA *2H20 27. 8mg/L、FeSO4 7H20 37. 3mg/L、煙酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、鹽酸硫胺素 0. lmg/L、鹽酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸2. Omg/L、生長素、6-節(jié)氨基嘌呤0. 5mg/L_l. Omg/L和鹿糖30mg/L ;所述生長素為2,4- 二氯苯氧乙酸1. Omg/L-3. Omg/L或萘乙酸1. Omg/L-3. Omg/L。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供誘導(dǎo)大豆愈傷組織的固體培養(yǎng)基。
本發(fā)明所提供的誘導(dǎo)大豆愈傷組織的固體培養(yǎng)基，是由凝固劑和上述誘導(dǎo)大豆愈傷組織的培養(yǎng)基配成的固體培養(yǎng)基。所述凝固劑在所述固體培養(yǎng)基中的濃度為7g/L ；所述凝固劑為瓊脂。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供用于獲得大豆愈傷組織的成套培養(yǎng)基。本發(fā)明所提供的用于獲得大豆愈傷組織的成套培養(yǎng)基，由誘導(dǎo)大豆愈傷組織的培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基獨(dú)立包裝組成；所述誘導(dǎo)大豆愈傷組織的培養(yǎng)基和所述繼代培養(yǎng)基均獨(dú)立包裝；所述繼代培養(yǎng)基由以下成分組成NH4N03>KN03>KH2PO4,CaCl2 .2H20、MgS04.7H20、K1、Na2Mo04 .2H20、H3BO3XuSO4 .5H20、MnSO4 H2O, CoCl2 6H20、ZnSO4 7H20、Na2EDTA 2H20、FeSO4 7H20、煙酸、肌醇、鹽酸硫胺
素、鹽酸吡哆醇、甘氨酸、2，4_ 二氯苯氧乙酸、6-芐氨基嘌呤、N-苯基-N' -1，2，3-噻二唑-5-脲、二硫蘇糖醇、蔗糖和水；以上成分在所述繼代培養(yǎng)基中濃度分別為NH4NO3O. 825g/L、KNO3O. 95g/L、KH2PO4O. 085g/L、CaCl2 2H20 0. 22g/L、MgSO4 7H200. 185g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 2H20 0. 25mg/L、H3B036 . 2mg/L、CuSO4 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 *H2016. 9mg/L、CoCl2 6H20 0. 025mg/L、ZnSO4 7H20 8. 6mg/L、Na2EDTA 2H20 27. 8mg/L、FeSO4 7H20 37. 3mg/L、煙酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、鹽酸硫胺素 0. lmg/L、鹽酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸2. Omg/L、2,4- 二氯苯氧乙酸0. 05mg/L、6_節(jié)氨基嘌呤0. 9mg/L、N-苯基-N' -1,2, 3-噻二唑-5-脲 0. 2mg/L、二硫蘇糖醇 150mg/L 和蔗糖 30mg/L ；

所述繼代培養(yǎng)基的pH值為5. 8。利用本發(fā)明所提供的獲得大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織的方法，能快速、簡單、高效的獲得大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織。在大豆生物技術(shù)相關(guān)領(lǐng)域尤其在根系生長發(fā)育相關(guān)基因、抗根部病害基因和耐逆基因的功能驗(yàn)證中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。


圖1為將大豆種子用氯氣熏蒸消毒。圖2為大豆種子在發(fā)芽培養(yǎng)基上的發(fā)芽情況。圖3為大豆子葉節(jié)外植體與發(fā)根農(nóng)桿菌在共培養(yǎng)基上共培養(yǎng)。圖4為共培養(yǎng)后的外植體在根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)得到的大豆轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根。圖5為轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根的GUS檢測結(jié)果，左側(cè)為陰性對照；右側(cè)為GUS陽性轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根。圖6為將轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)得到的轉(zhuǎn)基因愈傷組織。圖7為轉(zhuǎn)基因愈傷組織在繼代培養(yǎng)基上的生長情況。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、獲得大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織
方法I一、獲得大豆轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根1、制備大豆子葉節(jié)外植體將成熟的大豆種子用氯氣熏蒸消毒16小時(shí)(圖1)，然后將消毒后的種子接種于發(fā)芽培養(yǎng)基(B5培養(yǎng)基)上，置于24°C光照培養(yǎng)箱(16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)中培養(yǎng)5天(圖2)。將大豆幼苗從培養(yǎng)基中剪下，去除種皮，保留3-5mm的下胚軸，沿下胚軸豎直切開兩片子葉，剝離胚芽，沿子葉處劃傷8-10次，作為待轉(zhuǎn)化的大豆子葉節(jié)外植體。2、農(nóng)桿菌工程菌液的制備及浸染將含有GUS基因的質(zhì)粒pGFPGUSPlus(公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得，記載過該材料的非專利文獻(xiàn)是Claudia E. Vickers, Peer M. Schenk, Dongxue Li, etal.pGFPGUSPlus, a new binary vector for gene expression studies and optimisingtransformation systems in plants. Biotechnol Lett, 2007, 29 :1793-1796)通過電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌K599 (公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得，記載過該材料的非專利文獻(xiàn)是Claudia E. Vickers, Peer M. S chenk, Dongxue Li, et al. pGFPGUSPlus, a newbinary vector for gene expression studies and optimising transformation systemsin plants. Biotechnol Lett, 2007, 29 :1793-1796)，得到含有 GUS 基因的農(nóng)桿菌 K599 ;將含有GUS基因的農(nóng)桿菌K599單菌落接種于5ml含卡那霉素(100mg/L)的YEP液體培養(yǎng)基中，28°C、200rpm振蕩過夜培養(yǎng)；取Iml菌液加入50ml含卡那霉素(100mg/l)的YEP液體培養(yǎng)基中；28°C、200rpm振蕩培養(yǎng)，待菌液的濃度達(dá)到OD6tltl = 0. 5后，4°C、3500rpm離心10分鐘收集菌體，并將菌體重懸于液體共培養(yǎng)基中至OD6tltl = 0.3,將上步制備好的大豆子葉節(jié)外植體浸泡于菌液中浸染30分鐘。所述液體共培養(yǎng)基由以下成分組成NH4N03>KN03>KH2PO4,CaCl2 2H20,MgSO4 *7H20,KI,Na2MoO4 *2H20,H3B03>CuS04 .5H20、MnSO4 H20、CoCl2 6H20、ZnSO4 7H20、Na2EDTA 2H20、FeSO4 7H20、煙酸、肌醇、鹽酸硫胺素、
鹽酸吡哆醇、甘氨酸、乙酰丁香酮(AS)、赤霉素(GA3)、L-半胱氨酸(L-cysteine)、二硫蘇糖醇(DTT)、蔗糖和水；以上成分在所述液體共培養(yǎng)基中濃度分別為NH4NO3O. 825g/L、KNO3O. 95g/L、KH2PO4O. 085g/L、CaCl2 2H20 0. 22g/L、MgSO4 7H200. 185g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 2H20 0.25mg/L、H3B036 .2mg/L、CuSO4 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 *H20 16. 9mg/L、CoCl2 *6H20 0. 025mg/L、ZnS04 *7H20 8. 6mg/L,Na2EDTA *2H20 27. 8mg/L、FeSO4 7H20 37. 3mg/L、煙酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、鹽酸硫胺素 0. lmg/L、鹽酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸 2. 0mg/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、赤霉素(GA3)0. 25mg/L、L-半胱氨酸(L-cysteine) 400mg/L、二硫蘇糖醇(DTT) 154mg/L 和鹿糖 30mg/L ；所述液體共培養(yǎng)基的pH值為5. 4。3、大S 子葉節(jié)外植體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)將上述步驟2經(jīng)過農(nóng)桿菌浸染后的大豆子葉節(jié)外植體用無菌濾紙吸干表面多余的菌液，然后切口向下平鋪于表面蓋有無菌濾紙的固體共培養(yǎng)基上，置于24°C光照培養(yǎng)箱(16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)中培養(yǎng)5天(圖3)，得到共培養(yǎng)后的大豆子葉節(jié)外植體。所述固體共培養(yǎng)基由以下成分組成
NH4N03、KN03、KH2P04、CaCl2 2H20,MgSO4 *7H20,KI,Na2MoO4 *2H20,H3BO3,CuSO4 .5H20、MnSO4 H20、CoCl2 6H20、ZnSO4 7H20、Na2EDTA 2H20、FeSO4 7H20、煙酸、肌醇、鹽酸硫胺素、
鹽酸吡哆醇、甘氨酸、乙酰丁香酮(AS)、赤霉素(GA3)、L-半胱氨酸(L-cysteine)、二硫蘇糖醇(DTT)、蔗糖、瓊脂和水；以上成分在所述共培養(yǎng)基中濃度分別為NH4NO3O. 825g/L、KNO3O. 95g/L、KH2PO4O. 085g/L、CaCl2 2H20 0. 22g/L、MgSO4 7H200. 185g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 2H20 0. 25mg/L、H3B036 . 2mg/L、CuSO4 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 *H20 16. 9mg/L、CoCl2 *6H20 0. 025mg/L、ZnS04 *7H20 8. 6mg/L,Na2EDTA *2H20 27. 8mg/L、FeSO4 7H20 37. 3mg/L、煙酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、鹽酸硫胺素 0. lmg/L、鹽酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸 2. Omg/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、赤霉素(GA3)0. 25mg/L、L-半胱氨酸(L-cysteine) 400mg/L、二硫蘇糖醇(DTT) 154mg/L、鹿糖 30mg/L 和瓊脂 7g/L ；所述共培養(yǎng)基的pH值為5. 4。4、轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根的誘導(dǎo)用根誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基清洗上述步驟3得到的共培養(yǎng)后的大豆子葉節(jié)外植體3次，用無菌濾紙除去表面菌液，將子葉朝下插入根誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基(含14mg/L潮霉素作為篩選劑)中，置于24°C光照培養(yǎng)箱(16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)中培養(yǎng)2-3周，誘導(dǎo)產(chǎn)生發(fā)狀根(圖 4)。

根誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基由以下成分組成NH4NO3^KN03>KH2PO4,CaCl2 2H20,MgSO4 *7H20,KI,Na2MoO4 *2H20,H3BO3^CuSO4 .5H20、MnSO4 H2O, CoCl2 6H20、ZnSO4 7H20、Na2EDTA 2H20、FeSO4 7H20、煙酸、肌醇、鹽酸硫胺素、鹽酸批哆醇、甘氨酸、特美汀(Timentin)、頭孢噻月虧(Cefotaxime)、羧節(jié)青霉素(Carbenicillin)、鹿糖和水；以上成分在所述根誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基中濃度分別為 NH4NO3O. 825g/L、KNO3O. 95g/L、KH2PO4O. 085g/L、CaCl2 2H20 0. 22g/L、MgSO4 7H200. 185g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 2H20 0. 25mg/L、H3B036 . 2mg/L、CuSO4 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 *H20 16. 9mg/L、CoCl2 *6H20 0. 025mg/L、ZnS04 *7H20 8. 6mg/L,Na2EDTA *2H20 27. 8mg/L、FeSO4 7H20 37. 3mg/L、煙酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、鹽酸硫胺素 0. lmg/L、鹽酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸 2. 0mg/L、特美汀(Timentin) 50mg/L、頭抱噻月虧(Cefotaxime) 100mg/L、羧節(jié)青霉素(Carbenicillin) 100mg/L 和鹿糖 30mg/L ；所述根誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基的pH值為5. 7。所述根誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基是由所述根誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基、瓊脂和相應(yīng)篩選劑配成的固體培養(yǎng)基；其中瓊脂在根誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基中的濃度為7g/L ;相應(yīng)的篩選劑為潮霉素，潮霉素在根誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基中的濃度為14mg/L。二、大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)1、誘導(dǎo)大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織將經(jīng)⑶S組織化學(xué)染色檢測驗(yàn)證證實(shí)的轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根(圖5)的根尖段作為外植體，放入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于24°C黑暗條件下培養(yǎng)3周(圖6)，得到大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均值，每個(gè)重復(fù)設(shè)30個(gè)外植體。
愈傷組織誘導(dǎo)率=(誘導(dǎo)的根數(shù)/產(chǎn)生愈傷組織的根數(shù)X 100% )。結(jié)果為愈傷組織誘導(dǎo)率為100%。所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基由以下成分組成NH4N03>KN03>KH2PO4,CaCl2 .2H20、MgS04.7H20、K1、Na2Mo04 .2H20、H3BO3XuSO4 .5H20、MnSO4 H20、CoCl2 6H20、ZnSO4 7H20、Na2EDTA 2H20、FeSO4 7H20、煙酸、肌醇、鹽酸硫胺素、
鹽酸吡哆醇、甘氨酸、2，4- 二氯苯氧乙酸、6-芐氨基嘌呤、蔗糖和水；以上成分在所述培養(yǎng)基中濃度分別為NH4NO3O. 825g/L、KNO3O. 95g/L、KH2PO4O. 085g/L、CaCl2 2H20 0. 22g/L、MgSO4 7H200. 185g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 2H20 0. 25mg/L、H3B036. 2mg/L、CuSO4 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 H2O 16. 9mg/L、CoCl2 6H20 0. 025mg/L、ZnSO4 7H20 8. 6mg/L、Na2EDTA 2H2027. 8mg/L、FeSO4 7H20 37. 3mg/L、煙酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、鹽酸硫胺素 0. lmg/L、鹽酸批口多醇0. 5mg/L、甘氨酸2. 0mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸1. 0mg/L、6_節(jié)氨基嘌呤0. 5mg/L和鹿糖 30mg/L ；所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH值為5. 8。二、繼代培養(yǎng)大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織將得到的大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基中，置于24°C光照培養(yǎng)箱(16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)中培養(yǎng)(圖7)，每兩周繼代一次。所述繼代培養(yǎng)基由以下成分組成NH4N03>KN03>KH2PO4,CaCl2 2H20,MgSO4 *7H20,KI,Na2MoO4 *2H20,H3BO3^CuSO4 .5H20、MnSO4 H2O, CoCl2 6H20、ZnSO4 7H20、Na2EDTA 2H20、FeSO4 7H20、煙酸、肌醇、鹽酸硫胺
素、鹽酸吡哆醇、甘氨酸、2，4_ 二氯苯氧乙酸、6-芐氨基嘌呤、N-苯基-N' -1,2,3-噻二唑-5-脲(TDZ)、二硫蘇糖醇(DTT)、蔗糖和水；以上成分在所述繼代培養(yǎng)基中濃度分別為NH4NO3O. 825g/L、KNO3O. 95g/L、KH2PO4O. 085g/L、CaCl2 2H20 0. 22g/L、MgSO4 7H200. 185g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 2H20 0. 25mg/L、H3B036. 2mg/L、CuSO4 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 H2O 16. 9mg/L、CoCl2 6H20 0. 025mg/L、ZnSO4 7H20 8. 6mg/L、Na2EDTA 2H2027. 8mg/L、FeSO4 7H20 37. 3mg/L、煙酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、鹽酸硫胺素 0. lmg/L、鹽酸批口多醇0. 5mg/L、甘氨酸2. 0mg/L、2,4- 二氯苯氧乙酸0. 05mg/L、6_節(jié)氨基嘌呤0. 9mg/L、N-苯基-N' -1,2, 3-噻二唑-5-脲 0. 2mg/L、二硫蘇糖醇 150mg/L 和蔗糖 30mg/L ；所述繼代培養(yǎng)基的pH值為5. 8。方法II一、獲得大豆轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根1、制備大豆子葉節(jié)外植體制備大豆子葉節(jié)外植體的與方法I相同。

結(jié)果與方法I無顯著差異。2、農(nóng)桿菌工程菌液的制備及浸染農(nóng)桿菌工程菌液的制備及浸染方法與方法I相同。結(jié)果與方法I無顯著差異。3、大S 子葉節(jié)外植體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)
共培養(yǎng)方法與方法I相同。結(jié)果與方法I無顯著差異。4、轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根的誘導(dǎo)方法與方法I相同。結(jié)果與方法I無顯著差異。二、大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)1、誘導(dǎo)大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織將經(jīng)⑶S檢測驗(yàn)證證實(shí)的轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根的根尖段作為外植體，放入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于24°C黑暗條件下培養(yǎng)4周，得到大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果取平均值，每個(gè)重復(fù)設(shè)30個(gè)外植體。愈傷組織誘導(dǎo)率=(誘導(dǎo)的根數(shù)/產(chǎn)生愈傷組織的根數(shù)X 100% )。

結(jié)果為愈傷組織誘導(dǎo)率為100%。所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基由以下成分組成NH4N03>KN03>KH2PO4,CaCl2 2H20,MgSO4 *7H20,KI,Na2MoO4 *2H20,H3BO3^CuSO4 .5H20、MnSO4 H20、CoCl2 6H20、ZnSO4 7H20、Na2EDTA 2H20、FeSO4 7H20、煙酸、肌醇、鹽酸硫胺素、
鹽酸吡哆醇、甘氨酸、2，4-二氯苯氧乙酸、6-芐氨基嘌呤、蔗糖、瓊脂和水；以上成分在所述培養(yǎng)基中濃度分別為NH4NO3O. 825g/L、KNO3O. 95g/L、KH2PO4O. 085g/L、CaCl2 2H20 0. 22g/L、MgSO4 7H200. 185g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 2H20 0. 25mg/L、H3B036 . 2mg/L、CuSO4 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 *H20 16. 9mg/L、CoCl2 *6H20 0. 025mg/L、ZnS04 *7H20 8. 6mg/L,Na2EDTA *2H20 27. 8mg/L、FeSO4 7H20 37. 3mg/L、煙酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、鹽酸硫胺素 0. lmg/L、鹽酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸2. 0mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸3. 0mg/L、6_節(jié)氨基嘌呤0. 5mg/L、鹿糖30mg/L和瓊脂7g/L ；所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH值為6. 5。二、繼代培養(yǎng)大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織繼代培養(yǎng)的方法與方法I相同。結(jié)果與方法I無顯著差異。方法III一、獲得大豆轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根1、制備大豆子葉節(jié)外植體制備大豆子葉節(jié)外植體的與方法I相同。結(jié)果與方法I無顯著差異。2、農(nóng)桿菌工程菌液的制備及浸染農(nóng)桿菌工程菌液的制備及浸染方法與方法I相同。結(jié)果與方法I無顯著差異。3、大S 子葉節(jié)外植體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)共培養(yǎng)方法與方法I相同。結(jié)果與方法I無顯著差異。4、轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根的誘導(dǎo)
轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根的誘導(dǎo)方法與方法I相同。結(jié)果與方法I無顯著差異。二、大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代1、誘導(dǎo)大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織將經(jīng)⑶S檢測驗(yàn)證證實(shí)的轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根的根尖段作為外植體，放入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于24°C黑暗條件下培養(yǎng)3周，得到大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均值，每個(gè)重復(fù)設(shè)30個(gè)外植體。愈傷組織誘導(dǎo)率=(誘導(dǎo)的根數(shù)/產(chǎn)生愈傷組織的根數(shù)X 100% )。結(jié)果為愈傷組織誘導(dǎo)率為100%。所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基由以下成分組成
·
NH4N03>KN03>KH2PO4,CaCl2 2H20,MgSO4 *7H20,KI,Na2MoO4 *2H20,H3BO3^CuSO4 .5H20、MnSO4 H20、CoCl2 6H20、ZnSO4 7H20、Na2EDTA 2H20、FeSO4 7H20、煙酸、肌醇、鹽酸硫胺素、
鹽酸吡哆醇、甘氨酸、萘乙酸、6-芐氨基嘌呤、蔗糖和水；以上成分在所述培養(yǎng)基中濃度分別為NH4NO3O. 825g/L、KNO3O. 95g/L、KH2PO4O. 085g/L、CaCl2 2H20 0. 22g/L、MgSO4 7H200. 185g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 2H20 0. 25mg/L、H3B036 . 2mg/L、CuSO4 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 *H20 16. 9mg/L、CoCl2 *6H20 0. 025mg/L、ZnS04 *7H20 8. 6mg/L,Na2EDTA *2H20 27. 8mg/L、FeSO4 7H20 37. 3mg/L、煙酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、鹽酸硫胺素 0. lmg/L、鹽酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸2. Omg/L、萘乙酸1. 0mg/L、6_節(jié)氨基嘌呤1. Omg/L和鹿糖30mg/L。所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH值為7. 3。二、繼代培養(yǎng)大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織繼代培養(yǎng)的方法與方法I相同。結(jié)果與方法I無顯著差異。方法IV一、獲得大豆轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根1、制備大豆子葉節(jié)外植體制備大豆子葉節(jié)外植體的與方法I相同。結(jié)果與方法I無顯著差異。2、農(nóng)桿菌工程菌液的制備及浸染農(nóng)桿菌工程菌液的制備及浸染方法與方法I相同。結(jié)果與方法I無顯著差異。3、大S 子葉節(jié)外植體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)共培養(yǎng)方法與方法I相同。結(jié)果與方法I無顯著差異。4、轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根的誘導(dǎo)方法與方法I相同。結(jié)果與方法I無顯著差異。二、大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代1、誘導(dǎo)大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織
將經(jīng)GUS檢測驗(yàn)證證實(shí)的轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根的根尖段作為外植體，放入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于24°C黑暗條件下培養(yǎng)4周，得到大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果取平均值,每個(gè)重復(fù)設(shè)30個(gè)外植體。愈傷組織誘導(dǎo)率=(誘導(dǎo)的根數(shù)/產(chǎn)生愈傷組織的根數(shù)X 100% )。結(jié)果為愈傷組織誘導(dǎo)率為100%。所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基由以下成分組成NH4N03>KN03>KH2PO4,CaCl2 2H20,MgSO4 *7H20,KI,Na2MoO4 *2H20,H3BO3^CuSO4 .5H20、MnSO4 H20、CoCl2 6H20、ZnSO4 7H20、Na2EDTA 2H20、FeSO4 7H20、煙酸、肌醇、鹽酸硫胺素、
鹽酸吡哆醇、甘氨酸、萘乙酸、6-芐氨基嘌呤、蔗糖和水；以上成分在所述培養(yǎng)基中濃度分別為 NH4NO3O. 825g/L、KNO3O. 95g/L、KH2PO4O. 085g/L、CaCl2 2H20 0. 22g/L、MgSO4 7H200. 185g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 2H20 0. 25mg/L、H3B036 . 2mg/L、CuSO4 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 *H20 16. 9mg/L、CoCl2 *6H20 0. 025mg/L、ZnS04 *7H20 8. 6mg/L,Na2EDTA *2H20 27. 8mg/L、FeSO4 7H20 37. 3mg/L、煙酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、鹽酸硫胺素 0. lmg/L、鹽酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸2. Omg/L、萘乙酸3. 0mg/L、6_節(jié)氨基嘌呤1. Omg/L和鹿糖30mg/L。 所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH值為7. 3。
權(quán)利要求
1.一種獲得大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織的方法，包括以下步驟 以大豆轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根為外植體I，用權(quán)利要求5-9中任一所述的培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)所述外植體I，即得到大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于 所述方法還包括用權(quán)利要求10中所述的成套培養(yǎng)基中的繼代培養(yǎng)基培養(yǎng)大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織的步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于 所述大豆轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根是通過包括如下步驟的方法制備得到 (1)以大豆子葉節(jié)為外植體II，用含有外源目的DNA的發(fā)根農(nóng)桿菌浸染所述外植體II，得到經(jīng)過所述發(fā)根農(nóng)桿菌浸染后的外植體II ； (2)將上述步驟(I)得到的經(jīng)過所述發(fā)根農(nóng)桿菌浸染后的外植體II用共培養(yǎng)基進(jìn)行共培養(yǎng)，得到共培養(yǎng)后的外植體II ; (3)將上述步驟(2)得到的所述共培養(yǎng)后的外植體II用根誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，即得到大豆轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于 所述步驟(2)中所述共培養(yǎng)基由以下成分組成 NH4NO3' KNO3> KH2PO4' CaCl2 · 2H20、MgSO4 · 7H20、K1、Na2MoO4 · 2H20、H3BO3> CuSO4 · 5Η20、MnSO4 · Η20、CoCl2 · 6Η20、ZnSO4 · 7Η20、Na2EDTA · 2Η20、FeSO4 · 7Η20、煙酸、肌醇、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、甘氨酸、乙酰丁香酮、赤霉素、L-半胱氨酸、二硫蘇糖醇、蔗糖、瓊脂和水； 以上成分在所述共培養(yǎng)基中濃度分別為NH4NO3O. 825g/L、KNO3O. 95g/L、KH2PO4O. 085g/L、CaCl2 · 2H20 0. 22g/L、MgSO4 · 7H20·0. 185g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3B036 . 2mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 ·Η20 16. 9mg/L、CoCl2 ·6Η20 0. 025mg/L、ZnS04 ·7Η20 8. 6mg/L,Na2EDTA ·2Η20 27. 8mg/L、FeSO4 · 7H20 37. 3mg/L、煙酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、鹽酸硫胺素 0. lmg/L、鹽酸吡哆醇·0.5mg/L、甘氨酸 2. Omg/L、乙酰丁香酮 40mg/L、赤霉素 O. 25mg/L、L-半胱氨酸 400mg/L、二硫蘇糖醇154mg/L、鹿糖30mg/L和瓊脂7g/L ； 所述共培養(yǎng)基的pH值為5.4; 所述步驟(3)中所述根誘導(dǎo)培養(yǎng)基由包括以下成分的物質(zhì)組成 NH4NO3' KNO3> KH2PO4' CaCl2 · 2H20、MgSO4 · 7H20、K1、Na2MoO4 · 2H20、H3BO3> CuSO4 · 5Η20、MnSO4 · Η20、CoCl2 · 6Η20、ZnSO4 · 7Η20、Na2EDTA · 2Η20、FeSO4 · 7Η20、煙酸、肌醇、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、甘氨酸、特美汀、頭孢噻肟、羧芐青霉素、蔗糖和水； 以上成分在所述根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中濃度分別為NH4NO3O. 825g/L、KNO3O. 95g/L、KH2PO4O. 085g/L、CaCl2 · 2H20 0. 22g/L、MgSO4 · 7H20·0. 185g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3B036 . 2mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 ·Η20 16. 9mg/L、CoCl2 ·6Η20 0. 025mg/L、ZnS04 ·7Η20 8. 6mg/L,Na2EDTA ·2Η20 27. 8mg/L、FeSO4 · 7H20 37. 3mg/L、煙酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、鹽酸硫胺素 0. lmg/L、鹽酸吡哆醇·0.5mg/L、甘氨酸2. 0mg/L、特美汀50mg/L、頭孢噻廂100mg/L、羧節(jié)青霉素100mg/L和鹿糖·30mg/L ； 所述根誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基的PH值為5. 7。
5.誘導(dǎo)大豆愈傷組織的培養(yǎng)基，由下述質(zhì)量份的營養(yǎng)成分組成 大量元素以NH4NO3計(jì)825份、微量元素以KI計(jì)O. 83份、鐵鹽以FeSO4 ·7Η20計(jì)37. 3份、有機(jī)成分以煙酸計(jì)O. 5份、生長素、6-芐氨基嘌呤O. 5份-1. O份和蔗糖30份；所述生長素為2，4- 二氯苯氧乙酸1. O份-3. O份或萘乙酸1. O份-3. O份； 所述大量元素由下述質(zhì)量份的物質(zhì)組成ΝΗ4Ν038 2 5 份、ΚΝ03950 份、ΚΗ2Ρ0485 份、CaCl2 · 2Η20 220 份和 MgSO4 · 7Η20 185 份；所述微量元素由下述質(zhì)量份的物質(zhì)組成KI O. 83 份、Na2MoO4 · 2Η20 O. 25 份、Η3Β036· 2 份、CuSO4 · 5Η20 O. 025 份、MnSO4 · H2O16. 9 份、CoCl2 · 6Η20 O. 025 份和 ZnSO4 · 7Η20 8. 6 份; 所述鐵鹽由下述質(zhì)量份的物質(zhì)組成Na2EDTA · 2Η20 27. 8 份和 FeSO4 · 7Η20 37. 3 份； 所述有機(jī)成分由下述質(zhì)量份的物質(zhì)組成 煙酸O. 5份、肌醇100份、鹽酸硫胺素O.1份、鹽酸吡哆醇O. 5份和甘氨酸2. O份。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)基,其特征在于 所述培養(yǎng)基由以下成分組成NH4NO3' KNO3> KH2PO4' CaCl2 · 2H20、MgSO4 · 7H20、K1、Na2MoO4 · 2H20、H3BO3> CuSO4 · 5Η20、MnSO4 · Η20、CoCl2 · 6Η20、ZnSO4 · 7Η20、Na2EDTA · 2Η20、FeSO4 · 7Η20、煙酸、肌醇、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、甘氨酸、生長素、6-芐氨基嘌呤、蔗糖和水；所述生長素為2，4_ 二氯苯氧乙酸或萘乙酸； 以上成分在所述培養(yǎng)基中濃度分別為NH4NO3O. 825g/L、KNO3O. 95g/L、KH2PO4O. 085g/L、CaCl2 · 2H20 0. 22g/L、MgSO4 · 7H20 0.185g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3B036 . 2mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 ·Η20 16. 9mg/L、CoCl2 ·6Η20 0. 025mg/L、ZnS04 ·7Η20 8. 6mg/L,Na2EDTA ·2Η20 27. 8mg/L、FeSO4 · 7H20 37. 3mg/L、煙酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、鹽酸硫胺素 0. lmg/L、鹽酸吡哆醇 0.5mg/L、甘氨酸2. Omg/L、生長素、6-節(jié)氨基嘌呤O. 5mg/L_l. Omg/L和鹿糖30mg/L ;所述生長素為2,4- 二氯苯氧乙酸1. Omg/L-3. Omg/L或萘乙酸1. Omg/L-3. Omg/L。
7.誘導(dǎo)大豆愈傷組織的固體培養(yǎng)基，是由凝固劑和權(quán)利要求5或6所述的培養(yǎng)基配成的固體培養(yǎng)基。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的固體培養(yǎng)基，其特征在于 所述凝固劑在所述固體培養(yǎng)基中的濃度為7g/L ； 所述凝固劑為瓊脂。
9.根據(jù)權(quán)利要求5-8中任一所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基的pH值為5. 8—7. 3.
10.用于獲得大豆愈傷組織的成套培養(yǎng)基，由權(quán)利要求5-9中任一所述的培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基獨(dú)立包裝組成；所述權(quán)利要求5-9中任一所述的培養(yǎng)基和所述繼代培養(yǎng)基均獨(dú)立包裝； 所述繼代培養(yǎng)基由以下成分組成NH4NO3' KNO3> KH2PO4' CaCl2 · 2H20、MgSO4 · 7H20、K1、Na2MoO4 · 2H20、H3BO3> CuSO4 · 5Η20、MnSO4 · H2O, CoCl2 · 6Η20、ZnSO4 · 7Η20、Na2EDTA · 2Η20、FeSO4 · 7Η20、煙酸、肌醇、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、甘氨酸、2，4_ 二氯苯氧乙酸、6-芐氨基嘌呤、N-苯基-N' -1，2，3-噻二唑-5-脲、二硫蘇糖醇、蔗糖和水； 以上成分在所述繼代培養(yǎng)基中濃度分別為NH4NO3O. 825g/L、KNO3O. 95g/L、KH2PO4O. 085g/L、CaCl2 · 2H20 0. 22g/L、MgSO4 · 7H20 0.185g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3B036. 2mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 · H2O 16. 9mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L、ZnSO4 · 7H20 8. 6mg/L、Na2EDTA · 2H20 27. 8mg/L、FeSO4 · 7H20 37. 3mg/L、煙酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、鹽酸硫胺素 0. lmg/L、鹽酸批口多醇O. 5mg/L、甘氨酸2. 0mg/L、2,4- 二氯苯氧乙酸O. 05mg/L、6_節(jié)氨基嘌呤O. 9mg/L、N-苯基-N' -1,2, 3-噻二唑-5-脲 O. 2mg/L、二硫蘇糖醇 150mg/L 和蔗糖 30mg/L ； 所述繼代培養(yǎng)基的PH值為5. 8。
全文摘要
本發(fā)明公開了獲得大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織的方法及其培養(yǎng)基。本發(fā)明所提供的獲得大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織的方法，包括以下步驟以大豆轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根為外植體I，用誘導(dǎo)大豆愈傷組織的培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)所述外植體I，即得到大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織。利用本發(fā)明所提供的獲得大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織的方法，能快速、簡單、高效的獲得大豆轉(zhuǎn)基因愈傷組織。在大豆生物技術(shù)相關(guān)領(lǐng)域尤其在根系相關(guān)基因和耐逆基因的功能驗(yàn)證中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號C12N5/04GK103031269SQ201110304260
公開日2013年4月10日 申請日期2011年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月10日
發(fā)明者韓天富, 曹東, 侯文勝, 吳存祥 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所