蘋果果肉愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基及其誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種蘋果果肉愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，包括MS+1.5mg/L2,4-D+0.4mg/L6-BA+20g/L蔗糖+6g/L瓊脂粉，且培養(yǎng)基的pH值為5.8。同時(shí)公開了其誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)方法。本發(fā)明所述的蘋果果肉愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基及其誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)方法使得果肉愈傷誘導(dǎo)率達(dá)到了100%，為蘋果的分子生物學(xué)以及基因工程研究提供了一條新的途徑，為蘋果基因工程研究和基因轉(zhuǎn)化提供一種新的試驗(yàn)材料，同時(shí)也為蘋果果實(shí)愈傷的培養(yǎng)提供了參考和借鑒。
【專利說明】蘋果果肉愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基及其誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及果肉愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基及其誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)方法，尤其是涉及一種 蘋果果肉愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基及其誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)方法，屬于植物生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 蘋果（Malus domestica Borkh)作為世界主要栽培果樹之一已有幾千年的栽培歷 史，其遺傳背景復(fù)雜、雜和度高、生命周期長、童期長、自交親和性差、雜交繁殖模式復(fù)雜等 諸多問題，給遺傳育種研究帶來了很大障礙。傳統(tǒng)遺傳育種方法的局限性使蘋果育種進(jìn)程 緩慢。隨著蘋果分子生物學(xué)研究的不斷深入和發(fā)，分子生物學(xué)手段為蘋果的遺傳研究和育 種工作提供了有利工具（姚玉新等，2004,果樹學(xué)報(bào)，21(6) :586?591)。
[0003] 目前很多國家都開展了蘋果基因組的研究，蘋果基因組研究的方向主要涉及抗 性、樹體生長習(xí)性、果實(shí)品質(zhì)和果實(shí)生產(chǎn)特性四個(gè)大方面，其中蘋果重要經(jīng)濟(jì)性狀尤其是與 果實(shí)品質(zhì)形成相關(guān)的分子機(jī)理研究也成為蘋果基因組研究的熱點(diǎn)，而在蘋果的分子機(jī)理研 究方面，愈傷組織成為常用的試驗(yàn)材料，也是基因工程研究中進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化所必需的試驗(yàn) 材料。愈傷組織是指外植體在離體培養(yǎng)條件下，形成的一團(tuán)無極性、能旺盛分裂的薄壁細(xì)胞 團(tuán)，在培養(yǎng)過程中，經(jīng)過誘導(dǎo)分化可以發(fā)育成完整的再生植株。愈傷組織是植物的外植體經(jīng) 過脫分化形成的，多種外植體都可以經(jīng)過組織培養(yǎng)誘導(dǎo)形成愈傷組織，而植物愈傷組織因 為具有以下特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于植物分子機(jī)理和基因工程研究中。愈傷組織的特點(diǎn)：①無 性繁殖，大量擴(kuò)繁；②為細(xì)胞懸浮培養(yǎng)和次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)與利用、原生質(zhì)體培養(yǎng)和細(xì)胞融 合提供材料；③為植物體細(xì)胞無性系變異、細(xì)胞突變體篩選創(chuàng)造適宜的體系和基礎(chǔ)；④為 外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化提供便于保存和利用的操對(duì)象；⑤為離體研究植物組織和細(xì)胞分裂、 分化、代謝和狀態(tài)的轉(zhuǎn)變創(chuàng)造適宜的材料和體系。（Paula Alay0n-Luaces等，2012, Plant Science (185 - 186) :169 ?175)。
[0004] 蘋果的愈傷組織培養(yǎng)研究目前已經(jīng)有很多，對(duì)于蘋果來說幾乎所有器官和組織都 可以作為外植體，經(jīng)過組織培養(yǎng)誘導(dǎo)出愈傷組織。但是就目前的研究來看，對(duì)蘋果愈傷組織 的研究多集中于研究葉片的愈傷組織，已經(jīng)有多篇關(guān)于蘋果葉片愈傷組織誘導(dǎo)的報(bào)道（崔 美等，2012,山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，44(3) :17?20;高兵，2005,南京農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文）。因 此蘋果葉片愈傷組織培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)有一整套完整的體系。然而，隨著蘋果分子生物學(xué)研究 的不斷深入，僅僅研究單一器官或者組織的的愈傷組織培養(yǎng)，顯然不能滿足研究需要，目前 蘋果的研究中，對(duì)果實(shí)品質(zhì)形成以及果實(shí)成熟發(fā)育的分子機(jī)理研究是一大熱點(diǎn)，因此，培養(yǎng) 蘋果果肉的愈傷組織是研究蘋果果實(shí)品質(zhì)形成以及果實(shí)成熟發(fā)育分子機(jī)理的一條非常重 要的途徑。
[0005] '金冠 '（MalusXdomestica Borkh. 'Golden Delicious'）又名金帥、黃香蕉、黃 元帥，適應(yīng)性廣，豐產(chǎn)性好，栽培技術(shù)相對(duì)簡單，果實(shí)品質(zhì)優(yōu)良。是國內(nèi)外廣泛栽培的蘋果品 種，也深受廣大消費(fèi)者的喜愛。目前對(duì)'金冠'果實(shí)品質(zhì)的研究也越來越多，但是目前還未 見有相關(guān)'金冠'果實(shí)果肉愈傷組織培養(yǎng)方法的相關(guān)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的發(fā)明目的在于提供一種高效快速的'金冠'蘋果 果肉愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基及其誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)方法。
[0007] 本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：
[0008] 一種蘋果果肉愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于，包括MS+1. 5mg/ L2, 4-D+O. 4mg/L6-BA+20g/L蔗糖+6g/L瓊脂粉，且培養(yǎng)基的pH值為5. 8。
[0009] 進(jìn)一步，1L誘導(dǎo)培養(yǎng)基中MS培養(yǎng)基粉劑的用量為4. 4g。
[0010] 一種蘋果果肉愈傷組織的誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟：
[0011] (1)外植體的選取及處理：將蘋果花后40-60天的果實(shí)進(jìn)行消毒處理；消毒完成后 用無菌手術(shù)刀片小心削去果皮，從果皮至果心將蘋果果肉分為外、中、內(nèi)三個(gè)部分，將三部 分的果肉切成〇. 5_的薄片后用直徑0. 5cm的打孔器將果肉打成圓片，后接種于愈傷組織 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中；
[0012] (2)外植體增殖培養(yǎng)：將接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的果肉圓片在黑暗培養(yǎng)箱 中，溫度為25°C的條件下，培養(yǎng)30-35天后，在無菌條件下切下果肉圓片周圍長出的愈傷組 織，然后接種于愈傷組織增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30-35天。
[0013] 更進(jìn)一步，步驟（1)所述的蘋果果實(shí)消毒處理的具體步驟為：將蘋果果實(shí)的表面 用流水沖洗干凈，然后在無菌條件下，用濃度為75%的乙醇消毒2min后，用無菌去離子水 沖洗3次，再用質(zhì)量濃度為10 %的次氯酸鈉溶液消毒8min，然后再用無菌去離子水沖洗4-5 次，最后用無菌濾紙吸干蘋果果實(shí)的表面水分。
[0014] 且步驟（2)所述的愈傷組織增殖培養(yǎng)基包括MS+0. 5mg/L6-BA+20g/L蔗糖+6g/L 瓊脂粉，且pH值為5.8。
[0015] 本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明所述的蘋果果肉的增殖培養(yǎng)基及其增殖培養(yǎng)方法使 得果肉愈傷誘導(dǎo)率達(dá)到了 1〇〇%，為蘋果的分子生物學(xué)以及基因工程研究提供了一條新的 途徑，為蘋果基因工程研究和基因轉(zhuǎn)化提供一種新的試驗(yàn)材料，同時(shí)也為蘋果果實(shí)愈傷的 培養(yǎng)提供了參考和借鑒。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1為本發(fā)明所述的經(jīng)過誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)后的蘋果果肉愈傷組織的示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0017] 現(xiàn)在參考附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。
[0018] 供試材料：所用植物材料是'金冠'蘋果花后20-40天、40-60天、60-80天的果實(shí)。
[0019] 果肉愈傷組織質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)分別為：
[0020] (1)愈傷組織的顆粒大小
[0021] 以培養(yǎng)45天的果肉愈傷組織為準(zhǔn)，測量不同培養(yǎng)基和不同培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)果肉 愈傷組織的大小，愈傷組織的直徑小于3_為不合格愈傷組織，愈傷組織直徑大于3_為合 格。
[0022] (2)愈傷組織的顆粒散碎度
[0023] 步驟（1)篩選完成后，篩選出大小合適的愈傷組織。顆粒散碎表示：愈傷組織容 易松散，不緊密，愈傷組織表面毛刺狀不平滑。顆粒致密表示：愈傷組織顆粒致密硬度高， 愈傷組織表面光滑狀，細(xì)胞致密，胞質(zhì)密度高，愈傷組織邊緣清晰。
[0024] (3)愈傷組織的色澤
[0025] 根據(jù)愈傷組織生長的具體情況分為四個(gè)等級(jí)
[0026] a、白色
[0027] -般顏色很白的愈傷組織表現(xiàn)為蒼白色，這種顏色的愈傷組織整體特征是組織松 軟，容易松散，而且類似于組織培養(yǎng)中植株的玻璃化的表現(xiàn)，愈傷組織往往出現(xiàn)水漬化的情 況，這種愈傷組織培養(yǎng)一段時(shí)間后細(xì)胞逐漸死亡，因此白色的愈傷組織是不合格的。
[0028] b、黃白色
[0029] 黃白色愈傷組織沒有水漬化現(xiàn)象，組織顆粒致密，硬度高，愈傷組織表層細(xì)胞層清 晰，有明顯的表層致密層結(jié)構(gòu)，是合格質(zhì)量好的愈傷組織。
[0030] c、深黃色
[0031] 深黃色愈傷組織雖然也沒有水漬化現(xiàn)象，組織顆粒致密，硬度也比較高，但是深黃 色愈傷組織培養(yǎng)一段時(shí)間以后很容易褐化，褐化以后組織容易死亡，也是不合格的愈傷組 織。
[0032] d、褐色
[0033] 這類愈傷組織從培養(yǎng)之初就開始呈現(xiàn)褐色，表現(xiàn)出明顯的褐化，褐化的愈傷組織 不具備再生的能力，一段時(shí)間后細(xì)胞也會(huì)死亡，也是不合格的愈傷組織。
[0034] (4)愈傷組織的再分化能力
[0035] 愈傷組織分化能力好壞取決于前面三個(gè)步驟，大小適中、組織顆粒致密、硬度較 高、顏色黃白色的愈傷組織具有很強(qiáng)的分化能力，分化出的愈傷組織也有很高的質(zhì)量，否則 愈傷組織分化能力弱，分化出來的愈傷組織質(zhì)量也不好。
[0036] 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方篩選：
[0037] 將蘋果'金冠'的花后果肉分別接種于附加不同濃度的2, 4-D、6_BA的MS培養(yǎng)基 上研究不同配比的植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)蘋果'金冠'果肉愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響，培養(yǎng)基中 附加鹿糖（20g/L)、瓊脂粉（6g/L)，如表1所示。
[0038] 表1不同的激素配比對(duì)'金冠'果實(shí)愈傷組織的誘導(dǎo)的影響
[0039]

【權(quán)利要求】
1. 蘋果果肉愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于，包括MS+1.5 mg/L 2,4-D+0. 4mg/L 6-BA+20g/L蔗糖+6g/L瓊脂粉，且培養(yǎng)基的pH值為5. 8。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蘋果果肉愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于，1L增殖培養(yǎng) 基中MS培養(yǎng)基粉劑的用量為4. 4g。
3. 蘋果果肉愈傷組織的誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 外植體的選取及處理：將蘋果花后40-60天的果實(shí)進(jìn)行消毒處理；消毒完成后用無 菌手術(shù)刀片小心削去果皮，從果皮至果心將蘋果果肉分為外、中、內(nèi)三個(gè)部分，將三部分的 果肉切成0. 5_的薄片后用直徑0. 5cm的打孔器將果肉打成圓片，后接種于愈傷組織誘導(dǎo) 培養(yǎng)基中； (2) 外植體增殖培養(yǎng)：將接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的果肉圓片在黑暗培養(yǎng)箱中，溫 度為25°C的條件下，培養(yǎng)30-35天后，在無菌條件下切下果肉圓片周圍長出的愈傷組織，然 后接種于愈傷組織增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30-35天。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的蘋果果肉愈傷組織的誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟 (1) 所述的蘋果果實(shí)消毒處理的具體步驟為：將蘋果果實(shí)的表面用流水沖洗干凈，然后在無 菌條件下，用濃度為75%的乙醇消毒2min后，用無菌去離子水沖洗3次，再用質(zhì)量濃度為 10%的次氯酸鈉溶液消毒8min，然后再用無菌去離子水沖洗4-5次，最后用無菌濾紙吸干蘋 果果實(shí)的表面水分。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的蘋果果肉愈傷組織的誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟 (2) 所述的愈傷組織增殖培養(yǎng)基包括1^+0.5 1^/16-84+208/1蔗糖+68/1瓊脂粉，且？!1值 為 5. 8。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK104186313SQ201410380774
【公開日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年8月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月4日
【發(fā)明者】王媛花, 顏志明, 王全智 申請(qǐng)人:江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院