專(zhuān)利名稱(chēng)：大型叢生竹愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生高效培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種適用于慈竹和綿竹等大型叢生竹的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法，具體為大 型叢生竹愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生高效培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
目前國(guó)內(nèi)外對(duì)竹子的運(yùn)用范圍較多，尤其是用于做紙漿的大型叢生竹，所以對(duì)竹 子的需求量較大，但是培養(yǎng)大型叢生竹尤其是紙漿用竹時(shí)就出現(xiàn)了問(wèn)題，以往竹的組織培 養(yǎng)研究多集中在觀(guān)賞竹的快繁上，大型叢生竹尤其是紙漿用竹的愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生 難以培養(yǎng)，目前的國(guó)內(nèi)外相關(guān)的資料上均未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明正是針對(duì)以上技術(shù)問(wèn)題，提供一種適用于大型紙漿用竹的體細(xì)胞無(wú)性系變 異、品種改良及利用基因工程技術(shù)進(jìn)行外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化的大型叢生竹愈傷組織誘導(dǎo)與 植株再生高效培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下大型叢生竹愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生高效培養(yǎng)基，包括MS培養(yǎng)基和愈傷組織誘 導(dǎo)與植株再生高效培養(yǎng)基，MS培養(yǎng)基按照以下原料制成a)大量元素(mg/L)硝酸鉀(KN03) 1900、硝酸銨(NH4N03) 1650、磷酸二氫鉀 (KH2P04) 170、硫酸鎂(MgS04. 7H20)370、氯化鈣(CaC12. 2H20) 440b)微量元素(mg/L)碘化鉀(KI)0.83、硼酸(H3B03)6. 2、硫酸錳 (MnS04. 4H20) 22. 3、硫酸鋅(ZnS04. 7 H20) 8. 6、鉬酸鈉(Na2Mo04. 2 H20) 0. 25、硫酸銅 (CuS04. 5 H20)0. 025、氯化鈷(CoC12)0. 025c)有機(jī)成分(mg/L)肌醇100、甘氨酸2、鹽酸硫胺素(VB1)0. 1、鹽酸吡哆醇 (VB6) 0. 5、煙酸(VB5 或 VPP) 0. 5d)鐵鹽(mg/L)乙二胺四乙酸二鈉(Na2.EDTA)37. 3、硫酸亞鐵 (FeS024. 7H20) 27. 8愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生高效培養(yǎng)基配方，按照以下成分組成a)主培養(yǎng)基MS 基本培養(yǎng)基+KT 2mg/L+IBA 0. 4mg/L+2，4，5_T 2mg/Lb)A培養(yǎng)基(快速分化培養(yǎng)基):MS基本培養(yǎng)基+KT 2. 5mg/L+IAA0. 5mg/Lc) B培養(yǎng)基(快速生根培養(yǎng)基):MS基本培養(yǎng)基+IAA 0. 25mg/L+IBA 0. 4mg/LMS培 養(yǎng)基要求PH 5. 6-6.0，蔗糖30%，瓊脂7g/L。大型叢生竹愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生高效培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟a)母液的配置母液1 (50 X大量元素)500ml 母液稱(chēng)取41. 25g NH4N03、47. 5g KN03、4. 25g KH2P04、9. 25g MgS04 7H20母液2(100 X) 250ml 母液稱(chēng)取:llg CaC12 2H20
母液3 (棕色瓶)250ml 母液(100X)695mg FeS04 7H20、932. 5mgNa2-EDTA分別溶解，每個(gè)試劑溶于120ml水，用電爐或微波爐加熱，再混合定容，母液4(100 X微量元素)，250ml 母液稱(chēng)取 557. 5mg MnS04 4H20、215mg ZnS04 7H20、205mgH3B04、20. 75mg KI、6. 25mg Na2Mo04 2H20、0. 625mg CuS04 5H20、0. 625mgCoC12 6H20母液5 (1000 X) 100ml 母液稱(chēng)取lOmg硫胺酸 Bl、50mg 吡哆醇 B6、50mg 煙酸、200mg
甘氨酸b)激素的配置lmg/ml 2，4，5_T 稱(chēng)取lOmg 2，4，5-T于干燥的容器內(nèi)，加入無(wú)水乙醇至完全溶 解，用蒸餾水定容至10ml ；lmg/ml NAA或IAA 稱(chēng)取lOmg NAA或IAA于干燥的容器內(nèi)，逐滴加入無(wú)水乙醇，至 完全溶解。用蒸餾水定容至10ml ；lmg/ml KT 稱(chēng)取lOmg KT于干燥的容器內(nèi)，逐滴加入1M的HC1.至完全溶解，用蒸 餾水定容至10ml ；c) NaOH、HC1 溶液的配置配置100ml 5N NaOH、4N HC1用于調(diào)節(jié)PH值20g NaOH定容至100ml的蒸餾水中， 34. 48ml HC1定容至100ml的蒸餾水中；d) MS溶液的混合配制MS培養(yǎng)基時(shí)，每1000ml培養(yǎng)基取20ml母液1、10ml母液2、10ml母液3、10ml 母液4、lml母液5。分別依次加入到800ml蒸餾水中，混勻后加入30g蔗糖定溶至1000ml， 用 5N NaOH 調(diào) PH 到 5. 6-6. 0 ；e)添加激素主培養(yǎng)基每1000ml MS 培養(yǎng)基中加入 2ml KT (lmg/ml)+0. 4ml IBA (lmg/ml)+2ml 2，4，5-T (lmg/ml)A 培養(yǎng)基每 1000ml MS 培養(yǎng)基中加入 2. 5ml KT (lmg/ml)+0. 5ml IAA (lmg/ml)B 培養(yǎng)基每 1000ml MS 培養(yǎng)基中加入 0. 4ml IBA (lmg/ml)+0. 25ml IAA (lmg/ml)瓊脂粉為0. 8%，即每1000ml MS培養(yǎng)基中8g瓊脂粉，加熱溶解后分裝至50ml三 角瓶?jī)?nèi)；f)高壓滅菌121度下滅菌15分鐘，放置1-2天后備用；g)外植體消毒將竹種子洗凈泡脹12小時(shí)，在超凈臺(tái)中用70%乙醇浸泡30s，無(wú) 菌水沖洗三次，0. 升汞浸泡30min，期間不斷震蕩，再用無(wú)菌水沖洗5_6次；h)愈傷組織誘導(dǎo)取胚接種于愈傷組織培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)7-10天后轉(zhuǎn)移至光照 下。12h. cf1光照條件下進(jìn)行，光照強(qiáng)度20001x，溫度25-26°C。愈傷組織誘導(dǎo)同時(shí)可發(fā)生芽 分化和植株再生。為加速芽分化，可將有芽點(diǎn)的愈傷轉(zhuǎn)入快速分化培養(yǎng)基(A培養(yǎng)基)。該 培養(yǎng)基也可以誘導(dǎo)無(wú)芽點(diǎn)的胚性愈傷組織分化成苗；i)生根、壯苗與移栽愈傷組織分化叢芽在B培養(yǎng)基上生根培養(yǎng)1-2周后，取出小 苗在自來(lái)水下洗凈根部的培養(yǎng)基，然后栽植到滅菌的介質(zhì)中〔土 蛭石泥炭土(質(zhì)量比) =1:1: 1〕，遮蔭散射光照射。
本發(fā)明的技術(shù)效果表現(xiàn)在無(wú)需添加谷氨酰胺、水解酪蛋白等有機(jī)成分，可在一種 培養(yǎng)基上完成愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生全過(guò)程，還可加速芽的分化和生根。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明實(shí)施例大型叢生竹愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生高效培養(yǎng)基，包括MS培養(yǎng)基和愈傷組織誘 導(dǎo)與植株再生高效培養(yǎng)基，MS培養(yǎng)基按照以下原料制成a)大量元素(mg/L)硝酸鉀(KN03) 1900、硝酸銨(NH4N03) 1650、磷酸二氫鉀 (KH2P04) 170、硫酸鎂(MgS04. 7H20)370、氯化鈣(CaC12. 2H20) 440b)微量元素(mg/L)碘化鉀(KI)0.83、硼酸(H3B03)6. 2、硫酸錳 (MnS04. 4H20) 22. 3、硫酸鋅(ZnS04. 7 H20) 8. 6、鉬酸鈉(Na2Mo04. 2 H20) 0. 25、硫酸銅 (CuS04. 5 H20)0. 025、氯化鈷(CoC12)0. 025c)有機(jī)成分(mg/L)肌醇100、甘氨酸2、鹽酸硫胺素(VB1)0. 1、鹽酸吡哆醇 (VB6) 0. 5、煙酸(VB5 或 VPP) 0. 5d)鐵鹽(mg/L)乙二胺四乙酸二鈉(Na2.EDTA)37. 3、硫酸亞鐵 (FeS024. 7H20) 27. 8愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生高效培養(yǎng)基配方，按照以下成分組成a)主培養(yǎng)基MS 基本培養(yǎng)基+KT 2mg/L+IBA 0. 4mg/L+2，4，5_T 2mg/Lb)A培養(yǎng)基(快速分化培養(yǎng)基):MS基本培養(yǎng)基+KT 2. 5mg/L+IAA0. 5mg/Lc) B培養(yǎng)基(快速生根培養(yǎng)基):MS基本培養(yǎng)基+IAA 0. 25mg/L+IBA 0. 4mg/LMS培 養(yǎng)基要求PH 5. 6-6.0，蔗糖30%，瓊脂7g/L。大型叢生竹愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生高效培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟a)母液的配置母液1 (50 X大量元素)500ml 母液稱(chēng)取41. 25g NH4N03、47. 5g KN03、4. 25g KH2P04、9. 25g MgS04 7H20母液2(100 X) 250ml 母液稱(chēng)取:llg CaC12 2H20母液3 (棕色瓶)250ml 母液(100 X) 695mg FeS04 7H20、932. 5mgNa2-EDTA分別溶解，每個(gè)試劑溶于120ml水，用電爐或微波爐加熱，再混合定容，母液 4(100X微量元素)，250ml 母液稱(chēng)取 557. 5mg MnS04 4H20、215mg ZnS04 7H20、205mgH3B04、20. 75mg KI、6. 25mg Na2Mo04 2H20、0. 625mg CuS04 5H20、0. 625mgCoC12 6H20母液5 (1000 X) 100ml 母液稱(chēng)取10mg硫胺酸 Bl、50mg 吡哆醇 B6、50mg 煙酸、200mg
甘氨酸b)激素的配置lmg/ml 2，4，5_T 稱(chēng)取10mg 2，4，5-T于干燥的容器內(nèi)，加入無(wú)水乙醇至完全溶 解，用蒸餾水定容至10ml ；lmg/ml NAA或IAA 稱(chēng)取10mg NAA或IAA于干燥的容器內(nèi)，逐滴加入無(wú)水乙醇，至 完全溶解。用蒸餾水定容至10ml ；
lmg/ml KT 稱(chēng)取10mg KT于干燥的容器內(nèi)，逐滴加入1M的HC1.至完全溶解，用蒸 餾水定容至10ml ；c) NaOH、HC1 溶液的配置配置100ml 5N NaOH、4N HC1用于調(diào)節(jié)PH值20g NaOH定容至100ml的蒸餾水中， 34. 48ml HC1定容至100ml的蒸餾水中；d) MS溶液的混合配制MS培養(yǎng)基時(shí)，每1000ml培養(yǎng)基取20ml母液1、10ml母液2、10ml母液3、10ml 母液4、lml母液5，分別依次加入到800ml蒸餾水中，混勻后加入30g蔗糖定溶至1000ml， 用 5N NaOH 調(diào) PH 到 5. 6-6. 0 ；e)添加激素主培養(yǎng)基每1000ml MS 培養(yǎng)基中加入 2ml KT (lmg/ml)+0. 4ml IBA (lmg/ml)+2ml 2，4，5-T(lmg/ml)A 培養(yǎng)基每 1000ml MS 培養(yǎng)基中加入 2. 5ml KT (lmg/ml)+0. 5mlIAA (lmg/ml)B 培養(yǎng)基每 1000ml MS 培養(yǎng)基中加入 0. 4ml IBA (lmg/ml)+0. 25ml IAA (lmg/ml)瓊脂粉為0. 8%，即每1000ml MS培養(yǎng)基中8g瓊脂粉，加熱溶解后分裝至50ml三 角瓶?jī)?nèi)；f)高壓滅菌121度下滅菌15分鐘，放置1-2天后備用；g)外植體消毒將竹種子洗凈泡脹12小時(shí)，在超凈臺(tái)中用70%乙醇浸泡30s，無(wú) 菌水沖洗三次，0. 升汞浸泡30min，期間不斷震蕩，再用無(wú)菌水沖洗5_6次；h)愈傷組織誘導(dǎo)取胚接種于愈傷組織培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)7-10天后轉(zhuǎn)移至光照 下。12h. cf1光照條件下進(jìn)行，光照強(qiáng)度20001x，溫度25-26°C。愈傷組織誘導(dǎo)同時(shí)可發(fā)生芽 分化和植株再生。為加速芽分化，可將有芽點(diǎn)的愈傷轉(zhuǎn)入快速分化培養(yǎng)基(A培養(yǎng)基)。該 培養(yǎng)基也可以誘導(dǎo)無(wú)芽點(diǎn)的胚性愈傷組織分化成苗；i)生根、壯苗與移栽愈傷組織分化叢芽在B培養(yǎng)基上生根培養(yǎng)1-2周后，取出小 苗在自來(lái)水下洗凈根部的培養(yǎng)基，然后栽植到滅菌的介質(zhì)中(土 蛭石泥炭土(質(zhì)量比) =1:1: 1)，遮蔭散射光照射。培養(yǎng)基組成以MS為基本培養(yǎng)基，添加特定的3種激素，無(wú)需添加谷氨酰胺、水解酪 蛋白等有機(jī)成分，可在一種培養(yǎng)基上完成愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生全過(guò)程，愈傷組織的誘 導(dǎo)率可達(dá)90%，從愈傷組織誘導(dǎo)至再生苗的形成僅需40-60天。提供了 A、B兩種附加培養(yǎng) 基可加速芽的分化和生根，可以適用于大型紙漿用竹的體細(xì)胞無(wú)性系變異、品種改良及利 用基因工程技術(shù)進(jìn)行外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化等。
權(quán)利要求
大型叢生竹愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生高效培養(yǎng)基，包括MS培養(yǎng)基和愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生高效培養(yǎng)基，其特征在于MS培養(yǎng)基按照以下原料制成a)大量元素(mg/L)硝酸鉀(KN03)1900、硝酸銨(NH4NO3)1650、磷酸二氫鉀(KH2PO4)170、硫酸鎂(MgSO4.7H2O)370、氯化鈣(CaCl2.2H2O)440b)微量元素(mg/L)碘化鉀(KI)0.83、硼酸(H3BO3)6.2、硫酸錳(MnSO4.4H2O)22.3、硫酸鋅(ZnSO4.7 H2O)8.6、鉬酸鈉(Na2MoO4.2 H2O)0.25、硫酸銅(CuSO4.5 H2O)0.025、氯化鈷(CoCl2)0.025c)有機(jī)成分(mg/L)肌醇100、甘氨酸2、鹽酸硫胺素(VB1)0.1、鹽酸吡哆醇(VB6)0.5、煙酸(VB5或VPP)0.5d)鐵鹽(mg/L)乙二胺四乙酸二鈉(Na2.EDTA)37.3、硫酸亞鐵(FeSO24.7H2O)27.8。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生高效培養(yǎng)基配方，其特征在于按照 以下成分組成a)主培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基+KT 2mg/L+IBA 0. 4mg/L+2，4，5_T 2mg/Lb)A培養(yǎng)基(快速分化培養(yǎng)基)MS基本培養(yǎng)基+KT2. 5mg/L+IAA0. 5mg/Lc)B培養(yǎng)基(快速生根培養(yǎng)基)MS基本培養(yǎng)基+IAA0. 25mg/L+IBA 0. 4mg/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MS培養(yǎng)基，其特征在于MS培養(yǎng)基要求PH5. 6-6.0，蔗糖 30%，瓊脂 7g/L。
4.大型叢生竹愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生高效培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于包括以下 步驟a)母液的配置母液1(50X大量元素)500ml 母液稱(chēng)取41. 25g NH4N03、47. 5g KN03、4. 25g KH2P04、9. 25g MgS04 7H20母液 2(100 X) 250ml 母液稱(chēng)取llg CaC12 2H20母液 3 (棕色瓶)250ml 母液(100 X) 695mg FeS04 7H20、932. 5mgNa2-EDTA分別溶解，每個(gè)試劑溶于120ml水，用電爐或微波爐加熱，再混合定容， 母液4(100 X微量元素)，250ml 母液稱(chēng)取 557. 5mg MnS04 4H20、215mg ZnS04 7H20、205mgH3B04、20. 75mg KI、 6. 25mg Na2Mo04 2H20、0. 625mg CuS04 5H20、0. 625mgCoC12 6H20母液5 (1000 X) 100ml母液稱(chēng)取10mg硫胺酸Bl、50mg吡哆醇B6、50mg煙酸、200mg甘氨酸b)激素的配置lmg/ml 2，4，5-T 稱(chēng)取10mg 2，4，5-T于干燥的容器內(nèi)，加入無(wú)水乙醇至完全溶解，用 蒸餾水定容至10ml ；lmg/ml NAA或IAA 稱(chēng)取10mg NAA或IAA于干燥的容器內(nèi)，逐滴加入無(wú)水乙醇，至完全 溶解。用蒸餾水定容至10ml ；lmg/ml KT:稱(chēng)取10mg KT于干燥的容器內(nèi)，逐滴加入1M的HC1.至完全溶解，用蒸餾水 定容至10ml ；c)NaOH、HCl溶液的配置配置100ml 5N NaOH、4N HC1用于調(diào)節(jié)PH值20g NaOH定容至100ml的蒸餾水中，` 34. 48ml HC1定容至100ml的蒸餾水中；d)MS溶液的混合配制MS培養(yǎng)基時(shí)，每1000ml培養(yǎng)基取20ml母液l、10ml母液2、10ml母液3、10ml母 液4、lml母液5。分別依次加入到800ml蒸餾水中，混勻后加入30g蔗糖定溶至1000ml，用 5N NaOH 調(diào) PH 到 5. 6-6. 0 ；e)添加激素主培養(yǎng)基每 1000ml MS 培養(yǎng)基中加入 2ml KT (lmg/ml)+0. 4ml IBA (lmg/ml)+2ml 2， 4，5-T(lmg/ml)A 培養(yǎng)基每 1000ml MS 培養(yǎng)基中加入 2. 5ml KT (lmg/ml)+0. 5mlIAA (lmg/ml) B 培養(yǎng)基每 1000ml MS 培養(yǎng)基中加入 0. 4ml IBA (lmg/ml)+0. 25mlIAA (lmg/ml) 瓊脂粉為0. 8%，即每1000ml MS培養(yǎng)基中8g瓊脂粉，加熱溶解后分裝至50ml三角瓶?jī)?nèi)；f)高壓滅菌121度下滅菌15分鐘，放置1-2天后備用；g)外植體消毒將竹種子洗凈泡脹12小時(shí)，在超凈臺(tái)中用70%乙醇浸泡30s，無(wú)菌水 沖洗三次，0. 升汞浸泡30min，期間不斷震蕩，再用無(wú)菌水沖洗5_6次；h)愈傷組織誘導(dǎo)取胚接種于愈傷組織培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)7-10天后轉(zhuǎn)移至光照下。 12h. cf1光照條件下進(jìn)行，光照強(qiáng)度20001x，溫度25-26°C。愈傷組織誘導(dǎo)同時(shí)可發(fā)生芽分 化和植株再生。為加速芽分化，可將有芽點(diǎn)的愈傷轉(zhuǎn)入快速分化培養(yǎng)基(A培養(yǎng)基)。該培 養(yǎng)基也可以誘導(dǎo)無(wú)芽點(diǎn)的胚性愈傷組織分化成苗；i)生根、壯苗與移栽愈傷組織分化叢芽在B培養(yǎng)基上生根培養(yǎng)1-2周后，取出小苗在 自來(lái)水下洗凈根部的培養(yǎng)基，然后栽植到滅菌的介質(zhì)中〔土 蛭石泥炭土(質(zhì)量比)= 1:1: 1〕，遮蔭散射光照射。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種適用于慈竹和綿竹等大型叢生竹的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法，具體為大型叢生竹愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生高效培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法。大型叢生竹愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生高效培養(yǎng)基，包括MS培養(yǎng)基和愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生高效培養(yǎng)基，其特征在于MS培養(yǎng)基按照以下原料制成a)大量元素硝酸鉀、硝酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈣；b)微量元素碘化鉀、硼酸、硫酸錳、硫酸鋅、鉬酸鈉、硫酸銅、氯化鈷；c)有機(jī)成分肌醇、甘氨酸、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、煙酸；d)鐵鹽乙二胺四乙酸二鈉、硫酸亞鐵。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101849504SQ200910216388
公開(kāi)日2010年10月6日 申請(qǐng)日期2009年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月27日
發(fā)明者盧學(xué)琴, 周建英, 曹穎, 段寧, 胡尚連, 陳珂 申請(qǐng)人:胡尚連