專利名稱：用于檢測漆酶吸附特性的膠體金探針及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及一種膠體金探針及其制備方法。
背景技術：
木質(zhì)素是農(nóng)作物秸桿及城市生活垃圾中一種常見的、難降解的物質(zhì)，處理不當會造成極大的資源浪費和環(huán)境污染。白腐菌是降解木質(zhì)素一類有機污染物能力最強的微生物，它在分解木質(zhì)素的過程中會產(chǎn)生氧化及分解木質(zhì)素的酶系統(tǒng)，主要包括木質(zhì)素過氧化 ^lJBl(Lignin Peroxidases)^1131^^.^61 (Manganese Perxidases)禾口(Laccase)0 它們決定著木質(zhì)素降解的途徑、速度和程度，因此木質(zhì)素降解過程中微生物的酶解作用便成為關鍵。木質(zhì)素的組成單位和空間結(jié)構(gòu)決定了其酶解過程的復雜性，而酶在木質(zhì)素表面的吸附是酶降解底物的第一步。木質(zhì)素組成成分復雜，各成分對酶的吸附特性不一，在生產(chǎn)中，酶液與底物的合理比例關系就是依據(jù)酶在底物上的吸附特性而確定的，因而酶的吸附特性對工業(yè)化生產(chǎn)也具有指導作用，可為設計和選擇生化反應器提供最優(yōu)參數(shù)。這樣通過實時監(jiān)測不同基質(zhì)條件變化下木質(zhì)素降解酶的吸附作用位點來檢測其吸附特性，對深入了解木質(zhì)素降解酶的作用機制，促進木質(zhì)素的酶解作用顯得尤為重要。而木質(zhì)素降解酶系統(tǒng)中漆酶和過氧化物酶相比具有更大的應用價值。首先，木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶是在既限碳，又限氮條件下產(chǎn)生的嚴格次級代謝產(chǎn)物，碳、氮源營養(yǎng)物的存在會限制細胞對酶的分泌；其次，由于木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物在降解有機污染物時需要大量的H2A輔助劑，這在現(xiàn)實情況下很難實現(xiàn)，限制了其在實際生產(chǎn)中的應用；第三，漆酶具有780 mV氧化還原電位，能把分子氧直接還原為水，即使沒有H2A 和其它次級代謝產(chǎn)物存在下，也可催化有機污染物的氧化。因此，漆酶的吸附特性檢測更具實際意義。目前對于漆酶的吸附特性研究普遍停留在酶的吸附熱力學、測定吸附等溫線和建立吸附熱力學模型以及測定和建立酶解動力學等基礎工作上，因此研究一種通過微觀定位酶的吸附作用位點來檢測其吸附特性的方法，成為極需解決的的問題。膠體金探針是近年來發(fā)展迅速的新型標記技術，由于膠體金顆粒易與生物大分子結(jié)合，并且具有高電子密度， 在電子顯微鏡下有致密的電子層，即可對生物大分子進行定位檢測，且制作方便，價格低廉、無放射性污染，顯示出良好的應用前景。如何將膠體金探針應用到漆酶的吸附特性檢測中，就成為本領域技術人員面臨的一個新課題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是針對現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明提供一種成本低廉、結(jié)合穩(wěn)定、漆酶活性強且能通過微觀定位漆酶的吸附作用位點來檢測漆酶吸附特性的膠體金探針；本發(fā)明還提供一種制備工藝簡單、操作方便的用于檢測漆酶吸附特性的膠體金探針的制備方法。為解決上述技術問題，本發(fā)明采用以下技術方案一種用于檢測漆酶吸附特性的膠體金探針，其特征在于，所述膠體金探針包括漆酶，所述漆酶表面結(jié)合有膠體金顆粒。膠體金作為一種新型標記物在標記探針應用方面具有獨特的優(yōu)勢，能與生物大分子之間通過非共價鍵的靜電引力形成穩(wěn)定的復合金納米粒子，同時膠體金具有高電子密度的特征，可在不破壞生命物質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的前提下提供光電檢測信號。作為本發(fā)明的膠體金探針的進一步改進
上述的膠體金探針中，所述膠體金顆粒的粒徑優(yōu)選為15 nm 20 nm, kta電位優(yōu)選為-30. 5 mV -35. 5 mV。上述的膠體金探針中，所述膠體金探針的粒徑優(yōu)選為450 nm 500 nm。作為一個總的技術構(gòu)思，本發(fā)明還提供一種上述的膠體金探針的制備方法，包括以下步驟
制備膠體金溶液并將其PH值調(diào)節(jié)為4. 5 5，向膠體金溶液中加入質(zhì)量濃度不小于 0.9 mg/mL的漆酶溶液，在攪拌條件下加入質(zhì)量濃度為5 mg/mL 10 mg/mL的PEG-20000溶液，所述膠體金溶液、漆酶溶液與PEG-20000溶液的體積比為5 (1. 1 1. 15) (0. 6 0.65)，充分反應后，用1000 r/min 1200 r/min的轉(zhuǎn)速進行第一次離心，去除聚集物，再以13000 r/min 15000 r/min的轉(zhuǎn)速進行第二次離心，吸棄上清液，將沉淀重溶于檸檬酸鈉緩沖溶液，定容，制得所述用于檢測漆酶吸附特性的膠體金探針。作為本發(fā)明的制備方法的進一步改進
上述的制備方法中，所述膠體金優(yōu)選是由檸檬酸三鈉法制得的，具體包括以下步驟 取HAuCIvK溶液于恒溫磁力攪拌器上加熱至沸騰并保持至少2 min,在攪拌條件下，快速加入檸檬酸三鈉溶液；保持溫度與轉(zhuǎn)速，至溶液顏色轉(zhuǎn)為清亮橘紅色后停止加熱并繼續(xù)攪拌，室溫冷卻后，定容，制得膠體金溶液。上述的制備方法中，所述漆酶溶液的pH值優(yōu)選為4. 5 4. 75。上述的制備方法中，所述檸檬酸鈉緩沖溶液中含有濃度為0.2 mg/mL的 PEG-20000。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于
1、本發(fā)明的用于檢測漆酶吸附特性的膠體金探針，漆酶與膠體金之間結(jié)合穩(wěn)定，能適用不同基質(zhì)條件變化，在不影響漆酶活性的前提下，通過電鏡水平的漆酶吸附作用位點的微觀定位，來檢測其吸附特性；本發(fā)明的膠體金探針拓寬了漆酶吸附、傳輸特性的檢測方法的選擇范圍，為深入了解酶的作用機制，促進木質(zhì)素的酶解作用提供了可能。2、本發(fā)明的膠體金探針的制備方法，制備工藝簡單、操作方便，制備成本低廉；優(yōu)選的配比和PH值控制使膠體金和漆酶能更好地結(jié)合，并能保持漆酶的高活性。


圖1是本發(fā)明實施例2的膠體金探針的掃描電鏡圖譜；
圖2是本發(fā)明實施例2中的膠體金與膠體金探針的可見光吸收圖譜比較示意圖； 圖3是本發(fā)明實施例2中的膠體金探針吸附于堿木質(zhì)素上的掃描電鏡圖譜。
具體實施例方式
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以下將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。實施例1
本發(fā)明的一種用于檢測漆酶吸附特性的膠體金探針，包括漆酶，漆酶表面結(jié)合有膠體金顆粒。膠體金顆粒的粒徑為15 nm 20 nm, Zeta電位為-30. 5 mV -35. 5 mV。膠體金探針的粒徑為450 nm 500 nm。本實施例的用于檢測漆酶吸附特性的膠體金探針，是通過以下步驟制備得到的 (1)制備膠體金溶液
取質(zhì)量濃度為0.01 %的HAuCl4水溶液100 mL于恒溫磁力攪拌器上加熱至沸騰并保持2 min，在1000 r/min的轉(zhuǎn)速的攪拌條件下，快速加入質(zhì)量濃度為10 g/L的檸檬酸三鈉溶液6 mL ；保持溫度與轉(zhuǎn)速，至溶液顏色轉(zhuǎn)為清亮橘紅色后停止加熱，繼續(xù)攪拌15 min，室溫冷卻后，用去離子水將溶液調(diào)節(jié)到原體積，制得膠體金溶液。(2)膠體金探針的制備
用濃度為0. 1 M的乙酸將制備的膠體金溶液的pH值調(diào)節(jié)為5. 0，逐滴加入濃度為0. 9 mg/mL的漆酶溶液并混合均勻。在攪拌條件下，向20 mL的上述混合溶液中逐滴加入10 mg/ mL的PEG-20000溶液2 mL，膠體金溶液、漆酶溶液和PEG-20000溶液的三者的體積比為5 1. 1 0. 61。攪拌標記20 min后，先按1200 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min并去除聚集物，再以 15000 r/min的轉(zhuǎn)速離心1 h，輕吸棄去上清液，將所得沉淀重溶于22 mL的濃度為0. 1 M 的檸檬酸鈉緩沖溶液中，該檸檬酸鈉緩沖溶液中含有濃度為0. 2 mg/mL的PEG-20000，完成標記過程，制得徹底去除未結(jié)合蛋白質(zhì)的膠體金探針。上述步驟中，膠體金探針的制備前，可用下述方法確定最佳的制備條件 a.確定膠體金與漆酶結(jié)合最佳pH值
用濃度為0.1 M的乙酸將膠體金溶液的pH值調(diào)節(jié)為4.0、4. 5、5.0……7. 0共7組樣品，分別取0. 5 mL上述不同pH值的膠體金溶液加入小試管中，每管分別加入濃度為ang/mL 的漆酶溶液30 μ 1，混勻后室溫靜置5 min ；再分別向各管中加入濃度為10%的NaCl溶液 0. 1 mL,混勻后室溫靜置10 min。由試驗結(jié)果可知，膠體金溶液的pH值為4. 5及5. 0的兩管制得的混合溶液保持紅色，說明膠體金與漆酶結(jié)合的最佳pH值為4. 5 5. 0。b.確定漆酶溶液的濃度
用濃度為0. 1 M的檸檬酸鈉緩沖溶液稀釋漆酶蛋白，調(diào)節(jié)其濃度梯度為0. 5,0. 6、 0. 7……2. 0 mg/mL共16組，pH值調(diào)節(jié)在4. 5 4. 75范圍內(nèi)，依次將0. ImL上述不同濃度的漆酶溶液加入到小試管中。用濃度為0.1 M乙酸調(diào)節(jié)膠體金溶液pH值為5.0，向上述各試管中加入0.5 mL膠體金，室溫下靜置15 min后，再向每個試管中加入濃度為10% NaCl 溶液0.1 mL，混勻后靜置2 h。漆酶濃度為0.9 mg/mL及以上的試管中制得的混合溶液保持紅色，說明穩(wěn)定該比例膠體金的最小漆酶蛋白量為0. 9 mg/mL。使用激光顆粒分析儀檢測上述制得的膠體金探針可知，本實施例的膠體金探針平均粒徑為472 nm，有94. 7%分布在寬度為69. 6 nm的主峰內(nèi)，粒徑分布比較集中；以ABTS2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽為底物測定所制備的膠體金探針活力為 157. 71 U/L。實施例2
本發(fā)明的一種用于檢測漆酶吸附特性的膠體金探針，包括漆酶，漆酶表面結(jié)合有膠體金顆粒。膠體金顆粒的粒徑為15 nm 20 nm, Zeta電位為-30. 5 mV -35. 5 mV。膠體金探針的粒徑為450 nm 500 nm。本實施例的用于檢測漆酶吸附特性的膠體金探針，是通過以下步驟制備得到的
(1)用實施例1的方法制備膠體金溶液；
(2)膠體金探針的制備
用濃度為0. 1 M的乙酸將制得的膠體金溶液得pH值調(diào)節(jié)為5. 0，逐滴加入濃度為0. 9 mg/mL漆酶溶液并混合均勻。在攪拌條件下，向20 mL的上述混合溶液中逐滴加入10 mg/ mL的PEG-20000溶液2 mL,膠體金溶液、漆酶溶液和PEG-20000溶液的三者的體積比為5 1. 15 0. 615。攪拌標記20 min后，先按1200 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min并去除聚集物，再以15000 r/min的轉(zhuǎn)速離心1 h，輕吸棄去上清液，將所得沉淀重溶于22 mL的濃度為0. 1 M檸檬酸鈉緩沖溶液，該檸檬酸鈉緩沖溶液中含有濃度為0. 2 mg/mL的PEG-20000，完成標記過程，制得徹底去除未結(jié)合蛋白質(zhì)的膠體金探針。使用激光顆粒分析儀檢測本實施例制得的膠體金探針，其平均粒徑為482 nm,有 89. 7%分布在寬度為127 nm的主峰內(nèi)，粒徑分布比較集中。以ABTS為底物測定所制備的膠體金探針活力為164. 17 U/L。將本實施例的膠體金探針進行電鏡掃描，掃面結(jié)果如圖1所示，由圖可知，膠體金探針呈規(guī)則的球形，其粒徑大小與激光顆粒分析儀檢測結(jié)果吻合，而且比較均勻、分散性較好。分別將上述步驟制得的膠體金溶液與膠體金探針進行可見光吸收圖譜分析，結(jié)果如圖2所示，膠體金溶液在500nm 550 nm之間有強的吸收峰，對比制備的膠體金探針，吸收曲線在520 nm處的吸光度開始降低，由此可以推測漆酶與膠體金發(fā)生了相互作用。同時膠體金探針的吸收曲線最大峰值發(fā)生了紅移及峰形展寬的現(xiàn)象，由此進一步判定漆酶與膠體金相互結(jié)合。結(jié)合膠體金探針掃描電鏡圖譜，及以ABTS為底物測定的膠體金探針活力結(jié)果，表明本發(fā)明制備的膠體金探針結(jié)合穩(wěn)定且不影響漆酶活性，能實現(xiàn)通過電鏡水平的漆酶吸附作用位點的微觀定位，來檢測其吸附特性的目的。應用實例
將上述制得的膠體金探針用于檢測堿木質(zhì)素酶解過程中漆酶的吸附特性取100 mL 的300 mg/L的堿木質(zhì)素溶液，調(diào)節(jié)制得的膠體金探針的酶活性濃度，并加入6 mL上述制得的膠體金探針及ABTS于堿木質(zhì)素溶液中，調(diào)節(jié)最終堿木質(zhì)素溶液中膠體金探針的酶活性濃度為30 U/g，并調(diào)節(jié)體系的pH值為4. 0、ABTS濃度為10 mg/L ；溫度控制在30°C 40°C 振蕩(搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min)培養(yǎng)4 6天后，于轉(zhuǎn)速為9000 r/min、溫度為4°C條件下離心10 min，取上清液并真空冷凍干燥后，用電鏡水平檢測膠體金探針的吸附位點及吸附量， 得到如圖3所示的電鏡掃描照片。圖3中，箭頭所標異于堿木質(zhì)素結(jié)構(gòu)處為檢測到的膠體金探針，由此可清晰地判斷漆酶的吸附位點及數(shù)量。因此，利用本發(fā)明的膠體金探針可用于檢測堿木質(zhì)素酶解過程中漆酶的吸附特性，簡單直觀，操作方便。以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的保護范圍并不僅局限于上述實施例， 與本發(fā)明構(gòu)思無實質(zhì)性差異的各種工藝方案均在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
權利要求
1.一種用于檢測漆酶吸附特性的膠體金探針，其特征在于，所述膠體金探針包括漆酶，所述漆酶表面結(jié)合有膠體金顆粒。
2.根據(jù)權利要求1所述的用于檢測漆酶吸附特性的膠體金探針，其特征在于，所述膠體金顆粒的粒徑為15 nm 20 nm, Zeta電位為-30. 5 mV -35. 5 mV。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的用于檢測漆酶吸附特性的膠體金探針，其特征在于，所述膠體金探針的粒徑為450 nm 500 nm。
4.一種如權利要求1 3中任一項所述的膠體金探針的制備方法，包括以下步驟制備膠體金溶液并將其PH值調(diào)節(jié)為4. 5 5，向膠體金溶液中加入質(zhì)量濃度不小于0.9 mg/mL的漆酶溶液，在攪拌條件下加入質(zhì)量濃度為5 mg/mL 10 mg/mL的PEG-20000溶液，所述膠體金溶液、漆酶溶液與PEG-20000溶液的體積比為5 (1. 1 1. 15) (0. 6 0.65)，充分反應后，用1000 r/min 1200 r/min的轉(zhuǎn)速進行第一次離心，去除聚集物，再以13000 r/min 15000 r/min的轉(zhuǎn)速進行第二次離心，吸棄上清液，將沉淀重溶于檸檬酸鈉緩沖溶液，定容，制得所述用于檢測漆酶吸附特性的膠體金探針。
5.根據(jù)權利要求4所述的膠體金探針的制備方法，其特征在于，所述膠體金是由檸檬酸三鈉法制得的，具體包括以下步驟取HAuClvK溶液于恒溫磁力攪拌器上加熱至沸騰并保持至少2 min,在攪拌條件下，快速加入檸檬酸三鈉溶液；保持溫度與轉(zhuǎn)速，至溶液顏色轉(zhuǎn)為清亮橘紅色后停止加熱并繼續(xù)攪拌，室溫冷卻后，定容，制得膠體金溶液。
6.根據(jù)權利要求4或5所述的膠體金探針的制備方法，其特征在于，所述漆酶溶液的 PH 值為 4. 5 4. 75。
7.根據(jù)權利要求4或5所述的膠體金探針的制備方法，其特征在于，所述檸檬酸鈉緩沖溶液中含有濃度為0. 2 mg/mL的PEG-20000。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于檢測漆酶吸附特性的膠體金探針及其制備方法，所述膠體金探針包括漆酶，漆酶表面結(jié)合有膠體金顆粒。所述制備方法具體包括步驟制備膠體金溶液并將其pH 值調(diào)節(jié)為4.5～5，向膠體金溶液中加入漆酶溶液，在攪拌條件下加入PEG-20000溶液，所述膠體金溶液、漆酶溶液與PEG-20000溶液的體積比為5∶(1.1～1.15)∶(0.6～0.65)，充分反應后，進行第一次離心，去除聚集物，再進行第二次離心，吸棄上清液，將沉淀重溶于檸檬酸鈉緩沖溶液，即得產(chǎn)品。本發(fā)明具有成本低廉、結(jié)合穩(wěn)定、漆酶活性強、制備工藝簡單且操作方便的優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/26GK102251020SQ20111016583
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月20日 優(yōu)先權日2011年6月20日
發(fā)明者馮沖凌, 危臻, 曾光明, 李寧杰, 許飄, 賴萃, 趙美花, 陳亮, 黃丹蓮, 黃超 申請人:湖南大學