草甘膦膠體金檢測(cè)卡的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]屬于食品安全檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及食品中有害殘留物的檢測(cè)方法，特別是草甘膦試紙檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]草甘膦是一種非選擇性、無(wú)殘留滅生性除草劑，對(duì)多年生根雜草非常有效，廣泛用于橡膠、桑、茶、果園及甘蔗地。
[0003]草甘膦屬低毒除草劑。主要抑制植物體內(nèi)的烯醇丙酮基莽草素磷酸合成酶，從而抑制莽草素向苯丙氨酸、酷氨酸及色氨酸的轉(zhuǎn)化，使蛋白質(zhì)合成受到干擾，導(dǎo)致植物死亡。
[0004]我國(guó)已制定的一些農(nóng)副產(chǎn)品中的農(nóng)藥最高殘留限量表中草甘膦在水果中的限量為 0.lmg/kg。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的在于提供快速檢測(cè)出食品中草甘膦的殘留。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是草甘膦的檢測(cè)卡及其檢測(cè)樣品的處理方法。草甘膦的檢測(cè)卡是在長(zhǎng)條扁平薄殼狀的檢測(cè)卡外殼內(nèi)設(shè)置檢測(cè)條，檢測(cè)卡外殼表面有檢測(cè)窗孔和加樣孔，其特征在于測(cè)試條是由支承背板上粘貼四種原件組成:支承背板中部粘貼硝酸纖維素膜，支承背板一端上粘貼吸水紙，另一端粘貼樣品墊，吸水紙內(nèi)端與硝酸纖維素膜搭接，樣品墊與硝酸纖維素膜之間則有一段金標(biāo)墊，由金標(biāo)墊將樣品墊與硝酸纖維素膜連接在一起。金標(biāo)墊中是含有第二種屬蛋白和草甘膦抗體的混合物，硝酸纖維素膜上橫向有2條間隔開(kāi)的顯色印記帶，一條是含草甘膦蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的檢測(cè)帶，另一條是第二種屬動(dòng)物蛋白的IgG(常用的為抗兔抗體或抗鼠抗體)；測(cè)試條置入檢測(cè)卡外殼內(nèi)，樣品墊正對(duì)加樣孔，硝酸纖維素膜正對(duì)檢測(cè)窗孔。
[0007]樣品處理方法是:稱(chēng)取試樣2±0.05 g于50 mL的離心管中，加入10 mL超純水，在1800 r/min條件下用高速組織粉碎機(jī)打碎(約I min),取粘稠液加50%三氯乙酸2 mL和二氯甲燒10 mL,在回旋式振蕩器上高速振搖30 min。然后在4°C 5000 rpm條件下離心30 min，取上清10 mL，加二氯甲烷2 mL，在回旋加速器上振蕩混合20 min，再在4°C 12000rpm條件下離心30 min,上清液即為藥物的抽提液。
[0008]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是能快速檢測(cè)出樣品中含有的草甘膦，且節(jié)省檢測(cè)成本，使用方便，檢測(cè)快速，靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確。
【附圖說(shuō)明】
[0009]圖1是草甘膦檢測(cè)卡外殼及檢測(cè)試紙條在外殼內(nèi)的安置圖。
[0010]圖2是草甘膦檢測(cè)卡檢測(cè)試紙條結(jié)構(gòu)示意圖。
[0011]圖3是檢測(cè)試紙條硝酸纖維素膜上顯示印跡帶示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0012]1.標(biāo)記膠體金的制備
膠體金溶液的制備:先將I g氯金酸(HAuCl4)粉末溶于100 mL超純水配置成1%的氯金酸溶液；再取I L超純水于特質(zhì)電爐上加熱，至沸騰后加入10 mL 1%的檸檬酸三鈉水溶液，沸騰后繼續(xù)加熱，5分鐘后加10 mL 1%的氯金酸溶液，再次加熱至沸騰，等待顏色變?yōu)榫萍t色后開(kāi)始計(jì)時(shí)，10分鐘后停止加熱，取下后自然冷卻、定容至I L，即為膠體金溶液。
[0013]抗體標(biāo)記:確定抗體所需的0.1 mol/1 K2CO3的比例，取100 mL膠體金溶液，加入此比例0.1 mol/L的K2CO3,混勻(約5 min),再將草甘膦和第二種屬動(dòng)物蛋白分別用PBS(0.01 mol/L, ρΗ7.4)溶解稀釋至2 mg/mL,加入2 mL 2 mg/mL的草甘膦抗體(或2 mL 2mg/mL第二種屬動(dòng)物蛋白),混勻(5 min),最后加入10% BSA 2 mL,混勻(5 min)。離心三次留沉淀，此三次收集的沉淀即為金標(biāo)草甘膦抗體。
[0014]膠體金標(biāo)記部分處理:將草甘膦抗體稀釋后，按一定比例將載體(如玻璃纖維、聚酯膜等)浸透，鋪均勻，取出放于37 °C恒溫烘箱烘制8-12 h，干燥后即作為膠體金標(biāo)記部分。
[0015]2.免疫層析專(zhuān)用高分子復(fù)合膜制備
首先用一種硝酸纖維素膜制成透明背襯膜，在背襯膜上覆蓋一層對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)合力強(qiáng)，浸潤(rùn)性能好的具有一定孔徑的層析膜。背襯膜的作用是阻止粘合劑中的有機(jī)溶劑對(duì)層析膜上蛋白質(zhì)的破壞。
[0016]3.層析膜的點(diǎn)樣方法
將一定濃度的甜蜜抗原(草甘膦與載體物質(zhì)形成的偶合物)精確定量；以一定間距(5mm)呈橫條狀點(diǎn)定于層析膜上，供檢測(cè)用。
[0017]草甘膦檢測(cè)卡是在檢測(cè)卡外殼I中設(shè)置檢測(cè)試紙條2，檢測(cè)卡外殼I的結(jié)構(gòu)及檢測(cè)試紙條2的設(shè)置見(jiàn)附圖1，檢測(cè)卡外殼I為長(zhǎng)條扁平薄殼狀外殼，長(zhǎng)70 _，寬20 _，厚5mm，薄殼壁厚I mm，由工程塑料制成，檢測(cè)卡外殼I由上蓋和下蓋兩半聯(lián)接而成，在檢測(cè)卡外殼I上蓋上有檢測(cè)窗孔3和加樣孔4。檢測(cè)試紙條2放置在檢測(cè)卡外殼I的下蓋內(nèi)。
[0018]檢測(cè)試紙條2是多層結(jié)構(gòu)的窄條薄片,片長(zhǎng)60 mm,片寬約4 mm,厚度小于2.5 mm。檢測(cè)試紙條2是多層結(jié)構(gòu):底層是支承背板5,為聚乙烯薄片,厚度約0.5 mm,長(zhǎng)60 mm,寬4 mm ;支承背板5中部粘貼硝酸纖維素膜6,硝酸纖維素膜厚0.5 mm,長(zhǎng)20 mm,寬4 mm。硝酸纖維素膜6上有兩條間隔開(kāi)的橫向顯示印跡帶，參見(jiàn)附圖3，兩條顯示印跡中，一條是檢測(cè)線10，含草甘膦偶聯(lián)物，另一條是參照線11，含第二種屬動(dòng)物蛋白的IgG。支承背板5 —端上粘貼吸水紙9，另一端粘貼樣品墊8，吸水紙9內(nèi)端與硝酸纖維素膜6搭接，樣品墊8與硝酸纖維素膜6之間則有一段金標(biāo)墊7，由金標(biāo)墊7將樣品墊8與硝酸纖維素膜6連接在一起，搭接寬度在1-2 mm。樣品墊8材料為吸水玻璃纖維或聚酯膜。
[0019]使用草甘膦膠體金檢測(cè)卡時(shí)，先將待檢測(cè)的樣品液(藥物的抽提液稀釋后，直接用于檢測(cè))從加樣孔4中滴入草甘膦檢測(cè)試紙條2的樣品墊8，由于虹作用原理，帶動(dòng)待檢測(cè)的樣品液及膠體金膜7所含的抗草甘膦單克隆抗體膠體金標(biāo)記物一起向硝酸纖維素膜6擴(kuò)散，5-10分鐘內(nèi)觀察結(jié)果。
[0020]檢測(cè)卡的主要反應(yīng)是免疫學(xué)的抗原和抗體反應(yīng)，在硝酸纖維素膜上遷移的膠體金標(biāo)記的抗體，在測(cè)試線上與含有草甘膦蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，以及參照線含第二種屬動(dòng)物蛋白的IgG反應(yīng)，形成棕紅色條帶。若樣品中相應(yīng)的待測(cè)草甘膦高于允許值，樣品加入后先與金標(biāo)墊中的抗體反應(yīng)，而不會(huì)與檢測(cè)帶所帶有的草甘膦蛋白質(zhì)偶聯(lián)物反應(yīng)，從而不顯色。主要有以下3種檢測(cè)結(jié)果:
1.檢測(cè)線10和參照線11同時(shí)顯現(xiàn)棕紅色印跡，表示檢測(cè)結(jié)果為陰性，說(shuō)明被測(cè)樣品中不含草甘膦或含量低于允許值；
2.檢測(cè)線10不顯色，參照線11顯現(xiàn)棕紅色印跡，表示檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，說(shuō)明被測(cè)樣品中草甘膦含量高于允許值；
3.檢測(cè)線10顯現(xiàn)棕紅色印跡，參照線11不顯色，或檢測(cè)線10和參照線11均不顯色，表示檢測(cè)試紙條失效。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.草甘膦膠體金檢測(cè)卡，其特征在于:在試紙的背襯上依次貼有樣液吸收部分、膠體金標(biāo)記部分、檢測(cè)反應(yīng)部分和吸水部分，膠體金標(biāo)記部分被標(biāo)記的物質(zhì)為第二種屬動(dòng)物蛋白和草甘膦抗體的混合物；檢測(cè)反應(yīng)部分包被有檢測(cè)用草甘膦抗原I條作為檢測(cè)線，同時(shí)還包被有抗第二種屬動(dòng)物蛋白的IgG I條作為參照線。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草甘膦膠體金檢測(cè)卡，其特征在于:草甘膦檢測(cè)用抗原為草甘膦與載體物質(zhì)形成的偶合物。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的草甘膦膠體金檢測(cè)卡，其特征在于:所述的載體物質(zhì)，為蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段、合成多肽、半合成多肽或多糖。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草甘膦膠體金檢測(cè)卡，其特征在于:所述的第二種屬動(dòng)物蛋白為非抗體來(lái)源動(dòng)物的蛋白質(zhì)。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明為草甘膦膠體金檢測(cè)卡。主要用于快速檢測(cè)食品中草甘膦的含量，該方法在試紙的背襯上依次粘貼有樣液吸收部分、膠體金標(biāo)記部分、檢測(cè)反應(yīng)部分及吸水部分。檢測(cè)反應(yīng)部分上面包被有檢測(cè)用抗原1條作為檢測(cè)線，同時(shí)還包被有抗第二種屬動(dòng)物蛋白的IgG1條作為參照線。該快速檢測(cè)試紙條特異性強(qiáng)，能夠半定量檢測(cè)，環(huán)境溫度為4-35℃都可以使用，適合于個(gè)體養(yǎng)殖戶(hù)、食品衛(wèi)生質(zhì)檢部門(mén)、海關(guān)等植物源食品進(jìn)行草甘膦殘留的快速檢測(cè)。本發(fā)明具有特異性強(qiáng)、靈敏性高、能夠?qū)崿F(xiàn)半定量檢測(cè)，且操作簡(jiǎn)單方便等有益效果。
【IPC分類(lèi)】G01N33/02
【公開(kāi)號(hào)】CN105572311
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410534185
【發(fā)明人】洪霞, 吳明慧
【申請(qǐng)人】江蘇維賽科技生物發(fā)展有限公司
【公開(kāi)日】2016年5月11日
【申請(qǐng)日】2014年10月11日