一種降鈣素原膠體金免疫比色法定量檢測試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種降鈣素原(PCT)定量檢測試劑盒及其制備方法，涉及體外診斷試劑領(lǐng)域。本發(fā)明試劑盒基于膠體金免疫比色法，包括R1、R2、PCT校準(zhǔn)品，試劑R1為含有表面活性劑的緩沖液，試劑R2為含有標(biāo)記了降鈣素原抗體的金納米顆粒的溶液。本發(fā)明還提供了該試劑盒的制備方法。本發(fā)明試劑盒具有靈敏度高，特異性強(qiáng)，反應(yīng)迅速，穩(wěn)定性好的特點，適用于多種生化分析儀，反應(yīng)后不易污染反應(yīng)杯，便于生化儀的清洗。
【專利說明】
一種降鈣素原膠體金免疫比色法定量檢測試劑盒及其制備 方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及體外診斷試劑領(lǐng)域，具體涉及一種降鈣素原膠體金免疫比色法定量檢 測人體血液中降鈣素原PCT的試劑盒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 降鈣素原（procalcitonin，PCT)是降鈣素（CT)的前體肽，是一種由116個氨基酸 組成的糖蛋白，沒有激素活性。在健康人血中PCT不能被檢測到（< 0. lng/ml)，而當(dāng)細(xì)菌 感染后2-6小時血漿PCT濃度即可明顯升高，并與炎癥的嚴(yán)重程度成正相關(guān)性，而在嚴(yán)重感 染（如細(xì)菌，寄生蟲感染）并有全身表現(xiàn)時，PCT水平即明顯升高，此時PCT>0. 5ng/ml。 然后隨著炎癥的控制與病情的緩解而逐漸降低至正常水平。PCT可選擇性地對系統(tǒng)性細(xì)菌 感染、真菌感染及寄生蟲感染有反應(yīng)，而對無菌性炎癥和病毒感染無反應(yīng)或僅有輕度反應(yīng)。 它在局部感染，病毒感染，慢性非特異性炎癥，腫瘤熱，過敏、排斥反應(yīng)，自身免疫性疾病等 情況下濃度不增加或僅輕微增加，而在全身細(xì)菌感染時PCT濃度早期即可顯著升高，侵襲 性真菌感染時PCT-定程度增高，但其增幅明顯低于細(xì)菌感染，因此PCT的檢測與傳統(tǒng)的炎 癥反應(yīng)指標(biāo)比較具有更高的特異性和敏感性。
[0003] PCT已經(jīng)成為一種用于全身細(xì)菌感染診斷及鑒別診斷的新型血清標(biāo)志物。PCT檢 測為所有不明病因的炎癥性疾病的鑒別診斷提供幫助與支持，如細(xì)菌性與毒素性的急性成 人呼吸窘迫綜合癥（ARDS)的鑒別；膽源性與毒素性胰腺炎的鑒別；細(xì)菌性與病毒性腦膜炎 的鑒別；微生物誘導(dǎo)的發(fā)熱與非細(xì)菌性發(fā)熱的鑒別，特別是發(fā)熱待查（F0U)的診斷；病毒感 染或自身免疫失調(diào)與免疫抑制條件下的急性細(xì)菌感染的鑒別，發(fā)熱病因的鑒別，腫瘤患者 中被腫瘤溶解物或化療誘導(dǎo)與細(xì)菌、真菌感染病因的區(qū)別；早期診斷新生兒和嬰兒全身性 細(xì)菌感染與敗血癥引起的急性發(fā)熱；術(shù)后常規(guī)，包括術(shù)后感染預(yù)警及術(shù)后切除感染灶（如 腹膜炎、軟組織感染）后的治療指導(dǎo)，監(jiān)測腹膜炎、吻合口漏和無典型腹部癥狀的疾病過 程；器官移植后的監(jiān)測，移植前排除急性細(xì)菌或其他感染，鑒別急性器官排斥、急性病毒、細(xì) 菌與真菌感染；ICU的長期住院患者及長期機(jī)械通氣患者的監(jiān)測；監(jiān)測高危患者，早期獲得 有關(guān)并發(fā)癥和內(nèi)環(huán)境衰退的信息等。
[0004] PCT的檢測方法有很多，既有定性方法也有半定量、定量檢測方法。這些主要方法 有：凝膠層析法、高效液相色譜分析法、免疫化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA)、放射 免疫測定（RIA)、膠體金層析法。其中凝膠層析法以及高效液相色譜分析法檢測結(jié)果精確， 但比較耗時，費用昂貴，不能在臨床推廣；免疫化學(xué)發(fā)光法靈敏度高，適合臨床PCT測定，但 需要搭配專門的儀器使用，價格昂貴；酶聯(lián)免疫吸附測定，在臨床比較常用，但操作復(fù)雜、反 應(yīng)時間較長，且線性范圍較窄；放射免疫法檢測正常人的血清PCT較為敏感，且既能檢測游 離的PCT，又能檢測結(jié)合型的PCT，也可檢測降鈣素基因相關(guān)肽前體，比酶免法、免疫化學(xué)發(fā) 光法提高了靈敏度，但所需時間較長，且標(biāo)記的放射性元素存在污染，因而限制了此方法的 臨床應(yīng)用。膠體金層析法簡便快捷，整個檢測過程不超過30min，不依賴儀器、操作簡便、快 速，適用于床旁檢驗，但一般只能作定性或半定量檢測，不能給出定量結(jié)果。
[0005] 本發(fā)明的目的是為了解決上述方法中的諸多不足，為臨床提供一種高效，快捷，重 復(fù)性好，準(zhǔn)確度高，高檢測線性，高分析靈敏度的方法，同時本發(fā)明還解決了膠體金試劑中 標(biāo)記物自身沉降和對反應(yīng)杯污染的兩大技術(shù)難題，為臨床診斷提供可靠的保證，同時降低 檢測成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供一種基于膠體金免疫比色法的降鈣素原檢測試劑盒及制備方法。該試 劑盒線性范圍寬、靈敏度高，反應(yīng)時間短，制造成本低，不對生化分析儀反應(yīng)杯造成污染。
[0007] 根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供一種基于膠體金免疫比色法的降鈣素原檢測試劑盒， 該試劑盒包括試劑R2,所述試劑R2為含有標(biāo)記了降鈣素原抗體的金納米顆粒的溶液， 所述金納米顆粒的粒徑為60nm-80nm，優(yōu)選65nm-75nm ;所述金納米顆粒和抗體質(zhì)量比在 50 : 10-80,優(yōu)選 50 : 20-60。
[0008] 所述試劑R2為PH值7. 5-10. 5,優(yōu)選8. 0-9. 0的溶液。
[0009] 所述試劑R2還含有促凝劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑和甘油，其中，促凝劑為重量體積 比10%以內(nèi)的PEG 8000,穩(wěn)定劑為重量體積比10%以內(nèi)的BSA，表面活性劑為重量體積比 為10%以下的吐溫-20,蔗糖的重量體積比為40%以下，甘油的重量體積比為20%以下。 [0010] 作為優(yōu)選，上述R2為含有粒徑為70±5nm且標(biāo)記了抗人降鈣素原抗體的金納米顆 粒、重量體積比20%蔗糖、重量體積比2% PEG8000、重量體積比1% BSA、重量體積比1%吐 溫-20和重量體積比5%甘油的，pH7. 2的磷酸鹽緩沖液，其中，金納米顆粒和抗體的重量比 為 50 : 20-60。
[0011] 更進(jìn)一步地，所述基于膠體金免疫比色法的降鈣素檢測試劑盒還包括起緩沖和加 速反應(yīng)作用的試劑R1，所述試劑R1為含有重量體積比〇. 5 % Tween-20和重量體積比0. 1 % 的NaN3的，pH7. 2的磷酸鹽緩沖液。
[0012] 上述試劑R2通過如下方法制備：
[0013] 制備金納米顆粒；
[0014] 將抗體偶聯(lián)到金納米顆粒，得偶聯(lián)抗體的納米金顆粒溶液；
[0015] 偶聯(lián)抗體的納米金顆粒溶液中加入穩(wěn)定劑；
[0016] 3000rpm 離心 1 小時；
[0017] 離心沉淀用含重量體積比20%蔗糖、重量體積比2% PEG 8000、重量體積比1% BSA、重量體積比1 %吐溫-20和重量體積比5%甘油，pH值7. 2的磷酸鹽緩沖液重懸，調(diào)整 濃度至 540nm 0D 為 0. 2-0. 3。
[0018] 1)試劑R2的制備：
[0019] 步驟一：將氯金酸與還原劑按照一定比例分別加入到煮沸的去離子水或超純水 中，制得膠體金顆粒，粒徑為60-80nm ;
[0020] 步驟二：將PCT抗體在2_8°C條件下透析，然后用緩沖液1將PCT抗體稀釋至 l-2mg/ml ；
[0021 ] 步驟三：將PCT抗體按照一定比例加入膠體金溶液中，混合均勻，制成金標(biāo)PCT抗 體；
[0022] 步驟四：3000rpm離心1小時；
[0023] 步驟五：將PH 7. 2的磷酸緩沖液、20%的蔗糖、2%的？￡68000、1%的834、1%的 吐溫_20、5%的甘油和離心后的膠體金沉淀按照一定比例重懸，調(diào)整濃度至540nm0D為 0.2-0. 3,即為試劑R2 ;
[0024] 步驟六：將PCT蛋白按照所需濃度梯度，用校準(zhǔn)品稀釋液配制成濃度在Ong/ mL-100ng/mL范圍內(nèi)的校準(zhǔn)品，用于在儀器上配合試劑R1和試劑R2形成校準(zhǔn)曲線，以達(dá)到 定量檢測的目的。
[0025] 加入穩(wěn)定劑可以穩(wěn)定抗體的結(jié)構(gòu)和活性，避免其受到溫度、滲透壓等外界條件的 影響而變性或失活，同時，穩(wěn)定劑還可以使抗體標(biāo)記的金顆粒均勻分布于溶液中，不易發(fā)生 沉降，有助于反應(yīng)更好的進(jìn)行。所述穩(wěn)定劑可以是蛋白質(zhì)和糖，所述蛋白質(zhì)優(yōu)選牛血清白蛋 白（BSA)或明膠；所述糖可以是單糖、二糖或者多糖，其中，單糖優(yōu)選甘露糖、半乳糖和/或 葡萄糖；二糖優(yōu)選乳糖和/或蔗糖；多糖優(yōu)選海藻糖、聚蔗糖、葡聚糖、甘露糖和葡萄糖中的 一種或多種。
[0026] 本發(fā)明的試劑盒中，試劑R2還可以加入促凝劑，所述促凝劑包括聚乙二醇4000、 聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇20000中的一種或幾種，以增加抗原抗體反應(yīng)速 率。
[0027] 本發(fā)明試劑盒中R2可以加入表面活性劑，所述表面活性劑包括吐溫-20、Triton X-100、NP-40中的一種或幾種，用來促進(jìn)抗原抗體更好的結(jié)合。
[0028] 本發(fā)明所提供試劑盒中R2可以是磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、甘 氨酸緩沖液、檸檬酸-磷酸鹽緩沖液、中的一種或多種緩沖液體系；優(yōu)選磷酸鹽緩沖液體 系。
[0029] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點：
[0030] 1、本發(fā)明試劑盒采用了膠體金免疫比色法，使用這種方法檢測降鈣素原，在現(xiàn)有 市場中無應(yīng)用。處于液態(tài)反應(yīng)環(huán)境的降鈣素原抗體標(biāo)記膠體金顆粒增大了與樣本中PCT抗 原的反應(yīng)面積，使得血液樣本中的降鈣素原（PCT)能夠與膠體金上標(biāo)記的PCT抗體充分并 快速的發(fā)生反應(yīng)，并在促凝劑的作用下，使膠體金產(chǎn)生聚集，在540nm下檢測產(chǎn)生吸光度的 變化，而吸光度的變化幅度與血液樣本中PCT的含量在一定范圍內(nèi)成正比，從而可以定量 檢測血液樣本中的降鈣素原（PCT)含量，其靈敏度高，最低檢測限可以達(dá)到0.2ng/ml，檢測 范圍在0-100ng/ml，能夠滿足臨床檢測需要。
[0031] 2、本發(fā)明試劑盒的R2配方中含有的穩(wěn)定劑及大分子促凝劑使得膠體金顆粒能夠 更均勻地懸浮分布在溶液中，不易發(fā)生金顆粒的沉淀，很好地解決了膠體金反應(yīng)聚集后會 污染生化儀反應(yīng)杯的問題。
[0032] 3、本發(fā)明試劑盒可以在現(xiàn)有多種生化分析儀上進(jìn)行血漿或血清等多種類樣本檢 測，適合于靈活快速的為多科室提供定量的PCT檢測結(jié)果。一般PCT檢測約需30分鐘，本 發(fā)明試劑盒從樣本采集到出具檢測結(jié)果只需約10-15分鐘，便于動態(tài)監(jiān)測患者病情，更適 合在臨床中推廣應(yīng)用。本發(fā)明與現(xiàn)有進(jìn)口 PCT檢測試劑盒對血樣檢測結(jié)果進(jìn)行對比，經(jīng)統(tǒng) 計分析相關(guān)性良好，無顯著差異，可以在臨床上推廣使用，降低檢測成本。
【附圖說明】：
[0033] 圖1為本發(fā)明降鈣素原試劑盒實施例的校準(zhǔn)曲線；
[0034] 圖2為本發(fā)明降鈣素原試劑盒實施例的線性；
[0035] 圖3為本發(fā)明降鈣素原試劑盒實施例與市售PCT電化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測結(jié)果的相 關(guān)性比較。
【具體實施方式】：
[0036] 以下，將詳細(xì)說明本發(fā)明的具體實施例，以便本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更詳細(xì)地理解 本發(fā)明。
[0037] 本發(fā)明所提供基于膠體金免疫比色法的降鈣素檢測試劑盒中，0. 5% Tween20(w/ v)作為促凝劑和0. 1% NaN3(w/v)作為防腐劑，50mM的磷酸鹽緩沖液（pH7. 2)作為緩沖溶 液，能夠為抗原抗體反應(yīng)提供合適的緩沖及反應(yīng)環(huán)境。
[0038] 以下各實施例僅制備試劑R2。
[0039] 實施例1
[0040] 本實施例試劑R2的制備分為三步，首先制備納米金顆粒（即膠體金）溶液，然后 將抗體偶聯(lián)到金納米顆粒上，最后和緩沖液、穩(wěn)定劑、促凝劑和防腐劑等混溶成完整的體 系。
[0041] 具體過程如下：
[0042] (1)市售的氯金酸和檸檬酸三鈉分別配制成1 %的水溶液，將1L的去離子水或超 純水煮沸，接著加入10mL的氯金酸溶液保持沸騰約lmin后，加入10mL的檸檬酸三鈉溶液， 隨著時間的變化溶液再次沸騰，溶液顏色隨之由明黃色轉(zhuǎn)變?yōu)樽虾谏?，接著短時間轉(zhuǎn)為酒 紅色，之后保持沸騰lOmin后，冷卻，補(bǔ)水至原體積，備用。
[0043] 將制備好的的膠體金溶液用濃度為10%的1(20)3溶液調(diào)整pH值至8. 4-8. 6,各取 lml調(diào)整PH后的膠體金溶液，分別加入1、2、4、8、10、20、40、60、80、100u 1不同體積的PCT 抗體，此時納米金顆粒和抗體的質(zhì)量比分別為50 : 1、50 : 2、50 : 4、50 : 8、50 : 16、 50 : 20、50 : 40、50 : 60、50 : 80、50 : 100,充分?jǐn)嚢鑜hr，再依次從加入PCT抗體最少 的管開始向管中加入50ul 10%的NaCl溶液，觀察PCT抗體標(biāo)記膠體金溶液的變黑色情況。 原理是膠體金本身遇到NaCl后，顏色會由紅變黑。當(dāng)管中膠體金上的抗體標(biāo)記量不足時， 加入NaCl后，由于抗體沒有把膠體金表面全部覆蓋，所以這時膠體金遇到NaCl后仍然會變 黑，當(dāng)抗體標(biāo)記量足夠大將膠體金表面完全覆蓋時，則加入NaCl后膠體金不變色。以加入 NaCl后納米金顆粒和抗體質(zhì)量比達(dá)到溶液不變黑的PCT抗體使用量為最小標(biāo)記量。本發(fā)明 PCT最適的抗體標(biāo)記量為8-80,優(yōu)選20-60。
[0044] (2)根據(jù)以上結(jié)果，將500ml膠體金溶液加入三角瓶中，邊攪拌邊用10 %的碳酸鉀 調(diào)整溶液的pH值至8. 4-8. 6 ;
[0045] 將4ml的抗體加入到上述溶液中，繼續(xù)攪拌1小時，在此過程中抗體同納米顆粒在 庫侖力和范德華力的作用下，與納米金顆粒碰撞并吸附到膠體金表面，實現(xiàn)偶聯(lián)；
[0046] (3)試劑R2的配制按如下步驟進(jìn)行：
[0047] 將上述溶液移至離心管中，用3000rpm離心lh，棄上清，保留沉淀；
[0048] 用濃度為20%蔗糖、2% PEG8000作為促凝劑、1 % BSA作為穩(wěn)定劑、1 %吐溫-20和 5%甘油的50禮的磷酸鹽緩沖液化117.2)重懸沉淀物，調(diào)整濃度至5401111100為0.2-0.3 ;
[0049] 得到R2溶液，分裝備用。
[0050] (4)降鈣素原（PCT)校準(zhǔn)品配制及定值
[0051] 用重組人PCT蛋白（市售）溶于校準(zhǔn)品稀釋液（牛血清白蛋白0.5%，疊氮鈉 0.2%，磷酸緩沖液pH 8.0)制備出不同濃度梯度的校準(zhǔn)品。用本發(fā)明試劑盒同時檢測制備 的校準(zhǔn)品和Audit MicroControls公司生產(chǎn)的降|丐素原標(biāo)準(zhǔn)品，每個濃度梯度檢測3次，取 檢測結(jié)果的平均值，以制備的本發(fā)明試劑盒的校準(zhǔn)品作為樣本，以Audit MicroControls公 司生產(chǎn)的降鈣素原標(biāo)準(zhǔn)品作為校準(zhǔn)品，制作校準(zhǔn)品曲線，計算本發(fā)明試劑盒校準(zhǔn)品的濃度， 定值結(jié)果為〇ng/mL(校準(zhǔn)品稀釋液，未添加PCT蛋白），0. 61ng/mL，2. 25ng/mL，10. 62ng/mL， 50. 43ng/mL,100. 22ng/mL。
[0052] (5)降鈣素原（PCT)試劑盒的檢測方法
[0053] 以東芝120FR全自動生化儀為例，設(shè)定檢測波長為540nm，分別取不同濃度的校準(zhǔn) 品溶液5ul，加入降鈣素原R1試劑240ul，混勻，37°C溫育5分鐘后，加入降鈣素原R2試劑 80ul，混勻，37°C孵育5分鐘后，讀取各管的吸光度值A(chǔ)l，1分鐘后，讀取各管的吸光度值A(chǔ)2， 計算吸光度值差A(yù)2-A1，每管重復(fù)測定2次，以各管2次測得的吸光度差值的平均值為縱坐 標(biāo)，對應(yīng)的校準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制"濃度-吸光度"校準(zhǔn)曲線（見圖1)。
[0054] 取待測血清或血漿樣本，用以上方法同樣測定吸光度差值，代入校準(zhǔn)品曲線，即可 計算出待測樣本中降鈣素原（PCT)的含量。
[0055] 本試劑盒不僅適用于東芝120FR全自動生化儀，還適用于其他品牌和型號的半自 動、全自動生化分析儀，具體參數(shù)可根據(jù)儀器進(jìn)行調(diào)整。
[0056] (6)試劑盒的分析性能指標(biāo)
[0057] a)線性范圍
[0058] 取一例降鈣素原（PCT)呈陽性反應(yīng)的臨床病人血清樣本約2mL，向其中加入一定 量的重組PCT蛋白純品，制得一份濃度在線性高值的樣本，用所述方法在生化分析儀上重 復(fù)測定三次，計算三次測值的平均值為99. 7ng/ml。
[0059] 用0? 05M PH7. 2的磷酸緩沖液將上述高值樣本按1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64 倍比稀釋，加上未經(jīng)稀釋的高值樣本點，組成共7個濃度點的一組溶液，用上面所述的檢測 方法在生化分析儀上檢測，每個濃度樣本重復(fù)測定三次，分別計算三次測定結(jié)果的平均值。 以稀釋濃度（x)為橫坐標(biāo)，以測定結(jié)果平均值（y)為縱坐標(biāo)計算線性回歸方程，并計算線性 回歸方程的相關(guān)系數(shù)（r)，線性回歸方程為y = 1.0098X+0. 1541，相關(guān)系數(shù)r = 0. 9999,結(jié) 果表明本發(fā)明試劑盒在0. 2ng/ml-100ng/ml線性范圍內(nèi)相關(guān)性較好，如表1、圖2。
[0060]
[0061] 表 1
[0062] b)批內(nèi)精密性
[0063] 用本發(fā)明試劑盒對兩份血清樣本各重復(fù)測定10次，分別計算兩份樣本的均值和 標(biāo)準(zhǔn)差，以均值/標(biāo)準(zhǔn)差計算兩份樣本的變異系數(shù)，表2的結(jié)果顯示批內(nèi)精密度為2. 81%和 2. 18%。
[0064]
[0065]
[0066]表 2
[0067] c)批間精密性
[0068] 以本發(fā)明實施例所述方法制備三批試劑盒，用三批試劑盒對同一份血清樣本各測 定3次，分別計算每批試劑3次測定結(jié)果的均值(Yi ：)，然后計算三批試劑盒檢測結(jié)果的總均 值(又總)和總標(biāo)準(zhǔn)差（SD總），以SD總/又總計算得到批間變異系數(shù)（CV總）。表3結(jié)果顯 示，本發(fā)明試劑盒的批間變異系數(shù)為3. 39%，
[0070] 表 3
[0071] d)最低檢測限
[0072] 以本發(fā)明試劑盒中使用的校準(zhǔn)品稀釋液作為空白樣本，按照所述的檢測方法在生 化分析儀上重復(fù)檢測20次，計算空白樣本的均值及標(biāo)準(zhǔn)差，以空白樣本檢測均值加上兩倍 標(biāo)準(zhǔn)差得到最低檢測限，結(jié)果顯示本發(fā)明的試劑盒的最低檢測限為〇. 2ng/ml。
[0073] e)穩(wěn)定性
[0074] 本發(fā)明試劑盒進(jìn)行了加速穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性考察。
[0075] 加速穩(wěn)定性：將本發(fā)明試劑盒置于37°C 15天后取出，在生化分析儀上按照檢測方 法檢測市售進(jìn)口 PCT化學(xué)發(fā)光試劑盒定值為0. 64ng/ml和41. 27ng/ml的兩份血樣，每份 血樣重復(fù)測定3次，計算檢測結(jié)果與市售進(jìn)口試劑定值結(jié)果的相對偏差分別為：2. 08%和 1. 11 %，37°C放置15天后的加速穩(wěn)定性較好，結(jié)果見表4。
[0076] 長期穩(wěn)定性：將本發(fā)明試劑盒置于2°C _8°C放置14個月，取出后按所述生化分析 儀檢測方法檢測市售PCT化學(xué)發(fā)光試劑盒定值為0. 58ng/ml和53. 07ng/ml的兩份血樣，每 份血樣重復(fù)測定3次，計算檢測結(jié)果與市售定值結(jié)果的相對偏差分別為：1. 15%和0.76%， 2°C _8°C放置14個月的長期穩(wěn)定性較好，結(jié)果見表4。
[0078] 表 4
[0079] f)本發(fā)明試劑盒與現(xiàn)有產(chǎn)品比較
[0080] 用化學(xué)發(fā)光法原理檢測降鈣素原是目前市售檢測PCT的試劑主要采用的方法，其 檢測結(jié)果得到認(rèn)可及應(yīng)用。而由于目前市場上還沒有與本試劑盒一樣使用膠體金免疫比色 法檢測PCT蛋白的市售試劑，所以我們選擇了采用化學(xué)發(fā)光原理檢測PCT的市售進(jìn)口試劑 作為對比試劑。
[0081] 收集進(jìn)口降鈣素原化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測過的新鮮血液樣本100例，其中陽性樣本 63例，陰性樣本37例。用本發(fā)明的試劑盒對樣本進(jìn)行雙孔重復(fù)測定，計算平均值，然后對所 有樣本結(jié)果進(jìn)行線性回歸分析，計算本發(fā)明試劑盒與對比試劑盒檢測結(jié)果的相關(guān)系數(shù)。
[0082] 結(jié)果顯示，兩種試劑盒檢測結(jié)果的相關(guān)系數(shù)r = 0.9986,線性回歸方程為y = 1. 0179X-0. 1216。本發(fā)明降鈣素原膠體金免疫測定試劑盒與現(xiàn)有進(jìn)口降鈣素原化學(xué)發(fā)光試 劑盒具有很好的一致性。本發(fā)明試劑盒在臨床上可以代替進(jìn)口試劑盒使用，降低了檢測成 本。
【主權(quán)項】
1. 一種降鈣素原定量檢測試劑盒，試劑盒基于膠體金免疫比色法，包括試劑RU R2,所 述試劑R2為含有標(biāo)記了降鈣素原抗體的金納米顆粒的溶液。2. 權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述金納米顆粒的粒徑為60nm-80nm。3. 權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述金納米顆粒和抗體質(zhì)量比為50 : 10-80。4. 權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述降鈣素原為多克隆抗體或單克隆抗體中 的一種或幾種；所述多克隆抗體為含有功能部位的完整抗體或抗體片段，包括兔抗人多克 隆抗體或羊抗人多克隆抗體；所述降鈣素原單克隆抗體為含有功能部位的完整抗體、抗體 片段或重組抗體。5. 權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述試劑R2為PH值7. 5-10. 5的溶液。6. 權(quán)利要求5所述試劑盒，其特征在于，所述試劑R2含有促凝劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑 和甘油，其中，所述促凝劑為聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇20000 中的一種或幾種，所述穩(wěn)定劑為蛋白質(zhì)、糖類中的一種或多種；所述蛋白質(zhì)為牛血清白蛋白 或明膠；所述糖為單糖、二糖或者多糖；所述表面活性劑為吐溫-20、Triton X-100、NP-40 中的一種或幾種；試劑R2是磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、甘氨酸緩沖液、檸 檬酸-磷酸鹽緩沖液中的一種或多種的組合。7. 權(quán)利要求6所述試劑盒，其特征在于，所述促凝劑為重量體積比10%以內(nèi)的PEG 8000， 所述穩(wěn)定劑為重量體積比10 %以內(nèi)的牛血清白蛋白，所述表面活性劑為重量體積比為 10%以下的吐溫-20,所述蔗糖的重量體積比為40%以下，所述甘油的重量體積比為20% 以下。8. 權(quán)利要求6所述試劑盒，其特征在于，所述試劑R2為含有粒徑為70. 0±5nm且標(biāo)記 了降鈣素原抗體的金納米顆粒、重量體積比20%蔗糖、重量體積比2% PEG 8000、重量體積 比1% BSA、重量體積比1%的吐溫-20和重量體積比5%甘油，pH7. 2的磷酸鹽緩沖液，其 中，金納米顆粒和抗體的重量比為50 : 10-80。9. 權(quán)利要求7所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括試劑Rl，所述試劑Rl為含 有重量體積比2%以內(nèi)的吐溫-20和重量體積比0. 1 %的NaN3的磷酸鹽緩沖液。10. 制備權(quán)利要求1-9任意一項所述試劑盒的方法，其特征在于，所述方法包括： 1) 制備金納米顆粒； 2) 將抗體偶聯(lián)到金納米顆粒，得偶聯(lián)抗體的納米金顆粒溶液； 3) 偶聯(lián)抗體的納米金顆粒溶液中加入穩(wěn)定劑； 4) 3000rpm離心1小時； 5) 離心沉淀用含重量體積比20%蔗糖、重量體積比2% PEG 8000、重量體積比1% BSA、重量體積比1 %吐溫-20和重量體積比3%甘油，pH值7. 2的磷酸鹽緩沖液重懸，調(diào)整 濃度至 540nm OD 為 0. 2-0. 3。
【文檔編號】G01N33/68GK105891497SQ201410788391
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年12月19日
【發(fā)明人】強(qiáng)中華, 張黎, 郭成志, 王志新
【申請人】北京科美生物技術(shù)有限公司