專利名稱：人胰高血糖素相關(guān)肽-1類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，公開兩種人胰高血糖素相關(guān)肽-1類似物pro-pro-h [Gly8]GLP-I (7-36) D 肽和 pro-pro-h [Gly8,Glu22]GLP-I (7-35) PPSRD 肽工程菌的構(gòu)建、多肽的制備方法和降糖活性檢測。用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的新的長度30_70aa的活性多肽的融合表達(dá)制備技術(shù)平臺，構(gòu)建在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)高效融合表達(dá)人胰高血糖素相關(guān)肽-I類似物。pro-pro-h [Gly8]GLP-I (7-36) D的基因工程菌，人胰高血糖素相關(guān)肽_1類似物的N端的丙氨酸(Ala)殘基被Gly取代，C末端接加D氨基酸殘基。pro-pro-h [Gly8, Glu22]GLP-I (7-35) PPSRD的基因工程菌，人胰高血糖素相關(guān)肽-I類似物的N端的丙氨酸(Ala)殘基被Gly取代，22位Gly被Glu取代，同時(shí)N端接加2個(gè)脯氨酸殘基，C末端接加PPSRD氨 基酸殘基。在pro-pro-h [Gly8] GLP-I (7~36)D 肽和 pro-pro-h [Gly8 , Glu22]GLP-I (7-35) PPSRD肽的N端設(shè)計(jì)一個(gè)酸敏感位點(diǎn)(Asp-Pro)，用酸切割融合蛋白His-AnsB-C-pro-pro-h[Gly8]GLP-I (7-36)D 和 His-AnsB-C-pro-pro-h[Gly8, Glu22]GLP-I (7-35) PPSRD,獲得目的肽 pro-pro-h [Gly8]GLP-I (7-36) D 肽和 pro-pro-h [Gly8,Glu22]GLP-I(7-35)PPSRD 肽。pro-pro-h[Gly8]GLP_l(7-36)D 和 pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-I (7-35)PPSRD肽在體內(nèi)被DPPIV及PPCE酶切割生成高活性的h[Gly8]GLP_l (7-36)D和h[Gly8，Glu22]GLP-I (7-35)PPSRD。重組菌經(jīng)裂解一洗滌一再溶解一Ni瓊脂糖凝膠層析分離一分離出融合蛋白一50mM HCl水解融合蛋白一Ni瓊脂糖凝膠層析分離，測得 pro-pro-h[Gly8]GLP-l(7-36)D 相對分子質(zhì)量為 3593. 95Da, pro-pro-h[Gly8, Glu22]GLP-I (7-35) PPSRD 肽相對分子質(zhì)量為 3947. 33Da。pro-pro-h [Gly8] GLP-I (7-36) D 肽和 pro-pro-h [Gly8，Glu22] GLP-I (7-35) PPSRD肽無需復(fù)性，凍干后溶于PBS中，對正常小鼠進(jìn)行口服耐血糖實(shí)驗(yàn)，并測定小鼠胰島素分泌情況。
背景技術(shù)：
人胰高血糖素相關(guān)肽-I (或人胰高血糖素樣肽-I，human Glucagon-likepeptide-1, hGLP-1)GLP-I作為一種腸肽激素，其生理功能主要包括這樣幾個(gè)方面(I)GLP-I能血糖依賴性的刺激胰島素分泌，故不會(huì)出現(xiàn)低血糖現(xiàn)象；(2)GLP-I能刺激P細(xì)胞的胰島素合成與增殖；(3)GLP-1能抑制胰高血糖素的分泌；(4)對腸道具有調(diào)節(jié)作用；(5)可作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，抑制食欲，產(chǎn)生飽腹感；(6)減少甘油三酯的吸收等。GLP-I的這些生理功能決定了它能對糖尿病起到綜合治療的作用血糖依賴性促胰島素分泌等多種生理功能，因此，在2型糖尿病的臨床治療中具有較好的應(yīng)用前景。盡管天然GLP-I在治療糖尿病上有諸多優(yōu)點(diǎn)，但有用體內(nèi)的DPP-IV的快速降解和腎臟代謝作用，導(dǎo)致GLP-I的半衰期很短，使其臨床應(yīng)用受到了很大的限制。針對GLP-I的這一弱點(diǎn)，人們主要從兩個(gè)方面來探索以GLP-I為基礎(chǔ)的治療糖尿病的藥物，一方面是DPP-IV抑制劑的研究，另一方面是GLP-I類似物的研究，通過對GLP-I的結(jié)構(gòu)改造開發(fā)更穩(wěn)定的GLP-I類似物，延長其體內(nèi)有效時(shí)間成為近年來一個(gè)熱門課題。目前，對于GLP-I類似物的研究雖然取得了一定的進(jìn)展，但圍繞天然GLP-I分子進(jìn)行改造來設(shè)計(jì)長效GLP-I類似物仍是該研究領(lǐng)域的焦點(diǎn)。國外有文獻(xiàn)報(bào)道改變GLP-I的氨基酸組成，能改變GLP-I的降糖活性，如用Gly來取代得到的(GlyS)GLP-I對受體的親和力增強(qiáng)，同時(shí)還可以抵抗二肽酶降解。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)只能夠發(fā)現(xiàn)該突變肽的促胰島素活性比天然肽好，而且半衰期可達(dá)幾小時(shí)。GLP-I中Gly22為柔性結(jié)構(gòu)，而Exendin-4相應(yīng)的氨基酸為Glu，具有增加a螺旋程度作用，提高與GLP-I受體的親和能力，所以將Gly22替換為Glu可使GLP-I更加穩(wěn)定；同時(shí)Exendin-4的C端部分序列是促胰島素活性所必需，將Ex4(35-39)接加到GLP-IC端可增加促胰島分泌活性。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的二肽酶IV(Dipeptidyl peptidase IV, DPPIV)能從肽類氨基酸末端水解釋放二肽。其水解專一底物為NH2-X-Pi~o-(肽或蛋白鏈N端第2個(gè)氨基酸殘基為 Pro) ；PPCE 為水解-Pro-X-的內(nèi)肽酶，pro-pro-h [Gly8, Glu22] GLP-I (7-35) PPSRD 肽和 pro-pro-h [Gly8]GLP-I (7-36) D 肽應(yīng)歸為 DPPIV 和 PPCE 酶的推測底物，pro-pro-h [Gly8,Glu22]GLP-I (7-35) PPSRD 肽和 pro-pro-h [Gly8]GLP-I (7-36) D 肽可能在體內(nèi)被 DPPIV 和PPCE 酶切生成高活性的 h[Gly8，Glu22]GLP_l (7-35)PPSRD 肽和 h[Gly8]GLP_l (7-36)D 肽而發(fā)揮作用。目前國內(nèi)外獲取GLP-I類似物的方法主要有化學(xué)合成法和基因工程法。然而化學(xué)合成法步驟較多、得率較低、成本很高；基因工程法生產(chǎn)同樣存在很多困難，如長度在20 80氨基酸之間的肽類mRNA和表達(dá)的蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定，導(dǎo)致表達(dá)效率很低；用融合方式能獲得高效表達(dá)。由于化學(xué)合成法成本較高，價(jià)格昂貴，我們嘗試以基因工程的方法來制備GLP-I類似物，以提高產(chǎn)量，降低成本。本專利通過構(gòu)建GLP-I類似物的高效表達(dá)載體，分離純化出目的肽。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供人胰高血糖素相關(guān)肽-I類似物lpro-pro-h [Gly8]GLP-I (7-36) D肽和人胰高血糖素相關(guān)肽-I類似物2pr0-pr0-h[Gly8，Glu22]GLP-I (7-35) PPSRD肽和及它們的制備方法，該方法可制備人胰高血糖素相關(guān)肽_1類似物pro-pro-h [Gly8] GLP-I (7-36) D 肽和 pro-pro-h [Gly8，Glu22] GLP-I (7-35) PPSRD 肽。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供相應(yīng)的編碼序列，載體與宿主細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)目的是pro-pro-h[Gly8]GLP-I (7-36)D 肽和 pro-pro-h[Gly8,Glu22] GLP-I (7-35) PPSRD肽有顯著的降血糖生物學(xué)活性。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明第一方面，提供了兩種人胰高血糖素相關(guān)肽-I類似物，人胰高血糖素相關(guān)肽-I類似物lpro-pix)-h[Gly8]GLP-I (7_36) D肽包括有在人胰高血糖素相關(guān)肽-I類似物前的DPPIV及PPEC酶切位點(diǎn)，以及在N端Ala被Gly取代，同時(shí)N端接加2個(gè)脯氨酸殘基，C端接加D殘基。人胰高血糖素相關(guān)肽-I類似物2pr0-pr0-h[Gly8，Glu22]GLP-I (7-35)PPSRD肽，它包括有在人胰高血糖素相關(guān)肽-I類似物前的DPPIV及PPEC酶切位點(diǎn)，以及在N端Ala被Gly取代，Gly22被Glu取代，同時(shí)N端接加2個(gè)脯氨酸殘基，C端接加PPSRD殘基。本發(fā)明第二方面，提供了一種人胰高血糖素樣肽-I類似物的制備方法，其特征在于，該方法包含步驟(a)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求6所述的質(zhì)粒載體及其轉(zhuǎn)化菌。(b)從培養(yǎng)物中分離出權(quán)利要求2所示氨基酸序列的人胰高血糖素相關(guān)肽-I類似物I的融合蛋白His-AnsB-C-pro-pro-h [Gly8]GLP-I (7_36) D和人胰高血糖素相關(guān)肽-I類似物 2 的融合蛋白 His-AnsB-C-pro-pro-h [Gly8，Glu22]GLP-I (7-35) PPSRD。(c)純化出 pro-pro-h[Gly8]GLP-I(7-36)D 和 pro-pro-h[Gly8, Glu22]GLP-I(7-35)PPSRD
(d)利用體內(nèi) DPPIV 酶切 pro-pro-h [Gly8] GLP-I (7-36) D 和 pro-pro-h [Gly8,Glu22]GLP-I (7-35) PPSRD 肽形成 h[Gly8]GLP-I (7-36) D 和 h[Gly8, Glu22]GLP-I (7-35)PPSRD 肽。在一優(yōu)選例中，在本發(fā)明的方法中，所述的步驟(b)包括通過溶解，洗漆，親和層析等方法分離出 His-Ans-B-C-pro-pro-h[Gly8]GLP_l (7_36)D 和His-Ans-B-C-pro-pro-h [Gly8，Glu22] GLP-I (7-35) PPSRD ;用酸水解方法從所述融合蛋白中切下融合伙伴，形成 pro-pro_h[Gly8] GLP-1 (7-36) D 和 pro-pro-h [Gly8, Glu22]GLP-I (7-35) PPSRD 肽；在另一優(yōu)選例中，所述的步驟(C)包括通過等電點(diǎn)沉淀分離出pro-pro-h[Gly8]GLP-I (7-36) D 和 pro-pro-h [Gly8，Glu22] GLP-I (7-35) PPSRD 肽。在另一優(yōu)選例中，所述的步驟(C)還包括Ni瓊脂糖凝膠層析分離，透析和凍干。本發(fā)明第三方面，pro-pro-h[Gly8]GLP-l(7_36)D 和 pro-pro-h[Gly8, Glu22]GLP-I (7-35)PPSRD肽對正常小鼠皮下給藥，口服耐血糖實(shí)驗(yàn)，并測定胰島素濃度變化。


圖I重組質(zhì)粒構(gòu)建原理示意2重疊PCR獲得目的基因產(chǎn)物凝膠電泳檢測結(jié)果圖 2A Lanel =Marker ；Lane2 pro-pro-h [Gly8, Glu22]GLP_l (7-35) PPSRD圖 2B Lane I Marker ；Lane2 pro-pro-h [Gly8] GLP-I (7-36) D圖3基因序列測序結(jié)果圖3A pro-pro-h [Gly8]GLP-I (7-36) D 基因序列測序結(jié)果圖3B pro-pro-h [Gly8, Glu22]GLP_l (7-35) PPSRD 的基因序列測序結(jié)果圖4融合蛋白示意5重組菌乳糖誘導(dǎo)表達(dá)情況圖 5A Lane I Marker ;Lane2、Lane 3 pro-pro-h [Gly8] GLP-I (7-36) D 融合蛋白表達(dá)情況
圖 5B =Lanel :未加乳糖誘導(dǎo)；Lane2、Lane3 pro-pro-h[Gly8, Glu22]GLP-I (7-35)PPSRD融合蛋白表達(dá)情況
圖6Ni瓊脂糖凝膠層析純化得人胰高血糖素樣肽-I類似物融合蛋白示意圖 圖6A :pro-pro-h[Gly8] GLP-I (7-36) D融合蛋白的親和層析柱純化Lanel :蛋白 Marker ；Lane2 :包涵體溶解上清；Lane3 binding buffer 洗脫液；Lane4 washing buffer 洗脫液；Lane5 eluting buffer 洗脫液
圖 6B pro-pro-h[Gly8, Glu22] GLP-I (7-35) PPSRD 融合蛋白的親和層析Lanel :包涵體溶解上清；Lane2 :樣品上柱流出液；Lane3 Binding Buffer洗脫液；Lane4 ffashing Buffer 洗脫液；Lane5 Eluting Buffer 洗脫液.
圖7人胰高血糖素樣肽-I類似物的酸水解純化單體的電泳圖
圖 7A =Lanel pro-pro-h[Gly8]GLP-I (7-36)D 融合蛋白酸水解；Lane2 :酸水解產(chǎn)物等電點(diǎn)沉淀；Lane3 pro-pro-h [Gly8]GLP-I (7-36) D多肽親和層析純化；Lane4 :胰島素對照品(分子量5734Da)
圖 7B =Lanel :胰島素對照品；Lane2 pro-pro-h[Gly8, Glu22]GLP-I (7-35)PPSRD 融合 蛋白酸水解；Lane3 :酸水解產(chǎn)物等電點(diǎn)沉淀
圖 7C =Lanel :胰島素對照品；Lane2 pro-pro-h[Gly8, Glu22]GLP-I (7-35)PPSRD 多肽親和層析純化
圖8人胰高血糖素樣肽-I類似物的質(zhì)譜圖
圖 8A pro-pro-h [Gly8] GLP-I (7-36) D 質(zhì)譜圖
圖 8B pro-pro-h [Gly8, Glu22] GLP-I (7-35) PPSRD 質(zhì)譜圖
圖9不同劑量降血糖作用效果圖
圖 9A pro-pro-h [Gly8] GLP-I (7-36)降血糖圖
圖 9B pro-pro-h [Gly8, Glu22] GLP-I (7-35) PPSRD 降血糖圖
圖10不同劑量促胰島素分泌效果圖
圖 IOA pro-pro-h[Gly8]GLP-I (7-36)胰島素分泌圖 * :P < 0. 05 ;** P < 0. 001圖 IOB pro-pro-h[Gly8, Glu22]GLP-I (7-35)PPSRD 胰島素分泌圖 * :P < 0. 05 ;** P< 0. 00具體實(shí)施例方式以下通過附圖及實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。本說明書中所提到的材料中(I)宿主菌與質(zhì)粒宿主菌Escherichia coli BL21是基因工程常用工具菌種，在與基因工程研究相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室一般都有保存。質(zhì)粒PED為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。(2)酶和試劑分子克隆工具酶為Fermentas和Takara兩家公司；質(zhì)粒抽提試劑盒為南京天為生物科有限公司；PCR膠回收試劑盒為Takara公司的產(chǎn)品。(3)培養(yǎng)基LB 培養(yǎng)基，配方見參考文獻(xiàn) Sambrook J, FristshE F, Maniatis T. MolecularCloning ；A Laboratory Manual 2nd ed. NY Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989o玉米漿培養(yǎng)基含有玉米漿25g/L，牛肉浸膏15g/L，味精10g/L。(4) Ni瓊脂糖凝膠親和層析介質(zhì)為美國GE公司產(chǎn)品。本說明書所提及的方法中質(zhì)粒提取、PCR反應(yīng)、內(nèi)切酶酶切、DNA片段的回收、連接和轉(zhuǎn)化大腸桿菌，這些都是基因工程研究領(lǐng)域的常規(guī)操作方法，具體參見Samtoook J，F(xiàn)ristshE F, Maniatis T. Molecular Cloning ；A Laboratory Manual 2nd ed. NY ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989, pp.16—340。重組蛋白表達(dá)量測定參見Sambrook J, Fristsh EF, Maniatis T. MolecularCloning ；A Laboratory Manual 2nd ed. NY Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989.實(shí)施例lpro-pro-h[Gly8]GLP-1 (7-36)D 多妝和 pro-pro-h[Gly8, Glu22]GLP-I (7-35)PPSRD多肽基因的設(shè)計(jì)、合成和克隆按照大腸桿菌的偏愛密碼子及設(shè)計(jì)要求將N端位置8的丙氨酸(SAla)殘基被Gly取代，同時(shí)N端接加2個(gè)脯氨酸(Pro)殘基，C端加上D的人胰高血糖素相關(guān)肽-I的33個(gè)氨基酸序列轉(zhuǎn)化成 核苷酸序列，其序列框架見SEQ ID N0:1。在其5 ‘端增設(shè)BamH I酶切位點(diǎn)，3 ‘端增設(shè)終止密碼子TAA和HindIII酶切位點(diǎn)，在計(jì)算機(jī)輔助分析后，確定基因全長108bp，分別為56、51、47堿基的三個(gè)寡核苷酸片段，同時(shí)，為用PCR方法初篩陽性克隆，設(shè)計(jì)了下游引物M4。合成四條序列如下Ml :5’ -ATATGGATCCGCCGCACGGTGAAGGCACCTTTACCTCTGACGTG TCTTCT TACCTG-3’，含BamH I酶切位點(diǎn)M2 :5’ -GACGTGTCTTCTTACCTGGAAGGCCAGGCTGCTAAAGAATTTATTGCTTGG-3’M3 :5，-GGCCAAGCTTAATCACGACCTTTCACCAGCCAAGCAATAAATTCTTT-3，，含 HindIII 酶切位點(diǎn)M4 :5’ -GGCCAAGCTTAATCACGACCTTTCACCAG-3’由上海金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)在伯日PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。其中M1、M2、M3 按 10 I 10 濃度比例混合，于 94°C，30s ;54°C，60s ;72°C，90s ;共 30 個(gè)循環(huán)。I. 8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，將目的片段用凝膠回收試劑盒回收后保存于_20°C。經(jīng)凝膠回收的PCR目的片段和載體質(zhì)粒pED分別經(jīng)BamH I和HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，用T4DNA連接酶反應(yīng)體系中16度連接過夜，轉(zhuǎn)化E. coli BL21感受態(tài)細(xì)胞。將細(xì)胞涂布到含100 u g/ml卡那霉素的LB平板上37°C培養(yǎng)過夜。挑取單菌落，抽提純化。各取與pro-pix)-h[Gly8]GLP-1 (7_36)D的基因上、下游核苷酸序列分別互補(bǔ)的兩條特異引物M1、M4，各100pmol/L，以純化的重組質(zhì)粒分別做模板在10 U I體系中進(jìn)行PCR，初篩陽性克隆，再將陽性克隆送至上海金斯瑞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。按照大腸桿菌的偏愛密碼子及設(shè)計(jì)要求將N端位置8的丙氨酸(SAla)殘基被Gly取代，22位Gly殘基的位置取代為Glu，同時(shí)N端接加2個(gè)脯氨酸(Pro)殘基，C端加上PPSRD的人胰高血糖素相關(guān)肽-I的36個(gè)氨基酸序列轉(zhuǎn)化成核苷酸序列，其序列框架見SEQ ID N0:2。在其5 ‘端增設(shè)BamH I酶切位點(diǎn)，3 ‘端增設(shè)終止密碼子TAA和HindIII酶切位點(diǎn)，在計(jì)算機(jī)輔助分析后，確定基因全長124bp，分別為53、54、53堿基的三個(gè)寡核苷酸片段，同時(shí)，為用PCR方法初篩陽性克隆，設(shè)計(jì)了下游引物N4。合成四條序列如下NI :5，-ATATGGATCCGCCGCACGGT TTTGGCACCTTTACCTCTGACGTGTCTTCTTACCTG-3，，含BamH I酶切位點(diǎn)N2 :5’ -GACGTGTCTTCTTACCTGGAAGAACAGGCTGCTAAAGAATTTCTGGCTTGG-3’N3:5， -GGCCAAGCTTAATCACGAGACGGCGGACCTTTCACCAGCCAAGCCAGAAATTCTTT-3，，含HindIII酶切位點(diǎn)
N4 :5’ -GGCCAAGCTTAATCACGAGACGGCGGACC-3’，含 HindIII 酶切位點(diǎn)由上海金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)在伯日PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。其中N1、N2、N3 按 10 I 10 濃度比例混合，于 94°C，30s ;54°C，60s ;72°C，90s ;共 30 個(gè)循環(huán)。I. 8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，將目的片段用凝膠回收試劑盒回收后保存于_20°C。經(jīng)凝膠回收的PCR目的片段和載體質(zhì)粒pED分別經(jīng)BamH I和HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，用T4DNA連接酶反應(yīng)體系中16度連接過夜，轉(zhuǎn)化E. coliBL21感受態(tài)細(xì)胞。將細(xì)胞涂布到含100 u g/ml卡那霉素的LB平板上37°C培養(yǎng)過夜。挑取單菌落，抽提純化。各取與pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1 (7-35)PPSRD的基因上、下游核苷酸序列分別互補(bǔ)的兩條特異引物NI、N4，各lOOpmol/L，以純化的重組質(zhì)粒分別做模板在IOul體系中進(jìn)行PCR，初篩陽性克隆，再將陽性克隆送至上海金斯瑞生物技術(shù)有限公司進(jìn) 行測序。實(shí)施例2pro-pro-h[Gly8]GLP-1 (7-36)D 多妝和 pro-pro-h[Gly8, Glu22]GLP-1 (7-35) PPSRD多肽基因在大腸桿菌中的表達(dá)重組表達(dá)菌在液體LB培養(yǎng)基中37度震蕩過夜，以3%接種量轉(zhuǎn)接于玉米漿發(fā)酵培養(yǎng)基中，37度培養(yǎng)4h，加終濃度5mmol/L乳糖誘導(dǎo)表達(dá)，6_8h后收集發(fā)酵菌體。留樣進(jìn)行15% SDS-PAGE分析。在分子量約17700Da處出現(xiàn)明顯的蛋白條帶。融合蛋白在誘導(dǎo)后6h達(dá)到穩(wěn)定的最大表達(dá)量，BandScan分析顯不融合蛋白占細(xì)菌總蛋白的40%以上,并在胞內(nèi)形成了包涵體。實(shí)施例3融合蛋白插入His標(biāo)簽按照大腸桿菌的偏愛密碼子及設(shè)計(jì)要求在融合蛋白上游插入6個(gè)組氨酸，形成組氨酸標(biāo)簽，通過PCR的方法將His-tag插入，設(shè)計(jì)上下游引物Nco I His Up :5，-TATACCATGGATCATCATCATCATCATCATACGCCATTCG-3，，含Nco I 酶切位點(diǎn)HindIII down I :5’ -GGCCAAGCTTAATCACGACCTTTCACCAG-3，，含 HindIII 酶切位點(diǎn)以質(zhì)粒pED-PP-h[Gly8]GLP-l(7_36)D 為模板，Nco I His Up 和 HindIIIdown I為上下游引物，PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件同實(shí)施例I。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行Nco I和BamH I 雙酶切，質(zhì)粒 pED-PP-h[Gly8]GLP-I (7-36)D 進(jìn)行 Nco I 和 HindIII 雙酶切去除AnsB-C-PP-h [Gly8] GLP-1 (7-36) D基因片段，將兩者的酶切產(chǎn)物連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-Hi s-AnsB-C-pro-pro-h[Gly8]GLP-1 (7-36)D0按照大腸桿菌的偏愛密碼子及設(shè)計(jì)要求在融合蛋白上游插入6個(gè)組氨酸，形成組氨酸標(biāo)簽，通過PCR的方法將His-tag插入，設(shè)計(jì)上下游引物Nco I His Up :5，-TATACCATGGATCATCATCATCATCATCATACGCCATTCG-3，，含Nco I 酶切位點(diǎn)Hindi 11 down2 :5 ’ -GGCCAAGCTTAATCACGAGACGGCGGACC-3 ’，含 Hindi 11 酶切位點(diǎn)以質(zhì)粒 pED-PP-h[Gly8，Glu22]GLP-I (7-35)PPSRD 為模板，Nco I HisUp 和 HindIII down2為上下游引物，PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件同實(shí)施例I。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行Nco I和BamH I雙酶切，質(zhì)粒 pED-PP-h[Gly8, Glu22]GLP_l (7-35)PPSRD 進(jìn)行 Nco I 和 HindIII 雙酶切去除AnsB-C-PP-h [Gly8, Glu22]GLP-1 (7-35) PPSRD基因片段，將兩者的酶切產(chǎn)物連接構(gòu)建重組質(zhì)粒 pET-Hi s-AnsB-C-pro-pro-h [Gly8，Glu22] GLP-1 (7-35) PPSRD。
實(shí)施例4融合蛋白分離純化誘導(dǎo)表達(dá)后的工程菌經(jīng)離心回收菌體，將菌體用50mmol/L Tris-Hcl緩沖液洗滌兩次，向收集的菌體中加入配制好的菌體裂解液(4ml/g菌體)，放置于37°C搖床恒溫劇烈振蕩過夜，以充分裂解菌體。裂解至溶液不粘滯時(shí)，離心收集沉淀。每克裂解后的菌體沉淀加入IOml包涵體洗漆液I (0. 2 % TritonX-100, 50mmol/L Tris HCl),將包涵體懸浮于洗滌液中劇烈振蕩2小時(shí)后，離心收集沉淀。將沉淀加入適量蒸餾水中重懸洗滌，洗滌后離心收集沉淀。再用包涵體洗滌液2(2mol/L Urea，10% TritonX-100)洗滌沉淀2次，收集洗滌后的包涵體。每克包涵體加入8ml包涵體溶解液(8mol/LUrea，50mmol/L Tris HCl),混勻，室溫下連續(xù)振蕩至包涵體溶解，12000r/min離心20分鐘，收集上清液。3 倍體積 Binding Buffer (5mmol/L Imidazole, 500mm ol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl, pH 7.9)平衡 Ni 瓊脂糖凝膠親和層析柱，將 His-AnsB-C-pro-pro-h[Gly8]GLP-1 (7-36)D的粗品溶液上清上樣過柱，用10倍體積Binding Buffer洗脫雜蛋白，以10倍柱體積的 Wash Buffer (40mmol/L imidazole, 500mmol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl, pH 7. 9)洗脫雜蛋白，最后以 Elute Buffer (lOOmmol/L imidazole, 500mmol/L NaCl,20mmol/LTris-HCl, pH7. 9)收集目的蛋白，得 pro-pro_h[Gly8]GLP-1 (7-36)D 的融合蛋白 His-AnsB-C-pro-pro-h[Gly8]GLP-I (7-36)D。pro-pro-h[Gly8, Glu22]GLP_l (7-35)PPSRD 的融合蛋白 His-AnsB-C-pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1 (7-35)PPSRD 的獲取方法與pro-pro-h [Gly8] GLP-1 (7-36) D 的融合蛋白相同。實(shí)施例5融合蛋白的酸切割將含有人胰高血糖素樣肽-I類似物I的融合蛋白His-AnsB-C-pro-pro-h [Gly8]GLP-1 (7-36) D的Elute Buffer透析，凍干，每克凍干產(chǎn)物加入10ml 50mmol/L HCl溶解，置于48°C水浴48h，進(jìn)行酸水解。酸水解后，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至5. 5，有大量沉淀生成，12000rpm離心20min,去除上清,得pro-pro-h[Gly8]GLP_l (7_36)D多肽粗品，凍干。人胰高血糖素樣肽-I類似物2pr0-pr0-h[Gly8，Glu22]GLP-I (7-35) PPSRD多肽的獲取方法與pro-pro-h [Gly8] GLP-1 (7-36) D 多肽相同。實(shí)施例6目的多肽的分離純化沉淀凍干后溶解于少量Binding Buffer中，上樣于Ni瓊脂糖凝膠親和層析柱,收集流出液，透析除鹽，凍干收集目的肽。pro-pro-h [Gly8，Glu22]GLP-I (7-35) PPSRD多肽的獲取方法與pro-pro-h[Gly8]GLP-1 (7_36)D相同。SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果見附圖7。實(shí)施例7兩種目的多肽的質(zhì)譜分析由中國藥科大學(xué)完成。方法為電噴霧質(zhì)譜。測得重組制備的pro-pro-h[Gly8]GLP-I (7-36)D的相對分子質(zhì)量為3594. 5Da ；pro-pro-h [Gly8, Glu22] GLP-1 (7-35) PPSRD 的相對分子質(zhì)量為 3947. 7Da(圖 8)，與理論推
算值一致。實(shí)施例8目的多肽的小鼠口服耐血糖實(shí)驗(yàn)ICR小鼠，雄性，5-7周，體重22 28g，按體重隨機(jī)分7組，分別為空白對照組，pro-pro-h[Gly8]GLP-1 (7-36)D 多肽高中低劑量給藥組，pro-pro-h[Gly8, Glu22]GLP-1 (7-35) PPSRD多肽高中低劑量給藥組，每組7只，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境1_2周，實(shí)驗(yàn)前I天晚禁食，僅給予飲水。凍干樣品用前以pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液(NaCl 8g，KCl 0. 2g, Na2HPO4L 44g,KH2PO4O. 24g，加800mL H2O溶解，以HCl調(diào)pH至7. 0，再加H2O至1000ml，滅菌)稀釋至所需濃度；血糖儀與血糖試紙(購自北京怡成生物電子技術(shù)有限公司)，小鼠胰島素檢測試劑盒。pro-pro-h [Gly8] GLP-1 (7-36) D 多肽給藥組皮下注射分別給予 20 U g/kg、80 U g/kg、140ii g/kg 樣品；pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1 (7-35)PPSRD 多肽給藥組皮下注射分別給予20 ii g/kg>80 u g/kg>140 u g/kg樣品；空白對照組小鼠腹腔給予等量磷酸鹽緩沖液；各組小鼠分別于給藥后灌胃2. Og/kg葡萄糖，并于葡萄糖負(fù)荷后0min、10min、20min、40min、60min、80min、lOOmin、120min對小鼠進(jìn)行尾靜脈取血；測定血糖濃度。
pro-pro-h[Gly8]GLP-I(7-36)D 和 pro-pro-h[Gly8， Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD高中低劑量給藥組降糖測定結(jié)果如圖9A和9B所示，說明pro-pro-h [Gly8, Glu22]GLP-1 (7-35)PPSRD呈現(xiàn)劑量依賴性，兩者與空白組比較P < 0.001，具有極顯著的降糖效果。實(shí)施例9目的多肽的促胰島素分泌作用ICR小鼠，雄性，5-7周，體重22 28g，實(shí)驗(yàn)前I天晚禁食，僅給予飲水。pro-pro-h [Gly8] GLP-1 (7-36) D 多肽給藥組皮下注射分別給予 20 y g/kg、80 u g/kg、140 ii g/kg 樣品；pr0-pr0-h[Gly8，Glu22]GLP-1 (7-35)PPSRD 多肽給藥組皮下注射分別給予20ii g/kg>80 u g/kg、140 ii g/kg樣品；空白對照組小鼠腹腔給予等量磷酸鹽緩沖液；各組小鼠分別于給藥后灌胃2. 0g/kg葡萄糖，20min后小鼠尾靜脈取血IOOii L,快速吹入離心管中(預(yù)加20 u I 0. IM EDTA)，4°C，4000rmp離心3min,取上清，存于-20°C，試劑盒測定胰島素濃度?？瞻讓φ战M、pro-pro-h[Gly8]GLP-1 (7-36) D 組和 pro-pro-h [Gly8, Glu22]GLP-1 (7-35) PPSRD組促進(jìn)胰島素分泌的測定結(jié)果如圖10A和10B所示，在低劑量情況下兩者與空白組比較P <0. 05，胰島素分泌具有顯著性的差異；在中高劑量情況下兩者與空白組比較P < 0.001，胰島素分泌具有極顯著差異。說明pro-pro-h[Gly8]GLP-I (7-36)D和pro-pro-h [Gly8, Glu22]GLP-1 (7-35) PPSRD具有很好的促胰島素分泌作用。除上述事實(shí)外，本發(fā)明還可以有其他實(shí)施方式，凡采用等同替換或等效變換性的技術(shù)方案，均落于本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.兩種人胰高血糖素相關(guān)肽-l(hGLP-l)類似物，人胰高血糖素相關(guān)肽-I類似物lpro-pro-h[Gly8]GLP-I (7-36)D 和人胰高血糖素相關(guān)肽-I 類似物 2pro-pro_h[Gly8,Glu22]GLP-I (7-35)PPSRD，該人胰島素樣肽-I類似物氨基酸序列分別為Pro-Pro-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-GIn-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Asp(SEQ ID NO 3)Pro-PrO-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Pro-Pro-Ser-Arg-Asp(SEQ IDNO 4)
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的pr0-pr0-h[Gly8]GLP-I (7_36) D，其特征在于該類似物相對分子質(zhì)量3593. %Da，其中GLP-I (7-36)部分的8位Ala殘基的位置取代為Gly，同時(shí)N端接加2個(gè)脯氨酸(Pro)殘基，N端包含DPPIV及PPCE酶切位點(diǎn)，C端加上D ；pro-pro-h[Gly8,Glu22] GLP-I (7-35) PPSRD其特征在于該類似物相對分子質(zhì)量3947. 33Da，其中GLP-I (7-35)部分的8位Ala殘基的位置取代為Gly，22位Gly殘基的位置取代為Glu，同時(shí)N端接加2個(gè)脯氨酸(Pro)殘基，N端包含DPPIV及PPCE酶切位點(diǎn)，C端加上PPSRD。
3.權(quán)利要求I 和 2 所述的 pro-pro-h[Gly8]GLP-1 (7-36) D 和 pro-pro-h [Gly8, Glu22]GLP-I (7-35) PPSRD 的生物活性，其特征在于pro-pro-h[Gly8]GLP_l (7-36) D 的 N 端 Ala 被Gly取代，C端加上D同時(shí)N端接加2個(gè)脯氨酸殘基；pr0-pix)-h[Gly8，Glu22]GLP-I (7-35)PPSRD的N端Ala被Gly取代，22位由Glu取代Gly，C端加上PPSRD，同時(shí)N端接加2個(gè)脯氨酸殘基，所形成的兩種人胰高血糖素相關(guān)肽-I依然能保持顯著的生物活性，促進(jìn)血糖降低。
4.兩種設(shè)計(jì)合成的多核苷酸，其特征在于包含兩種核苷酸序列，其特征在于，該多核苷酸具有SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示核苷酸序列。該核苷酸序列分別編碼權(quán)利要求2所示氨基酸的人胰高血糖素相關(guān)肽-I類似物。
5.ー種載體，其特征在于它包含權(quán)利要求4所述的核苷酸序列及重組方法將由PCR方法生成的L-天冬氨酸酶N端加入His標(biāo)簽及在其C末端127個(gè)氨基酸的DNA片段分別與人工 PCR 方法合成的 Asp-pro-pro-h[Gly8]GLP-1 (7-36)D 和 Asp-pro-pro-h[Gly8,Glu22]GLP-I (7-35)PPSRD的基因序列融合，構(gòu)成新的融合蛋白基因。將該基因插入到pED載體17啟動(dòng)子下游。這個(gè)重組的融合表達(dá)質(zhì)粒稱pED-PPGLP-lD和pED-PPGLP-lPPSRD。pED-PPGLP-lD 包括了ー個(gè)融合伙伴和 Asp-pro-pro-h [Gly8] GLP-1 (7-36) D 的基因；pED-PPGLP-lPPSRD 包括了ー個(gè)融合伙伴和 Asp-pro-pro-h [Gly8，Glu22] GLP-1 (7-35)PPSRD的基因。
6.ー種基因工程菌，其特征在于它含有權(quán)利要求5所述的載體。
7.包括權(quán)利5所述的該類似物的重組方法，其特征在于該融合蛋白使用L-天冬氨酸N端插入6個(gè)His與127個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成融合蛋白，在融合伙伴基因與活性多肽之間以天冬-脯肽鍵連接，這種連接對酸敏感。
8.權(quán)利要求I 和 2 所述的 pro-pro-h[Gly8]GLP-1 (7-36) D 和 pro-pro-h [Gly8, Glu22]GLP-1 (7-35) PPSRD進(jìn)入體內(nèi)后，通過體內(nèi)豐富的DPPIV及PPCE酶迅速酶切N末端的Pro-Pro-,形成 h[Gly8]GLP-I (7-36) D 和 h [Gly8，Glu22]GLP-I (7-35) PPSRD。這對于研制抗DPPIV水解的長效激素是有益的。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的兩種人胰高血糖素相關(guān)肽-I類似物的活性，其特征在于所述的兩種人胰高血糖素相關(guān)肽-I類似物具有血糖依賴性的降低血 糖和促胰島素分泌的作用，且作用效果具有顯著性，有望用于治療2型糖尿病。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，公開兩種人胰高血糖素相關(guān)肽-1的類似物的工程菌構(gòu)建、表達(dá)、目的肽的制備方法。通過雙酶切后插入目的序列，并在融合蛋白前端加入His標(biāo)簽，通過獲得融合蛋白，用酸切割融合蛋白獲得目的肽，等電點(diǎn)沉淀后再次通過Ni瓊脂糖凝膠親和層析獲得目的肽。凍干后目的肽溶于PBS緩沖液中，對正常雄性ICR小鼠進(jìn)行口服耐血糖實(shí)驗(yàn)及測定血清胰島素濃度。這兩種類似物是人胰高血糖素相關(guān)肽-1的改構(gòu)多肽，實(shí)驗(yàn)證明兩種多肽均具有降低血糖作用，可用于治療2型糖尿病。另外本發(fā)明還提供了制備上述多肽的方法。
文檔編號C12N1/21GK102796192SQ201110133160
公開日2012年11月28日 申請日期2011年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月23日
發(fā)明者李泰明, 馬艷紅, 劉景晶, 徐辰, 劉濤, 谷春嬌 申請人:中國藥科大學(xué)