專利名稱：輔助鑒定鼠遺傳穩(wěn)定性相關(guān)基因的專用引物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種輔助鑒定鼠遺傳穩(wěn)定性相關(guān)基因的專用引物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在動(dòng)物的基因組中，p21、cdkl、p53、chekl、helb、atr和atm等基因是維持動(dòng)物遺傳穩(wěn)定的主要基因，它們在細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)了重要的位置，這些基因的穩(wěn)定表達(dá)對細(xì)胞的生長、維持和分化都具有重要意義。Cdkl蛋白能夠與核苷酸結(jié)合，是周期蛋白依賴蛋白激酶，參與蛋白氨基酸磷酸化， 調(diào)控有絲分裂細(xì)胞周期，負(fù)調(diào)控細(xì)胞增殖。P21基因也稱cdknla，編碼周期蛋白依賴激酶抑制因子1A，分布于細(xì)胞核中，具有蛋白激酶活性，是周期蛋白依賴蛋白激酶抑制因子，調(diào)控周期蛋白依賴蛋白激酶，介導(dǎo)負(fù)調(diào)控細(xì)胞增殖，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Chekl是CHKl 檢控點(diǎn)同源物(裂殖酵母)分布于濃縮核染色體；具有、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性；參與DNA損傷檢控點(diǎn)，調(diào)控周期蛋白依賴蛋白激酶、具有DNA修復(fù)功能等。Helb基因(helb 基因)編碼DNA解旋酶B。atm基因被公認(rèn)為是一個(gè)腫瘤抑制基因，共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變(包括互補(bǔ)組A，C和D)分布于細(xì)胞核，可以直接或間接的參與DNA損傷修復(fù)，從而影響細(xì)胞周期、減數(shù)分裂重組、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和負(fù)調(diào)控進(jìn)程，其突變或缺損后共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張、抑癌功能隨之喪失，引起乳腺癌、淋巴瘤等病變。P53基因是一種腫瘤抑制基因，在所有惡性腫瘤中，50%以上會(huì)出現(xiàn)該基因的突變，P53介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在調(diào)節(jié)細(xì)胞正常生命活動(dòng)中起重要作用，它與細(xì)胞內(nèi)其它信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路間的聯(lián)系十分復(fù)雜，其中P53參與調(diào)控的基因已超過160種。由此可見小鼠基因組序列的大量信息為研究基因功能及其表達(dá)調(diào)控、胚胎發(fā)育和人類疾病的分子機(jī)制提供了研究基礎(chǔ)和技術(shù)手段，因此小鼠作為最主要的轉(zhuǎn)基因模式動(dòng)物，被廣泛的應(yīng)用于生命科學(xué)和醫(yī)藥研究中。但是這把雙刃劍引起的安全問題也日漸引起世界的廣泛關(guān)注如食用安全、環(huán)境安全、倫理安全等。外源基因插入位點(diǎn)的不同可造成不同程度的基因改變，可能引起非預(yù)期效應(yīng)。常常因外源基因的表達(dá)產(chǎn)物意外激活(或抑制)其他自然基因的表達(dá)，進(jìn)而改變動(dòng)物體內(nèi)一些正常生理過程，從而導(dǎo)致小鼠發(fā)育異?；虍a(chǎn)生疾??；被修飾的基因產(chǎn)物有可能破壞細(xì)胞正常生理功能及代謝平衡，影響小鼠的健康，甚至具有潛在的致癌性。因此在轉(zhuǎn)基因小鼠和研究中，檢測轉(zhuǎn)基因小鼠自然基因表達(dá)情況的十分必要，尤其是與遺傳穩(wěn)定性相關(guān)的基因。 目前我國制定的關(guān)于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物安全檢測問題的管理?xiàng)l例仍不完善，與相關(guān)檢測技術(shù)亦不能完全配套。因此，建立檢測P21基因、cdkl基因、p53基因、chekl基因、helb基因、atr基因和atm基因的RT-PCR方法對檢測轉(zhuǎn)基因小鼠遺傳穩(wěn)定性具有重要意義，有助于安全評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的制定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種輔助鑒定鼠遺傳穩(wěn)定性相關(guān)基因的專用引物及其應(yīng)用。
本發(fā)明提供的輔助鑒定鼠遺傳穩(wěn)定性相關(guān)基因的專用引物(引物組合物)，包括 P53引物對；所述p53引物對由序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成。所述專用引物還可包括p21引物對、chekl引物對、atm引物對、cdkl引物對、helb 引物對和atr引物對中的至少一種；所述p21弓丨物對由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成；所述chekl引物對由序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6 所示DNA組成；所述atm引物對由序列表的序列7所示DNA和序列表的序列8所示DNA組成；所述cdkl引物對由序列表的序列9所示DNA和序列表的序列10所示DNA組成；所述 helb引物對由序列表的序列11和序列表的序列12所示DNA組成；所述atr引物對由序列表的序列13和序列表的序列14所示DNA組成。所述專用引物具體可由所述p53引物對、所述p21引物對、所述chekl引物對、所述atm引物對、所述cdkl引物對、所述helb引物對和所述atr引物對組成。所述鼠遺傳穩(wěn)定性相關(guān)基因具體可為P53基因、p21基因、chekl基因、atm基因、 cdkl基因、helb基因和atr基因中的至少一個(gè)；所述p53基因如序列表的序列15所示；所述p21基因如序列表的序列16所示；所述chekl基因如序列表的序列17所示；所述atm基因如序列表的序列18所示；所述cdkl基因如序列表的序列19所示；所述helb基因如序列表的序列20所示；所述atr基因如序列表的序列21所示。以上任一所述的專用引物均可用于輔助鑒定鼠遺傳穩(wěn)定性相關(guān)基因。所述鼠遺傳穩(wěn)定性相關(guān)基因具體可為p53基因、p21基因、chekl基因、atm基因、 cdkl基因、helb基因和atr基因中的至少一個(gè)；所述p53基因如序列表的序列15所示；所述p21基因如序列表的序列16所示；所述chekl基因如序列表的序列17所示；所述atm基因如序列表的序列18所示；所述cdkl基因如序列表的序列19所示；所述helb基因如序列表的序列20所示；所述atr基因如序列表的序列21所示。本發(fā)明還保護(hù)一種輔助鑒定鼠遺傳穩(wěn)定性相關(guān)基因的方法，包括如下步驟以待測鼠的cDNA為模板，用所述專用引物中的每個(gè)引物對分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物輔助鑒定鼠遺傳穩(wěn)定性相關(guān)基因；所述鼠遺傳穩(wěn)定性相關(guān)基因?yàn)閜53基因、 p21基因、chekl基因、atm基因、cdkl基因、helb基因和atr基因中的至少一個(gè)；所述p53 基因如序列表的序列15所示(GenBank Accession No. NM_001127233. 1)；所述p21基因如序列表的序列16所示(GenBank Accession No. NM_007669. 4)；所述chekl基因如序列表的序列17所示(GenBank Accession No. NM_007691. 5)；所述atm基因如序列表的序列 18所示(GenBank Accession No. NM_007499. 2)；所述cdkl基因如序列表的序列19所示 (GenBank Accession No. NM_007659. 3)；所述 helb 基因如序列表的序列 20 所示(GenBank Accession No. NM_080446. 2)；所述 atr 基因如序列表的序列 21 所示(GenBank Accession No. ΝΜ_019864. 1)。所述p53引物對用于輔助鑒定所述P53基因，其目的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為369bp ；所述 P21引物對用于輔助鑒定所述p21基因，其目的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為218bp ；所述chekl弓丨物對用于輔助鑒定所述chekl基因，其目的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為400bp ；所述atm引物對用于輔助鑒定所述atm基因，其目的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為67^p ；所述cdkl引物對用于輔助鑒定所述cdkl 基因，其目的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為278bp ；所述helb引物對用于輔助鑒定所述helb基因，其目的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為；所述atr引物對用于輔助鑒定所述atr基因，其目的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為68^3ρ。所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系具體可為ddH20 17μ 1,10XPCR Buffer 2. 5μ 1, 2. 5mMdNTP 2 μ 1，10 μ mol/L 的每條引物各 0.5yl，cDNA 2 μ 1,2. 5U/μ L Taq polymeraseO. 5 μ 1。所述PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)參數(shù)具體可為94°C 5min ；94°C 30s、57°C 30s,72°C 40s, 30 個(gè)循環(huán)；72 °C 5min。所述鼠具體可為小鼠，所述小鼠具體可為C57/U9SV品系的小鼠。本發(fā)明公開了輔助鑒定小鼠遺傳穩(wěn)定性相關(guān)基因(p21基因、cdkl基因、p53基因、 chekl基因、helb基因、atr基因和atm基因)的專用引物，基于該專用引物開發(fā)了助鑒定小鼠遺傳穩(wěn)定性相關(guān)基因的RT-PCR方法，并優(yōu)化了檢測條件和檢測體系。實(shí)現(xiàn)了 7對引物在同一條件下擴(kuò)增7個(gè)基因的目的。本發(fā)明提供的方法具有操作簡單、高效特異的特點(diǎn)，同時(shí)具有較高的應(yīng)用價(jià)值，可為轉(zhuǎn)基因小鼠的安全性評價(jià)和標(biāo)準(zhǔn)制定提供參考。


圖1為實(shí)施例2的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖2為實(shí)施例3的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖3為實(shí)施例4的瓊脂糖凝膠電泳圖。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。TIANGENTM Quant cDNA 第一鏈合成試劑盒又稱 TIANGEN Quantscript RT Kit，產(chǎn)品目錄號(hào)為 KR103。10XPCR Buffer,dNTP(2. 5mM)禾Π Taq DNApolymerase 均購自威格拉斯生物技術(shù)(北京)有限公司。實(shí)施例中所用的小鼠品系為C57/129SV，購自軍事科學(xué)院。實(shí)施例1、輔助鑒定鼠遺傳穩(wěn)定性的專用引物的制備輔助鑒定鼠遺傳穩(wěn)定性的專用引物由ρ53引物對(由p53-F和p53_R組成)、p21 引物對(由P21-F和p21_R組成)、chekl引物對(由chekl-F和chekl-R組成)、atm引物對(由atm-F和atm-R組成),cdkl引物對(由cdkl-F和cdkl-R組成),helb引物對(由 heIb-F和heIb-R組成)和atr引物對(由atr-F和atr-R組成)組成。合成表1所示的各條引物，合成的引物組成輔助鑒定鼠遺傳穩(wěn)定性的專用引物。專用引物中各條引物均單獨(dú)包裝。表1各條引物的核苷酸序列及其靶序列長度
權(quán)利要求
1.輔助鑒定鼠遺傳穩(wěn)定性相關(guān)基因的專用引物，包括P53引物對；所述p53引物對由序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成。
2.如權(quán)利要求1所述的專用引物，其特征在于所述專用引物還包括p21引物對、 chekl引物對、atm引物對、cdkl引物對、helb引物對和atr引物對中的至少一種；所述p21 引物對由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成；所述chekl引物對由序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA組成；所述atm引物對由序列表的序列7所示DNA和序列表的序列8所示DNA組成；所述cdkl引物對由序列表的序列9所示 DNA和序列表的序列10所示DNA組成；所述helb引物對由序列表的序列11和序列表的序列12所示DNA組成；所述atr引物對由序列表的序列13和序列表的序列14所示DNA組成。
3.如權(quán)利要求2所述的專用引物，其特征在于所述專用引物由所述p53引物對、所述 p21引物對、所述chekl引物對、所述atm引物對、所述cdkl引物對、所述helb引物對和所述atr引物對組成。
4.如權(quán)利要求1至3中任一所述的專用引物，其特征在于所述鼠遺傳穩(wěn)定性相關(guān)基因?yàn)閜53基因、p21基因、chekl基因、atm基因、cdkl基因、helb基因和atr基因中的至少一個(gè)；所述P53基因如序列表的序列15所示；所述p21基因如序列表的序列16所示；所述 chekl基因如序列表的序列17所示；所述atm基因如序列表的序列18所示；所述cdkl基因如序列表的序列19所示；所述helb基因如序列表的序列20所示；所述atr基因如序列表的序列21所示。
5.權(quán)利要求1至4中任一所述的專用引物在輔助鑒定鼠遺傳穩(wěn)定性相關(guān)基因中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述鼠遺傳穩(wěn)定性相關(guān)基因?yàn)閜53基因、 p21基因、chekl基因、atm基因、cdkl基因、helb基因和atr基因中的至少一個(gè)；所述p53 基因如序列表的序列15所示；所述p21基因如序列表的序列16所示；所述chekl基因如序列表的序列17所示；所述atm基因如序列表的序列18所示；所述cdkl基因如序列表的序列19所示；所述helb基因如序列表的序列20所示；所述atr基因如序列表的序列21所示ο
7.一種輔助鑒定鼠遺傳穩(wěn)定性相關(guān)基因的方法，包括如下步驟以待測鼠的cDNA為模板，用權(quán)利要求1至3中任一所述專用引物中的每個(gè)引物對分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物輔助鑒定鼠遺傳穩(wěn)定性相關(guān)基因；所述鼠遺傳穩(wěn)定性相關(guān)基因?yàn)镻53基因、p21基因、chekl基因、atm基因、cdkl基因、helb基因和atr基因中的至少一個(gè)；所述P53基因如序列表的序列15所示；所述p21基因如序列表的序列16所示；所述chekl基因如序列表的序列17所示；所述atm基因如序列表的序列18所示；所述cdkl 基因如序列表的序列19所示；所述helb基因如序列表的序列20所示；所述atr基因如序列表的序列21所示。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述p53引物對用于輔助鑒定所述p53基因，其目的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為369bp ；所述p21引物對用于輔助鑒定所述p21基因，其目的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物為218bp ；所述chekl引物對用于輔助鑒定所述chekl基因，其目的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為400bp ；所述atm引物對用于輔助鑒定所述atm基因，其目的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為67^p ；所述cdkl引物對用于輔助鑒定所述cdkl基因，其目的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為278bp ；所述helb引物對用于輔助鑒定所述helb基因，其目的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為；所述atr引物對用于輔助鑒定所述atr基因，其目的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為686bp。
9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為 ddH2017y 1，10XPCR Buffer 2. 5 μ 1,2. 5mM dNTP 2 μ 1，10 μ mol/L 的每條引物各 0. 5 μ 1， cDNA 2 μ 1,2. 5U/μ L Taq polymerase 0·5 μ 1。
10.如權(quán)利要求7至9中任一所述的方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)參數(shù)為 940C 5min ；94°C 30s,57°C 30s,72°C 40s, 30 個(gè)循環(huán)；72°C 5min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種輔助鑒定鼠遺傳穩(wěn)定性相關(guān)基因的專用引物及其應(yīng)用。所述專用引物包括序列1和2所示DNA組成的p53引物對。所述專用引物還包括序列3和4所示DNA組成的p21引物對、序列5和6所示DNA組成的chek1引物對、序列7和8所示DNA組成的atm引物對、序列9和10所示DNA組成的cdk1引物對、序列11和12所示DNA組成的helb引物對和序列13和14所示DNA組成的atr引物對中的至少一種。本發(fā)明提供的方法具有操作簡單、高效特異的特點(diǎn)，同時(shí)具有較高的應(yīng)用價(jià)值，可為轉(zhuǎn)基因小鼠的安全性評價(jià)和標(biāo)準(zhǔn)制定提供參考。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102181570SQ20111013252
公開日2011年9月14日 申請日期2011年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月20日
發(fā)明者任芳麗, 夏永靜, 常智杰, 張 誠, 王銀銀, 甘一迪, 竇琳, 韓斌 申請人:清華大學(xué)