專利名稱：一種β-葡萄糖苷酶突變體、其重組表達(dá)質(zhì)粒及轉(zhuǎn)化的工程菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及通過基因定點(diǎn)突變的方法獲得葡萄糖耐受濃度提高的β -葡萄糖苷酶基因、突變質(zhì)粒、工程菌及突變酶。
背景技術(shù)：
β -葡萄糖苷酶(EC 3. 2. 1. 21)屬于外切水解酶類，是一類在親核分子間催化轉(zhuǎn)移糖苷的酶，可以在短鏈的寡糖或纖維二糖內(nèi)部、在帶有芳香基團(tuán)或烷基的碳水化合物的殘基之間打斷β_1，4-糖苷鍵。葡萄糖苷酶是一類重要的工業(yè)用酶，潛在應(yīng)用廣泛，在眾多生物技術(shù)生產(chǎn)過程中具有重要的應(yīng)用價值。它是食品工業(yè)中重要的風(fēng)味酶，可以水解水果中的風(fēng)味前體物——β -糖苷，釋放出揮發(fā)性糖苷配基，充任水果風(fēng)味增香酶的角色； β -葡萄糖苷酶兼具有糖苷轉(zhuǎn)移酶的活性，可以用于合成新的糖配體；β -葡萄糖苷酶可以與其他幾種纖維素降解酶協(xié)同作用，將纖維素降解成葡萄糖，后者能為產(chǎn)能微生物利用，進(jìn)而煉制生成燃料乙醇等能源物質(zhì)。一般情況下，β-葡萄糖苷酶對其水解產(chǎn)物葡萄糖異常敏感，極低濃度的葡萄糖就能夠反饋抑制葡萄糖苷酶的活性。葡萄糖苷酶對葡萄糖的抑制常數(shù) Ki 一般為 0. 5mM-100mM(ffatanabe Τ, Sato S, Yoshioka Τ, et al. Purification and properties of Aspergillus niger β-glucosidase. J. Biochem. 1992, 209 :651-659 ； Woodward J and Wiseman A. Fungal and other β —D—glucosidases their properties and applications. Enzyme Microb. Technol. 1982,4 :73-79.)，僅有極少數(shù)的 β _ 葡萄糖苷酶具有較高的葡萄糖耐受濃度(Christine R，Jean-Michel S，Marie-Jose V, et al. Purification, characterization, and subatrate specificity of a novel highly glucose-tolerant β -glucosidase from Aspergillus niger.Applied and Environmental Microbiology. 1998,64(10) :3607-3614.)。在 β-葡萄糖苷酶工業(yè)應(yīng)用過程中，人們發(fā)現(xiàn)，非葡萄糖敏感的β -葡萄糖苷酶降解纖維素的速度更快，可以改善木質(zhì)纖維素的發(fā)酵工藝；并且，利用葡萄糖耐受的葡萄糖苷酶，可生產(chǎn)出20-30% 農(nóng) it 的胃 ^f (ffaldron CR, Becker-Vallone CA, and Eveleigh DE. Isolation and characterization of a cellulolytic actinomycete Microbispora bispora. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1986，24:477-486.)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于提供一種運(yùn)用定點(diǎn)突變的方法獲得的選擇性突變的 β-葡萄糖苷酶突變體。本發(fā)明的第二個目的在于提供一種編碼如上述的β -葡萄糖苷酶突變體的DNA序列及其突變質(zhì)粒。本發(fā)明的第三個目的在于提供一種轉(zhuǎn)化有上述重組表達(dá)質(zhì)粒的葡萄糖苷酶生產(chǎn)菌株。本發(fā)明的第四個目的在于提供一種利用上述葡萄糖苷酶生產(chǎn)菌株生產(chǎn)的 β-葡萄糖苷酶的突變體。本發(fā)明的β -葡萄糖苷酶突變體，氨基酸序列如以下任意一項(xiàng)所述A)、SEQ ID No. 1所示的β -葡萄糖苷酶的氨基酸序列中第184位的組氨酸突變?yōu)楸奖彼幔籅)、SEQ ID No. 1所示的所示的β -葡萄糖苷酶的氨基酸序列中第409位的亮氨酸突變?yōu)楣劝彼?。C)、SEQ ID No. 1所示的β -葡萄糖苷酶的氨基酸序列中第184位的組氨酸突變?yōu)楸奖彼幔?09位的亮氨酸突變?yōu)楣劝彼?。本發(fā)明的一種β -葡萄糖苷酶突變體，所述突變體的氨基酸序列還可以包括序列中的無義突變或同義突變的組合。本發(fā)明提供一種突變質(zhì)粒，包含上述編碼有所述β -葡萄糖苷酶突變體的DNA序列。本發(fā)明還提供一種具有β -葡萄糖苷酶合成性能的工程菌，所述工程菌含有上面所述的突變質(zhì)粒，所述β-葡萄糖苷酶突變體由工程菌發(fā)酵獲得。下面介紹下本發(fā)明β -葡萄糖苷酶突變體的獲得首先以來自多粘芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)的β -葡萄糖苷酶與葡萄糖復(fù)合物的結(jié)構(gòu)作為模板，利用Swiss-Model建模海洋未培養(yǎng)微生物來源的葡萄糖苷酶(BgllA)，并通過疊加獲得BgllA與葡萄糖復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，從而獲得相應(yīng)的與葡萄糖結(jié)合的氨基酸殘基位點(diǎn)。根據(jù)海洋未培養(yǎng)微生物來源的β -葡萄糖苷酶(BgllA)的基因序列，設(shè)計并合成突變引物，再以包含海洋未培養(yǎng)微生物來源的葡萄糖苷酶基因的重組質(zhì)粒為模板質(zhì)粒，以上述的合成突變引物為引物，基于PCR的方法進(jìn)行定點(diǎn)突變，從而獲得葡萄糖耐受性能提高的葡萄糖苷酶的突變基因。將突變DNA與pMD18-T質(zhì)粒連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，對突變基因進(jìn)行DNA序列測定。挑選序列正確的克隆提取質(zhì)粒，獲得含有突變β-葡萄糖苷酶基因的PMD18-T重組質(zhì)粒，用Nde I和Bio I雙酶切所得的pMD18_T重組質(zhì)粒和表達(dá)質(zhì)粒載體，然后用T4 DNA連接酶將酶切后的突變基因與表達(dá)質(zhì)粒載體連接，得到連接產(chǎn)物；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主菌，篩選陽性克隆，得到含有本發(fā)明突變基因的工程菌株。上述構(gòu)建方法中所述表達(dá)質(zhì)粒載體指pCold、pET15、pET22或pED8等。上述構(gòu)建方法中所述宿主菌是指E. coli BL21(DE3)、E. coli DH5a、E. coli JM109 或 Ε. coli Rosetta 等。將獲得的含有突變基因的工程菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，并純化獲得β -葡萄糖苷酶突變酶蛋白。對突變酶蛋白和原始野生型蛋白的葡萄糖耐受性能、最適ρΗ、ρΗ穩(wěn)定性、最適溫度和溫度穩(wěn)定性等進(jìn)行了測定和比較。測定結(jié)果顯示，本發(fā)明獲得的突變酶的葡萄糖耐受濃度相對野生型BgllA提高了 13倍，而其他酶學(xué)性質(zhì)如最適ρΗ、最適溫度等沒有發(fā)生變化，而其他酶學(xué)性質(zhì)沒有變化，在
4工業(yè)上具有應(yīng)用價值，其可以改善木質(zhì)纖維素的發(fā)酵工藝，并且可生產(chǎn)出高達(dá)20-30%濃度的果汁。


圖1為本發(fā)明PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜；圖1中1為PCR擴(kuò)增的409S2片段，2為409S1片段，3為184S2片段，4為184S1 片段，M 為 DNA marker ο圖2為本發(fā)明分別以409S1和409S2、184S1和184S2組合為模板PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜。圖2中1為184S1和184S2組合為模板PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，2為409S1和409S2組合為模板PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，M為DNA marker ο圖3為本發(fā)明純化的突變蛋白和野生型蛋白的電泳圖譜圖3中1為H184F突變蛋白，2為L409E突變蛋白，3為野生型rBgllA，M為蛋白 markerο圖4為本發(fā)明突變蛋白與野生型蛋白的葡萄糖耐受性能比較。圖5為本發(fā)明突變蛋白與野生型蛋白部分酶學(xué)性質(zhì)比較。其中圖5A為最適pH比較，圖5B為最適溫度比較，圖5C為pH穩(wěn)定性比較，圖5D 為溫度穩(wěn)定性比較。
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例中的實(shí)施方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。(一 )、含有本發(fā)明β -葡萄糖苷酶突變基因的表達(dá)菌株的構(gòu)建1、β -葡萄糖苷酶基因突變位點(diǎn)的選擇以來自多粘芽孢桿菌(Paenikicillus polymyxa)的β-葡萄糖苷酶與葡萄糖復(fù)合物的結(jié)構(gòu)作為模板，利用 Swiss-Model (http //swissmodel. expasy. otr/ ；Kiefer F, Arnold K, Kunzli Μ, Bordoli L, Schwede Τ. The SffIS S-MODEL Repository and associated resources. Nucleic Acids Research. 2009,37, D387-392.)建模海洋未培養(yǎng)微生物來源的葡萄糖苷酶(BgllA)，并通過疊加獲得BgllA與葡萄糖復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。根據(jù)建模的結(jié)構(gòu)信息，確定定點(diǎn)突變的位點(diǎn)為184位點(diǎn)的組氨酸H和409位點(diǎn)的亮氨酸L，突變方向?yàn)?84位點(diǎn)的組氨酸H被苯丙氨酸F替代，409位點(diǎn)的亮氨酸L被谷氨酸E替代。2、突變引物的設(shè)計和突變基因的PCR擴(kuò)增根據(jù)海洋未培養(yǎng)微生物來源的β -葡萄糖苷酶的基因序列SEQ ID No :2(其氨基酸序列如SEQ ID No 1),以及選定的突變位點(diǎn)184H和409L，設(shè)計以下6個定點(diǎn)突變引物以包含海洋未培養(yǎng)微生物來源的β -葡萄糖苷酶(BgllA)基因的重組質(zhì)粒為模板質(zhì)粒，將上述的合成突變引物進(jìn)行配對，分別為bgllAS與184A、184S與bgllAA、bgllAS與 409A、409S與bgllAA，作為PCR引物對，擴(kuò)增產(chǎn)物依次命名為184S1、184S2、409S1、409S2 ； 回收4中擴(kuò)增片段，將184S1和184S2加入同一反應(yīng)體系中，409S1和409S2加入另一反應(yīng)體系中，作為各自反應(yīng)體系中的PCR反應(yīng)模板，并利用bgllAS、bgllAA引物對作為擴(kuò)增引物，擴(kuò)增bgllB突變基因全長序列并回收備用。
Oligo nucleotidesSequence(5'-3')184STGAAATGGGGGTGTTCGCGCCAGGTTTAMutation site underlined184ATTAAACCTGGCGCGAACACCCCCATTTCMutation site underlined409STGAGTGGGCAGAAGGTTATAGTAAGMutation site underlined409ACTTACTATAACCTTCTGCCCACTCAMutation site underlinedbgllASGGGCATATGACAAAATTAACTTTACCTNde I site underlinedbgllAATTTCTCGAGTTCGTGGGTAACAAGTGXho I site underlined3、表達(dá)載體的構(gòu)建將步驟2中得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，與pMD18-T質(zhì)粒連接(TaKaRa)，建立如下酶切體系25ng pMD18-T 載體，50ng PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，5ul ligation mix，補(bǔ)水至 10ul，16°C連接 lh。連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，得到的轉(zhuǎn)化子，測序驗(yàn)證是否突變；挑選序列正確的克隆提取質(zhì)粒，獲得含有本發(fā)明β -葡萄糖苷酶突變基因的PMD18-T重組質(zhì)粒；用Nde I和Bio I雙酶切所得的pMD18-T重組質(zhì)粒和ρΕΤ2^ (+)載體，然后用T4DNA 連接酶將酶切后的突變基因與表達(dá)質(zhì)粒載體連接，建立如下酶切體系25ng pET22b(+)載體，50ng 突變基因酶切片段，3ul IOXligation buffer, Iul T4DNA 連接酶(TaKaRa)，補(bǔ)水至30ul，16°C連接8h，得到連接產(chǎn)物；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主菌，得到的轉(zhuǎn)化子測序驗(yàn)證是否突變，挑選序列正確的轉(zhuǎn)化子得到含有本發(fā)明突變基因的工程菌株E. coli BL2KDE3)/ pET22b(+)-bgllA/H184 禾口 E. coli BL21(DE3)/pET22b(+)-bgl1A/L409E 本發(fā)明的菌株大腸桿菌BL21(DE3)/pET22b(+)-bgllA/H184F Escherichia coli BL21(DE3)/pET22b(+)-bgllA/H184F 已送往中國典型培養(yǎng)物保藏中心(China Center for Type Culture Collection, CCTCC)保藏，保藏單位地址中國 武漢 武漢大學(xué)；菌株保藏編號為CCTCC NO =M 2010159，保藏日期2010年6月25日。( 二 )、含本發(fā)明β -葡萄糖苷酶突變基因工程菌的表達(dá)與蛋白純化將(一)中獲得的基因的工程菌株Ε. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) -bgl 1A/H184F 和 E. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) -bgl 1A/L409E 接種于含有氨芐青霉素的 200ml LB 液體培養(yǎng)基中，放置于37 °C、250rpm條件下培養(yǎng)至OD6tltl = 0. 6 (UNIC0 UV2102紫外可見分光光度計，以培養(yǎng)LB培養(yǎng)基為空白)；加入終濃度為0. 75mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，并于30°C、 180rpm條件下繼續(xù)培養(yǎng)5小時；4°C、8000g離心收集菌體，加入0. 1倍菌液體積的Binding buffer, 350W冰浴條件下超聲40min破碎細(xì)胞，30000g離心收集上清，得到粗酶液。全菌蛋白SDS-PAGE顯示蛋白表達(dá)量占全菌蛋白的50%以上。粗酶液經(jīng)過Ni-NTA柱層析進(jìn)行純化。洗脫液中咪唑濃度為60mM，洗脫10個柱體積。得到的蛋白經(jīng)過檢測達(dá)到SDS-PAGE純度。以pNPG為底物，純化的β-葡萄糖苷酶突變蛋白的最適pH為6. 5，酶在pH5. 5-7. 5 范圍內(nèi)能夠顯示80%以上的酶活力。酶在pH6. 0-9. 0范圍內(nèi)有較高的穩(wěn)定性，30°C條件下
6保溫Ih仍然能夠維持原酶活力的60%以上。突變蛋白在15°C _55°C范圍內(nèi)均能顯示催化活性，其最適溫度為40°C。 相對野生型葡萄糖苷酶蛋白，獲得的突變蛋白的葡萄糖耐受濃度提高了 13 倍，葡萄糖對bgllA/H184E抑制的Ki為400mM(圖4)，而其他酶學(xué)性質(zhì)沒有變化，在工業(yè)上具有應(yīng)用價值。
權(quán)利要求
1.一種β-葡萄糖苷酶突變體，其特征在于所述突變體的氨基酸序列如以下任意一項(xiàng)所述 A)、SEQID No. 1所示的β -葡萄糖苷酶的氨基酸序列中第184位的組氨酸突變?yōu)楸奖彼?；B)、SEQID No. 1所示的所示的β -葡萄糖苷酶的氨基酸序列中第409位的亮氨酸突變?yōu)楣劝彼帷)、SEQID No. 1所示的β -葡萄糖苷酶的氨基酸序列中第184位的組氨酸突變?yōu)楸奖彼幔?09位的亮氨酸突變?yōu)楣劝彼帷?br> 2.編碼如權(quán)利要求1所述的一種β-葡萄糖苷酶突變體的DNA序列。
3.一種突變質(zhì)粒，其特征在于，含有編碼權(quán)利要求2所述的葡萄糖苷酶突變體的 DNA序列。
4.一種具有葡萄糖苷酶合成性能的工程菌，其特征在于，含有權(quán)利要求3所述的突變質(zhì)粒。
5.一種葡萄糖苷酶，其特征在于，由權(quán)利要求3所述的工程菌發(fā)酵獲得。
全文摘要
本發(fā)明通過基因定點(diǎn)突變的方法獲得葡萄糖耐受濃度提高的β-葡萄糖苷酶的基因、突變質(zhì)粒、工程菌，并可在將工程菌誘導(dǎo)表達(dá)后，獲得葡萄糖耐受濃度提高的β-葡萄糖苷酶。本發(fā)明以來自海洋未培養(yǎng)微生物來源的β-葡萄糖苷酶為基礎(chǔ)，通過PCR定點(diǎn)突變，獲得突變基因。相對野生型β-葡萄糖苷酶蛋白，獲得的突變蛋白的葡萄糖耐受濃度提高了13倍，而其他酶學(xué)性質(zhì)沒有變化，在工業(yè)上具有應(yīng)用價值，其可以改善木質(zhì)纖維素的發(fā)酵工藝，并且可生產(chǎn)出高達(dá)20-30％濃度的果汁。
文檔編號C12N1/19GK102220302SQ20111013252
公開日2011年10月19日 申請日期2011年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月20日
發(fā)明者劉娟娟, 張學(xué)成, 房偉, 方澤民, 洪宇植, 肖亞中 申請人:安徽大學(xué)