專利名稱：一步法檢測新型甲型h1n1 2009流感病毒的試劑制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種病毒檢測試劑盒，尤其涉及一種PH1N1-2009流感病毒檢測試劑
品.ο
背景技術(shù)：
流感病毒屬正黏病毒科，由8條單股負(fù)鏈RNA構(gòu)成基因組。流感病毒根據(jù)核心蛋白 (NP)及基質(zhì)(M)的抗原性不同，可分為A、B、C三型，其中致病性最強(qiáng)、在世界上流行最廣的是A型流感病毒。A型流感病毒根據(jù)表面糖蛋白凝血素(HA)的不同，可以分為15個(gè)亞型， H1-H15，根據(jù)表面糖蛋白神經(jīng)氨酸酶(NA)的不同可以分為9個(gè)亞型m-N9。其中，Hmi流感病毒在變異過程中，不斷突破種屬界限，對人類生命健康帶來嚴(yán)重威脅。1918-1919年歐洲流感大流行期間造成5000多萬人死亡，病原為Hmi亞型流感病毒。1931年Shope首次從豬體內(nèi)分離鑒定了 Hmi亞型流感病毒。在1976年美國發(fā)生所謂的“新澤西”事件中，大約500人感染Hmi亞型流感病毒，該病毒與當(dāng)時(shí)從豬體內(nèi)分離到的病毒相同。2009年4月，首發(fā)于墨西哥，很快傳播到美國既而在全球流行的流行性感冒是由新的甲型Hmi流感病毒引起。此次疫情導(dǎo)致過百人感染，導(dǎo)致了大量疫情其后傳播到全世界，導(dǎo)致了人員的死亡和大量的經(jīng)濟(jì)損失。引起此次大規(guī)模流行的病毒較以往分離鑒定的病毒都發(fā)生了明顯變異，傳播速度異常迅速，帶來全球性的恐慌。2009年6月2日，加拿大西部艾伯塔省一豬場的豬身上檢測出甲型Hmi流感病毒，這是世界上首次發(fā)現(xiàn)有豬被這種新病毒感染?；驒z測發(fā)現(xiàn)，這些豬身上的病毒與在墨西哥、美國以及其他國家發(fā)現(xiàn)的當(dāng)前流行的這種病毒一致，這種新的甲型Hmi流感病毒又被稱為PH1N1-2009流感病毒。HlNl流感病毒具備跨群傳播和群間傳播兩種傳播方式。Hmi新型流感病毒原是一種于豬只中感染的疾病，屬于甲型流感病毒。秋冬季屬高發(fā)期，全年可傳播。2009年墨西哥與美國爆發(fā)的豬流感疫情，即為Hmi病毒所引起的。2009年3至4月，墨西哥爆發(fā)Hmi 疫潮，導(dǎo)致過百人感染，導(dǎo)致了大量疫情其后傳播到全世界，導(dǎo)致了人員的死亡和大量的經(jīng)濟(jì)損失。由于病毒發(fā)生了變異，以往的診斷技術(shù)對控制疾病傳播沒有任何意義，最有效的控制疫情擴(kuò)大的方式是建立快速的診斷方法。目前最常用的快捷檢測手段為實(shí)時(shí)熒光檢測方法，因此建立一種實(shí)時(shí)熒光檢測Hmi病毒的方法意義重大。由于Hmi病毒可直接感染人，導(dǎo)致人類患病或死亡，其公共衛(wèi)生意義日漸顯著。加強(qiáng)對Hmi病毒快速檢測方法的研究，在減少世界經(jīng)濟(jì)損失和提高人類衛(wèi)生健康方面，都具有深遠(yuǎn)的意義。眾所周知，基于時(shí)效性和準(zhǔn)確性上的優(yōu)勢，實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)已經(jīng)在疫病檢測的很多項(xiàng)目上逐步取代了一般RT-PCR方法，成為疫病檢測領(lǐng)域最常用的分子生物學(xué)方法， 但是到目前為止，我國尚未有同時(shí)鑒別檢測ρΗΙΝΙ-2009流感病毒一步法RT-PCR快速檢測方法研究和相關(guān)檢測試劑的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測ρΗΙΝΙ-2009流感病毒的一步法熒光RT-PCR檢測試劑盒。發(fā)明點(diǎn)在于所述試劑盒包括一對特異性引物以及一條熒光探針，通過該特異性引物、熒光探針與Hmi流感病毒RNA的特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)對ρΗΙΝΙ-2009流感病毒的快速鑒別檢測。本發(fā)明的另一目的是提供上述一步法熒光RT-PCR檢測試劑盒的檢測方法。本發(fā)明的另一目的是提供上述一步法熒光RT-PCR檢測試劑盒在鑒別檢測 ρΗΙΝΙ-2009流感病毒中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的一步法熒光RT-PCR檢測試劑盒的制備方法如下首先，合成特異性引物和熒光探針序列。本發(fā)明選擇ρΗΙΝΙ-2009流感病毒NA基因的保守序列片段為靶目標(biāo)，針對 ρΗΙΝΙ-2009流感病毒NA基因檢測的擴(kuò)增目標(biāo)片段長度為121bp，該擴(kuò)增目標(biāo)片段的序列如序列表<400>4所示。根據(jù)ρΗΙΝΙ-2009流感病毒NA基因保守序列的特點(diǎn)，應(yīng)用primer Express 3. 0軟件和DNAMar中的I^rimei^eleCT軟件設(shè)計(jì)待測引物序列；采用β -乙腈亞磷酸胺化學(xué)合成法，使用全自動DNA合成儀進(jìn)行OligoDNA的合成待測引物和探針，同時(shí)在探針5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)FAM(6-羧基熒光素)，3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)BHQ。其次，篩選特異性引物和熒光探針序列。將合成好的引物和探針分別通過特異性比較實(shí)驗(yàn)、靈敏度檢測實(shí)驗(yàn)、重復(fù)性和準(zhǔn)確度檢測實(shí)驗(yàn)；最終確定各項(xiàng)性能較優(yōu)的一對特異性引物和一條熒光探針，引物和探針序列為引物F :5，-CAACACCAACTT TGC TGC-3，(如序列表 <400>1 所示)R :5，-GGAACCGATTCT TCACTG TTGTC-3，(如序列表 <400>2 所示)探針probe:5，-FAM-CAGTCAGTGGTTCCGTGGAAATTAGC-BHQ-3，(如序列表 <400>3 所示)最后，確定反應(yīng)體系與試劑盒組成。將反應(yīng)體系設(shè)定為25yL，在一定范圍內(nèi)篩選上述特異性引物、熒光探針最佳濃度。篩選實(shí)驗(yàn)每次均采用等量模板并只設(shè)一個(gè)變量，以CT值、熒光增量和平臺期等因素為考察依據(jù)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，若結(jié)果穩(wěn)定，可確定為最佳濃度值。熒光RT-PCR檢測試劑盒的組成為本領(lǐng)域的公知常識，技術(shù)人員可根據(jù)實(shí)際需要選用。作為優(yōu)選，本發(fā)明提供的一步法熒光RT-PCR檢測試劑盒組分如下表所示
溶液A (2 X RT-PCR混合液，含引物和探針)ImL溶液B (Taq DNA聚合酶；AMV反轉(zhuǎn)錄酶)30 μ L溶液 C (DEPC-H2O)ImL陽性對照ImL陰性對照ImL上述溶液 A 包括取自 AgPath-ID One-Step RT-PCR Kit 試劑盒中的 2 X RT-PCR 混合液以及特異性引物和熒光探針，作為優(yōu)選，溶液A中12.5μ1的2XRT-PCR混合液對應(yīng)Ιμ 特異性引物(F)、lyl特異性引物(R)以及0.5μ1熒光探針，即其中的體積配比為12. 5 1 1 0. 5。上述溶液B取自AgPath-ID One-Step RT-PCR Kit試劑盒，包含Taq DNA聚合酶和AMV反轉(zhuǎn)錄酶。上述AgPath-ID One-Step RT-PCR Kit試劑盒購自ABI公司。溶液C 為 DEPC-H2O15陽性對照為流感裂解疫苗稀釋液，購自北京科興生物制品有限公司。陰性對照為SPF雞胚尿囊液，購自北京梅里亞維通公司。本發(fā)明還提供上述一步法熒光RT-PCR檢測試劑盒的檢測方法，具體步驟為(1)提取樣本RNA(2)反應(yīng)組份的配制反應(yīng)總體積為25 μ 1，向反應(yīng)管中加入下列組份
權(quán)利要求
1.一種用于檢測PH1N1-2009流感病毒的一步法熒光RT-PCR檢測試劑盒，包括溶液A， 該溶液A包括一對特異性引物及一條熒光探針，所述特異性引物和熒光探針的序列為特異性引物F :5，-CAACACCAACTT TGC TGC-3，R 5' -GGAACCGATTCT TCACTG TTGTC-3’熒光探針probe :5’-F-CAGTCAGTGGTTCCGTGGAAATTAGC-Q-3’，其中 F 為熒光報(bào)告基團(tuán)，Q為淬滅基團(tuán)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一步法熒光RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于該熒光探針5’ 端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)F為6-羧基熒光素FAM，3’端標(biāo)記的淬滅基團(tuán)Q為特丁基對苯二酚 BHQ。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一步法熒光RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于所述溶液A還包括 AgPath-ID One-Step RT-PCR Kit 試劑盒中的 2 X RT-PCR 混合液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一步法熒光RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于還包括溶液B， 該溶液B為Taq DNA聚合酶和AMV反轉(zhuǎn)錄酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一步法熒光RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于還包括溶液C， 該溶液C為DEPC-H2Otj
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一步法熒光RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于還包括陽性對照，該陽性對照為流感裂解疫苗稀釋液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一步法熒光RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于還包括陰性對照，該陰性對照為SPF雞胚尿囊液。
8.一種利用權(quán)利要求1所述的一步法熒光RT-PCR檢測試劑的檢測方法，其特征在于 實(shí)驗(yàn)步驟為(1)提取待測樣本RNA；(2)一步法將試劑盒中各組份混合配置成反應(yīng)體系進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)；(3)直接讀取檢測結(jié)果，以剛好超過正常陰性對照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)設(shè)定閾值線； CT值大于38. 0或無擴(kuò)增曲線，判斷為陰性；代表FAM的擴(kuò)增曲線CT值小于或等于35. 0，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，判斷為陽性。
9.根據(jù)權(quán)利要求10所述的檢測方法，其特征在于該待測樣本RNA的提取采用《實(shí)用分子生物學(xué)方法手冊》中的酚/氯仿核酸抽提法或采用市售RNA提取試劑盒，按試劑盒說明書操作。
10.根據(jù)權(quán)利要求10所述的檢測方法，其特征在于每次檢測均設(shè)陰性對照組、陽性對照組和樣品檢測組，各組反應(yīng)體系總體積均為25μ 1，各組份配比如下所示陽性對照組14 μ 1溶液Α、1 μ 1溶液Β、5 μ 1溶液C、5 μ 1陽性對照RNA ；陰性對照組14 μ 1溶液Α、1 μ 1溶液Β、5 μ 1溶液C、5 μ 1陰性對照RNA ；樣品檢測組14 μ 1溶液Α、1 μ 1溶液Β、5 μ 1溶液C、5 μ 1待測樣品RNA。
11.根據(jù)權(quán)利要求11所述的檢測方法，其特征在于該P(yáng)CR反應(yīng)的條件如下50°C下反應(yīng)30min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；95°C下反應(yīng)IOmin進(jìn)行預(yù)變性；然后進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)，每一輪循環(huán)反應(yīng)包括95°C反應(yīng)1 變性和55°C反應(yīng)4 退火，循環(huán)數(shù)為45。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一步法熒光RT-PCR檢測試劑盒在檢測ρΗΙΝΙ-2009流感病毒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于檢測甲型H1N1 2009流感病毒(也稱為pH1N1-2009流感病毒)的一步法熒光RT-PCR檢測試劑盒及其檢測方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供的一步法熒光RT-PCR檢測試劑盒包含一對特異性引物和一條熒光探針，該特異性引物和熒光探針根據(jù)pH1N1-2009流感病毒NA基因保守片段為靶目標(biāo)設(shè)計(jì)，檢測原理是通過熒光探針與目的RNA的特異性結(jié)合對樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)定量的鑒別檢測。本發(fā)明提供的一步法熒光RT-PCR檢測試劑盒及檢測方法可對pH1N1-2009流感病毒進(jìn)行快速鑒別檢測，操作簡便、檢測特異性高、適用廣泛。
文檔編號C12Q1/70GK102154511SQ20111006104
公開日2011年8月17日 申請日期2011年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月14日
發(fā)明者劉建利, 盧體康, 呂建強(qiáng), 孫潔, 廖立珊, 張彩虹, 曹琛福, 曾少靈, 楊俊興, 林慶燕, 秦智鋒, 花群義, 詹愛軍, 阮周曦, 陳書琨, 陳兵, 陶虹 申請人:秦智鋒