專利名稱：油菜iMyAP基因過表達(dá)在油菜抗菌核病中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用基因工程的手段使黑芥子酶協(xié)助蛋 白基因在油菜中過表達(dá)，進(jìn)而顯著提高油菜抗菌核病的方法。
背景技術(shù)：
菌核病的病原菌為菌盤菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib) de bary)，它是一種 廣譜寄生性真菌，寄主范圍廣，據(jù)Boland和Hall的統(tǒng)計(jì)，核盤菌可寄生在75個(gè)科的278年 屬中的408個(gè)種和42亞種或變種。菌盤菌也是一種重要的農(nóng)作物植物病原菌，在全球，它 每年給農(nóng)作物生產(chǎn)造成巨大損失，如嚴(yán)重影響油菜、大豆、向日葵、花生、菜豆、紅花等幾十 種農(nóng)作物特別是優(yōu)質(zhì)農(nóng)作物的生產(chǎn)。目前，在五大洲近100個(gè)國家都有發(fā)現(xiàn)或流行。到目 前為止，還沒有發(fā)現(xiàn)完全抗菌核病的抗性資源，這是被侵害作物生產(chǎn)中面臨的巨大挑戰(zhàn)。在我國，菌核病是影響油菜特別是優(yōu)質(zhì)油菜產(chǎn)量提高的重要病害。為減輕菌核病 對(duì)油菜的危害程度，人們?cè)噲D從不同的植物資源中分離出抗菌核病的有利資源。對(duì)油菜抗 菌核病的研究結(jié)果表明在核盤菌寄生的不同類型的油菜上，存在對(duì)病原菌高抗的類型，但 還沒有發(fā)現(xiàn)完全抗菌核病的免疫類型資源。由于缺乏抗菌核病免疫類型的資源，通過雜交 育種沒法獲得對(duì)菌核病具免疫類型的材料。正因?yàn)槿绱?，利用基因工程的方法培育抗菌?病油菜，在目前情況下，這是一條必由之路。2002年我們?cè)?jīng)開展用來自小麥的草酸氧化酶 轉(zhuǎn)油菜來增強(qiáng)油菜抗菌核病能力的研究；劉勝毅等報(bào)道利用轉(zhuǎn)草酸氧化酶來增強(qiáng)油菜抗菌 核病的研究(Liu et al, Plant Cell Report, 2005, 24 :133-144) 但是效果不是很明顯。 這就需要尋求新的抗菌核病的途徑。在十字花科蕓薹和白菜屬植物中，有一種特有的黑芥子酶-硫苷防御系統(tǒng) (Glucosinolate-Myrosinase system)，現(xiàn)在已知這是一種抵抗植食性昆蟲取食的有效防 御系統(tǒng)(Giamoustaris and Mithen，1995)。又名硫代葡糖苷葡糖苷酶(thioglucoside glucosidases, TGG)，其作用是催化硫苷的水解。在植物組織內(nèi)，黑芥子酶(Myrosinase， EC 3.2.3. 1)需要與黑芥子酶結(jié)合蛋白(Myrosinase-bindingprotein，MBP)和黑芥子酶 協(xié)助蛋白(Myrosinase-associated proteins, MyAP)共同形成一個(gè)黑芥子酶復(fù)合物后， 才能將硫苷水解成異硫氰酸酯、腈、惡唑烷硫酮或硫氰酸酯等多種有毒的化合物。這些有 毒化合物能起到阻止昆蟲取食的作用。MyAP是一個(gè)40kDa的單體糖蛋白，它存在種子特 異與營(yíng)養(yǎng)器官表達(dá)兩種類型種子黑芥子酶協(xié)助蛋白(ked-MyAP，sMyAP), sMyAP是一種 組成型的蛋白質(zhì)，它特異地存在于種子中，如種皮細(xì)胞；另一種是存在于營(yíng)養(yǎng)器官中，它是 在受創(chuàng)傷(wounding)的情況下，或者是在脫落酸和甲基茉莉酸誘導(dǎo)下表達(dá)的，稱為誘導(dǎo)型 MyAP(inducible MyAP, iMyAP) (Taipalensuu, et al,1997,247 :963-971 ；Andreasson, et al,1999,41 (2) :171-80)。我們研究發(fā)現(xiàn)，iMyAP不僅受創(chuàng)傷、脫落酸和甲基茉莉酸誘導(dǎo)表達(dá)，而且還受 核盤菌誘導(dǎo)表達(dá)。將iMyAP的啟動(dòng)子與⑶S(i3_葡萄糖苷酸酶)基因融合的表達(dá)框 (iMyAP:: GUS)轉(zhuǎn)到擬南芥中后，帶有iMyAP: :GUS的擬南芥噴施核盤菌的毒素草酸后，經(jīng)
3GUS染色后整個(gè)植株為藍(lán)色，說明iMyAP受核盤菌毒素誘導(dǎo)表達(dá)，見圖1。另外，還發(fā)現(xiàn)，在 油菜中有代表性的抗菌核病材料湘油15與感病材料98C40之間，受核盤菌誘導(dǎo)后iMyAP基 因的啟動(dòng)表達(dá)時(shí)間不同，抗性材料湘油15中的iMyAP基因的表達(dá)早于感病材料98C40的 iMyAP基因的表達(dá)12小時(shí)，見圖2。說明iMyAP基因的及時(shí)快速表達(dá)有利油菜提高對(duì)菌核 病病原菌產(chǎn)生抗性。為了有效獲得高抗菌核病的油菜，本申請(qǐng)采用基因工程手段，讓iMyAP基因成為 過表達(dá)的基因。這樣在沒有核盤菌侵染時(shí)，iMyAP就在油菜體內(nèi)開始表達(dá)，使油菜處于防御 系統(tǒng)觸發(fā)狀態(tài)(Priming)，對(duì)核盤菌的侵染產(chǎn)生快速反應(yīng)，及時(shí)調(diào)動(dòng)自身的防御系統(tǒng)抵抗病 菌侵染，實(shí)現(xiàn)大幅度降低核盤菌對(duì)油菜生產(chǎn)產(chǎn)生危害的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種油菜黑芥子 酶協(xié)助蛋白基因(iMyAP基因)過表達(dá)在油菜抗菌核病中的應(yīng)用，是建立一種讓原來油菜中 誘導(dǎo)表達(dá)的iMyAP基因變成過表達(dá)基因，進(jìn)而使油菜獲具有高抗菌核病的能力。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種油菜iMyAP基因在油菜 抗菌核病中的應(yīng)用，其iMyAP基因序列見SEQ ID NO. 1。含有油菜iMyAP基因的過表達(dá)載體在油菜抗菌核病中的應(yīng)用，其特點(diǎn)是所述過 表達(dá)載體是將通過高保真PCR直接從油菜基因組的DNA上克隆的iMyAP基因的完整帶內(nèi)含 子的編碼序列，或?qū)⑼ㄟ^RT-PCR技術(shù)從油菜中擴(kuò)增出的iMyAP基因的全長(zhǎng)CDS插到過表達(dá) 啟動(dòng)子的后面得到的過表達(dá)載體。一種提高油菜抗菌核病的方法，是將含有油菜iMyAP基因的過表達(dá)載體通過農(nóng)桿 菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入油菜基因組，使iMyAP基因在油菜體內(nèi)實(shí)現(xiàn)過表達(dá)，該過表達(dá)載 體是將通過高保真PCR直接從油菜基因組的DNA上克隆的iMyAP基因的完整帶內(nèi)含子的編 碼序列，或?qū)⑼ㄟ^RT-PCR技術(shù)從油菜中擴(kuò)增出的iMyAP基因的全長(zhǎng)CDS插到過表達(dá)啟動(dòng)子 的后面得到的過表達(dá)載體。從而使油菜的防御系統(tǒng)處于一個(gè)及時(shí)的觸發(fā)狀態(tài)(Priming)，一 旦菌核病的病原菌核盤菌孢子落到油菜植株的表面，能立即作出防御反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)抗菌核病 的目的。菌核病是廣譜真菌性病害，大量的育種實(shí)踐證明通過傳統(tǒng)育種方法無法培育出 對(duì)菌核病這種廣譜性真菌病害具有完全抗性的油菜品種，因?yàn)楹吮P菌的侵染先于油菜相關(guān) 防御系統(tǒng)的有效開啟，在核盤菌與油菜這兩個(gè)對(duì)手中，往往是油菜的防御系統(tǒng)先被摧毀，發(fā) 病死亡。通過基因工程的方法，有人將草酸氧化酶基因轉(zhuǎn)入到油菜中，試圖利用草酸氧化酶 能降解核盤菌侵染油菜后產(chǎn)生的毒素草酸來達(dá)到阻止病菌發(fā)生，但結(jié)果是轉(zhuǎn)草酸氧化酶基 因的油菜對(duì)菌核病抗性沒有促進(jìn)作用，因?yàn)檫@種方法實(shí)際上還是在核盤菌侵染之后，并且 是在產(chǎn)生毒素草酸之后，錯(cuò)過了防御的有效時(shí)期。本方法與其它方法有本質(zhì)的不同，它是將油菜體內(nèi)的iMyAP基因誘導(dǎo)表達(dá)的形式 改變?yōu)檫^表達(dá)的形式，使油菜的防御系統(tǒng)處于一個(gè)實(shí)時(shí)的觸發(fā)(priming)狀態(tài)，一旦有核 盤菌接觸油菜表面，就能使油菜及時(shí)產(chǎn)生防御反應(yīng)，阻止核盤菌的侵染。


圖1是菌核病核盤菌毒素草酸誘導(dǎo)iMyAP:⑶S中⑶S基因的表達(dá)(藍(lán)色)。圖2是核盤菌誘導(dǎo)后iMyAP基因在抗與感病材料中的不同啟動(dòng)表達(dá)時(shí)間。圖3是帶有iMyAP基因完整編碼序列的過表達(dá)框構(gòu)建。圖4是轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因油菜接種核盤菌的發(fā)病情況示意圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但不意味限制本發(fā)明的范圍。以煙草花葉病毒35S啟動(dòng)子(CaMV35S)與iMyAP基因的全長(zhǎng)⑶S融合形成的表達(dá) 框，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)來提高甘藍(lán)型油菜抗菌核病能力為實(shí)施例1.所用材料試劑甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)品種為湘油15號(hào)；感病品種98C40和其外植體為 子葉柄。菌株和質(zhì)粒大腸桿菌DH5a、pMD19_T載體、pHB過表達(dá)載體購自大連寶生物工程 (大連)有限公司)。農(nóng)桿菌LBA4404為湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)樓植物代謝實(shí)驗(yàn)室保存菌 種。酶和化學(xué)試劑TaqTMDNA聚合酶購自廣州東盛生物科技有限公司。高保真聚合酶 Pfu購自TaKaRa公司。限制性內(nèi)切酶、DNA T4連接試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司。 質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自長(zhǎng)沙安比奧生物技術(shù)有限公司。RT-PCR 1 ^ Fermentas ^ RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit。 pMD19_T 連接試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。瓊脂糖西班牙產(chǎn)。酵母提取物、蛋白胨購自 0X0ID.LTD。DNA Marker 購自天根生化科技(北京)有限公司。CTAB,Tris-base,EDTANa2, 卡那霉素、草丁膦及其他生化試劑均購自歐邁生物和國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。2.步驟1) iMyAP基因全長(zhǎng)⑶S克隆和過表達(dá)載體構(gòu)建iMyAP基因全長(zhǎng)CDS克隆引物設(shè)計(jì)根據(jù)網(wǎng)站 NCBI (http //www. ncbi. nlm. nih. gov/)上 GenBank 公布的 甘藍(lán)型油菜黑芥子酶協(xié)助蛋白基因12(iMyAP12)的序列(進(jìn)入號(hào)為Y10156)，采用primer primer5設(shè)計(jì)引物I^rimerl和I^rimerf，用于擴(kuò)增iMyAP基因全長(zhǎng)CDS，并根據(jù)表達(dá)載體pHB 的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，在上游和下游引物的5'端分別加上BamHI和)(baI酶切位點(diǎn)。 引物由南京金思特生物公司合成。引物序列如下Primerl 5 ‘GGATCCATGGCAACCACCTTCAGTTTAGCGA’ 3，見 SEQ ID NO. 2 ；(斜體為BamHI的識(shí)別序列)Primer2 5 ‘TCTAGACTACATAGATTCACTGGCACTGACGACA’ 3，見 SEQ ID NO. 3 ；(斜體為)(bal的識(shí)別序列)RT-PCR擴(kuò)增iMyAP基因全長(zhǎng)⑶S 以湘油15號(hào)甘藍(lán)型油菜湘油15號(hào)葉片為材料， 參照TRIZOL法提取油菜葉片總RNA。根據(jù)Fermentas公司的RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit操作步驟，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。再以cDNA為模版，采用如下反應(yīng)體系和 熱循環(huán)條件擴(kuò)增iMyAP基因全長(zhǎng)⑶S，其序列見SEQ ID NO. 1。
PCR反應(yīng)體系(30 μ L體系)緩沖液 3 μ L超純水22. 4 μ L模板2 μ LdNTP0. 8 μ L(10mM 貯液)iMyAP F/R 各 0. 5 μ L (200 μ Μ)Pfu 酶0· 8 μ L熱循環(huán)程序94°C預(yù)變性4分，94°C變性40秒，60°C退火40秒，72°C延伸90秒，循環(huán)30次后， 72°C后延伸10分鐘，16°C保存?；驍U(kuò)增儀為Biometra T型。PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖濃度為1. 5%，電壓60V，電泳時(shí)間 Ihr左右。凝膠分析系統(tǒng)拍照觀察。PCR產(chǎn)物回收參照安比奧Gel回收Kit說明進(jìn)行。PCR產(chǎn)物連接和測(cè)序分析由上述高保真Pfu聚合酶擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物，先加A尾 后，連接到PMD19-T載體上構(gòu)建pMD19-iMyAP中間載體。再將pMD19_iMyAP載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌 DH5a后，送南京金思特生物公司進(jìn)行序列測(cè)定，其序列見SEQ ID NO. 1。然后將測(cè)序結(jié)果在 美國國家信息網(wǎng)NCBI上進(jìn)行同源性比對(duì)分析，經(jīng)GenBank上Blast比對(duì)表明，該序列與NCBI 上登錄的iMyAP12基因同源性達(dá)到了 100%，說明該測(cè)序結(jié)果與已發(fā)表的序列一致。iMyAP基因過表達(dá)載體的構(gòu)建用BamHI和)(bal兩個(gè)限制性內(nèi)切酶同時(shí)用酶切pHB過表達(dá)載體和pMD19_iMyAP 載體。將兩種酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，用安比奧的膠回收試劑盒回收兩個(gè)目標(biāo)帶。 將凝膠中回收的兩個(gè)目標(biāo)帶(分別為iMyAP基因的全長(zhǎng)CDS和線性化的pHB表達(dá)載體)混 勻，通過T4連接酶16°C過夜連接。將iMyAP基因的全長(zhǎng)⑶S連接到pHB載體上的CaMV35S 啟動(dòng)子后面，構(gòu)建成pHB-iMyAP過表達(dá)載體(見圖3)。構(gòu)建好的ρΗΒ-iMyAP載體通過凍熔 法轉(zhuǎn)入到根癌農(nóng)桿菌LBA4404中，用于下一步油菜的轉(zhuǎn)化。2)甘藍(lán)型油菜的遺傳轉(zhuǎn)化選顆粒飽滿，粒形正常，無裂無霉變的感病品種98C40種子滅菌后，將種子均勻播 種于1/5MS培養(yǎng)基上，置于25°C暗室培養(yǎng)4-5天，至子葉展開。從子葉節(jié)的上方，用無菌的手 術(shù)刀切下帶柄的子葉作為轉(zhuǎn)化用外植體。外植體在攜帶pHB-iMyAP載體的農(nóng)桿菌LBA4404 溶液中浸染后，將子葉柄平放到MB (未加抗生素)培養(yǎng)基的平板中，暗室中共培養(yǎng)2-3天后 轉(zhuǎn)入到添加有10mg/L草丁膦的MB培養(yǎng)基的平板中篩選培養(yǎng)。每?jī)芍芨鼡Q一次新鮮培養(yǎng)基， 將分化出的幼苗轉(zhuǎn)移到1/2MS培養(yǎng)基上，待到長(zhǎng)出發(fā)達(dá)的根系，打開封口膜一天，再將幼苗 轉(zhuǎn)入到蛭石中練苗1 2周。之后轉(zhuǎn)入盆裝土壤中置于室外培養(yǎng)至結(jié)實(shí)成熟。3)轉(zhuǎn)基因油菜的檢測(cè)由于iMyAP基因來自油菜基因組本身，轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)需要利用pHB_iMyAP載 體上的CaMV35S序列來設(shè)計(jì)一條正向PCR檢測(cè)引物I^rimerf，另一條在iMyAP基因全長(zhǎng)⑶S 上設(shè)計(jì)一條反向PCR引物ft~imer4。PCR檢測(cè)引物序列如下Primer3 5' GGATTGATGTGATAACATGGTGGAG 3‘，見 SEQ ID NO. 4 ；Primer4 5' AACTGATGCATTGAACTTGACGAAC 3‘，見 SEQ ID NO. 5。4)菌核病抗性鑒定
取甘藍(lán)型油菜品種98C40與iMyAP過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株各種5株，在生長(zhǎng)室20°C左 右生長(zhǎng)，待植株長(zhǎng)到5片真葉時(shí)，用于接種實(shí)驗(yàn)。菌核病病原菌核盤菌先在土豆培養(yǎng)基上于
生長(zhǎng)大約2-3天，待菌絲生長(zhǎng)布滿培養(yǎng)基平皿后，用于接種實(shí)驗(yàn)。先將菌絲連同培養(yǎng)基 切成1平方厘米左右大小的菌塊，然后將菌塊反扣在葉片的上表面，每株取四片葉，每片葉 上接種一個(gè)菌塊。然后將接種的植株移入生長(zhǎng)室，并保持相對(duì)濕度大于90%。兩周后檢查 葉面病斑發(fā)生情況。3.結(jié)果利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將iMyAP基因的全長(zhǎng)⑶S導(dǎo)入到甘藍(lán)型油菜品種98C40的 基因組中，通過篩選，共獲得256株抗草丁膦植株。利用ft~imer3/ft~imer4檢測(cè)引物對(duì)進(jìn)行 的PCR檢測(cè)，其中6株有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并且擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物分子量大小與預(yù)期的分子量 相同，說明已獲得轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)基因植株當(dāng)代(TO)自交兩代后獲得T2的轉(zhuǎn)基因純合子，從T2轉(zhuǎn)基因純合子中 取5株用于接種試驗(yàn)，每株接種4個(gè)菌塊；對(duì)照98C40做同樣的處理。接種兩周后對(duì)病斑進(jìn) 行觀察，結(jié)果顯示對(duì)照98C40全部20片葉上都有病斑形成，而轉(zhuǎn)基因植株20片葉上沒有任 何病斑形成，菌塊也干枯(見圖4)。說明在油菜中過表達(dá)iMyAP基因可以有效提高油菜對(duì) 菌核病核盤菌的抵抗能力。
權(quán)利要求
1.一種油菜iMyAP基因在油菜抗菌核病中的應(yīng)用，其iMyAP基因序列見SEQ ID NO. 1。
2.含有油菜iMyAP基因的過表達(dá)載體在油菜抗菌核病中的應(yīng)用，其特征在于所述過 表達(dá)載體是將通過高保真PCR直接從油菜基因組的DNA上克隆的iMyAP基因的完整帶內(nèi)含 子的編碼序列，或?qū)⑼ㄟ^RT-PCR技術(shù)從油菜中擴(kuò)增出的iMyAP基因的全長(zhǎng)CDS插到過表達(dá) 啟動(dòng)子后面得到的過表達(dá)載體。
3.一種提高油菜抗菌核病的方法，是將含有油菜iMyAP基因的過表達(dá)載體通過農(nóng)桿菌 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入油菜基因組，使iMyAP基因在油菜體內(nèi)實(shí)現(xiàn)過表達(dá)，該過表達(dá)載體 是將通過高保真PCR直接從油菜基因組的DNA上克隆的iMyAP基因的完整帶內(nèi)含子的編碼 序列，或?qū)⑼ㄟ^通過RT-PCR技術(shù)從油菜中擴(kuò)增出的iMyAP基因的全長(zhǎng)CDS插到過表達(dá)啟動(dòng) 子后面得到的過表達(dá)載體。
全文摘要
一種油菜iMyAP基因過表達(dá)在油菜抗菌核病中的應(yīng)用，是將通過高保真PCR直接從油菜基因組的DNA上克隆的iMyAP基因的完整帶內(nèi)含子的編碼序列，或?qū)⑼ㄟ^RT-PCR技術(shù)從油菜中擴(kuò)增出的iMyAP基因的全長(zhǎng)CDS插到過表達(dá)啟動(dòng)子的后面得到過表達(dá)載體，再導(dǎo)入油菜基因組中得到轉(zhuǎn)基因油菜，使iMyAP基因在轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)過表達(dá)，使油菜處于防御系統(tǒng)觸發(fā)狀態(tài)(Priming)，實(shí)現(xiàn)油菜對(duì)菌核病產(chǎn)生高抗能力，對(duì)保護(hù)油菜穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)具有非常重要意義。
文檔編號(hào)C12N15/09GK102140446SQ20111002264
公開日2011年8月3日 申請(qǐng)日期2011年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月20日
發(fā)明者劉春林, 阮穎 申請(qǐng)人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)