一種控制油菜菌核病的基因及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種控制甘藍型油菜菌核病基因及其應用，具體涉及一種控制甘藍型油菜菌核病的基因BnWRKY33的分離克隆、功能驗證和應用。BnWRKY33基因具有控制作物菌核病的功能，在菌核病處理甘藍型油菜時BnWRKY33的表達量顯著提高。通過基因工程技術提高BnWRKY33基因的表達量能夠控制油菜菌核病，從而對提高甘藍型油菜及其他作物的菌核病抗性和產(chǎn)量具有重要的應用前景。
【專利說明】—種控制油菜菌核病的基因及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種控制油菜菌核病的基因及其應用，具體涉及一種控制甘藍型油菜菌核病的基因和含有該基因或其同源基因的載體，并涉及利用該基因或其功能類似物調(diào)控植物抗菌核病在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應用，屬于植物基因工程領域。
【背景技術】
[0002]油菜作為一種重要的油料作物，在中國的油料生產(chǎn)中占有重要的地位。我國油菜年種植面積700萬公頃(I億畝)，占全世界的1/3，居世界首位，其所產(chǎn)菜籽油占我國整個食用植物油供應的40% (沈金雄等，中國油菜生產(chǎn)及遺傳改良潛力與油菜生物柴油發(fā)展前景[J]，華中農(nóng)業(yè)大學學報，2007年，26卷6期894-899頁)。此外，菜籽油也是適宜于生產(chǎn)生物柴油，油菜已被歐美各國作為解決全球能源短缺的重要原料作物。因此油菜不僅是食用油的主要來源，也是解決全球能源短缺的重要原料作物，具有十分重要的戰(zhàn)略地位。
[0003]然而，我國的菜籽生產(chǎn)量目前僅能滿足國內(nèi)2/3的消費需求，大量依賴進口。我國2005年進口植物油600多萬噸，是世界上最大的油料進口國，隨著人口數(shù)量的增長和人民生活水平的提高，按目前的生產(chǎn)規(guī)模，缺口將會變得更大(王漢中，中國油料產(chǎn)業(yè)發(fā)展的現(xiàn)狀、問題與對策[J]，中國油料作物學報，2005年，27卷4期100-105頁)。在當前和今后相當長的時間內(nèi)，我國都將面臨食用油和化石能源短缺的嚴峻局面。
[0004]油菜菌核病(5b7<9roii/?iasclerotiorum (Lib.) de Bary)是限制我國油菜生產(chǎn)的主要因子之一。在長江中下游及東南沿海油菜主產(chǎn)區(qū)，油菜菌核病的發(fā)生率很高，產(chǎn)量損失高達50%以上；全國發(fā)生面積在7000萬畝以上，產(chǎn)量損失高達30%，嚴重時達到50-80%。目前油菜菌核病的防治方法主要是化學防治技術和抗病品種的選育，但化學防治存在防效不高、病原難以根除、花期噴藥困難以及農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染等諸多問題；常規(guī)育種因難以找到有效的抗性材料以及速度非常緩慢等缺點，也很難有效解決抗病問題。由此，對抗菌核病油菜品種進行分子改良，快速培育抗菌核病品種，是提高菜籽單位面積產(chǎn)量的重要策略。
[0005]基因工程方法是按預先設計好的目標和計劃，通過遺傳操作，在分子水平上改良品種的技術。中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所發(fā)現(xiàn)了一個植物抗病基因為基因a或基因b，將基因a或基因b修飾后對植物的抗性有顯著提高(申請?zhí)?201110048518.9，2011)。而像油菜菌核病這類在寄主植物種內(nèi)難于找到抗原的病害，基因工程方法提供了一種解決問題的途徑。
[0006] WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族是近年來研究較廣泛的一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，它存在于整個綠色植物系中，在調(diào)控植物生物脅迫反應及其相關信號轉(zhuǎn)導途徑中具有重要作用(AsaiT et al.,, MAP kinase signalling cascade in Arabidopsis innate immunity [J],Nature, 2002年，415卷6875期977-983頁)。FMTJJ轉(zhuǎn)錄因子是WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族中的重要一員，含有兩個WRKY蛋白結(jié)構(gòu)域，屬于第I類WRKY蛋白(Eulgem et al.，The WRKYsuperfamily of plant transcription factors[J], Trends Plant Sci,2000 年，5 卷 5期199-206頁)。已有研究表明轉(zhuǎn)錄因子是腐生型真菌抗性所必需的，它能夠與(T) TGACC(A / T)序列(w-box)發(fā)生特異性作用，調(diào)節(jié)啟動子中含W — box元件的調(diào)芐基因或功能基因的表達(Lippok B et al., Expression of AtWRKY33 encoding a pathogen-or PAMP-responsive WRKY transcription factor is regulated by a composite DNAmotif containing W box elements[J] ,Mol Plant Microbe Interact,2007年，20卷4期420-429頁)。中國科學院植物研究所研究發(fā)現(xiàn)，WRKY的多肽Glyma02g39870能夠調(diào)控植物中水楊酸的合成，從而增強植物的抗病性(金京波等，2012 ;申請?zhí)?201010541600.0)。擬南芥通過遞與AtMPK4形成一個復合體，當受到病原菌侵害時，AtWRKY33和AtMPK4從AtMKSl中脫離，從而引起下游一些激素相關的基因，如PRl、TOF1.2等的表達(Jin-Long Qiu et al, Arabidopsis MAP Kinase 4 regulates gene expression viatranscription factor release in the nucleus [J], EMBO Journal, 2008 年，27 卷 16 期2214 - 2221頁)。將大白菜過表達后，大白菜呈現(xiàn)出對軟腐病一定的抗性(范榮偉等，大白菜份fMTJJ基因上游調(diào)控序列的克隆及其功能研究[J]，農(nóng)業(yè)生物技術學報，2010年，18卷4期670-675頁)。而對于油菜的作用，目前還未見有文獻及專利的報道。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，菌核病對油菜脅迫處理之后，的表達顯著提高，進而，甘藍型油菜轉(zhuǎn)基因過表達植株顯著增強菌核病抗性，這一結(jié)果在增強油菜菌核病抗性和提高菜籽油產(chǎn)量上具有重要的應用前景。
[0007]
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種控制作物菌核病的基因BnWRKY33。
[0009]一種來源于油菜的基因及其核苷酸序列為SEQ ID N0.1所示。
[0010]本發(fā)明還公開了基因編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列為SEQ ID N0.2所
/Jn ο
[0011]本發(fā)明還公開了帶有BnWRKY33基因的重組載體1300-35S-WRKY33-N0S。在載體pCAMBIA1300 (購于北京鼎國昌盛生物公司)的上游EcoRI/Kpnl酶切位點處加入CaMV35S強啟動子，其下游BamHI/Hindlll酶切位點處加上CaMV Nos終止子，將其改造成載體pCAMBIA1300-35S-Nos。而重組載體 1300-35S-WRKY33-N0S 熱:X BnWRKY33_? (5' -ggtaccATGGCTGCTTCTTCCCTTC-3' ) ,BnWRKY33~R{^' -ggatccTCAAGACAAAAACGAATCAAAG-3')為引物擴增出目的基因及?腸，進而按照gateway試劑盒(Gateway? LR Clonase?II EnzymeMix , Invitrogen Corporation)操作，將目的基因克隆到 pCAMBIA1300-35S_Nos 的酶切位點 KpnI/BamHI，得到 1300-35S-WRKY33-N0S。
[0012]本發(fā)明進一步提供了所述BnWRKY33基因在提高油菜對菌核病的抗性中的應用，本發(fā)明通過過量表達該基因來達到提高甘藍型油菜對死體營養(yǎng)型病菌菌核病的抗性。具體實驗技術步驟如下:
創(chuàng)建甘藍型油菜cDNA文庫，從cDNA文庫中PCR擴增出與AtWRKY33同源的cDNA，進行測序，發(fā)現(xiàn)這個cDNA克隆為1452bp,在GenBank數(shù)據(jù)庫對其Blast核苷酸比對,發(fā)現(xiàn)這個cDNA序列與擬南芥、煙草等的轉(zhuǎn)錄因子WRKY33在核苷酸水平上有很高的同源性。為了初步探測WRKY33對菌核病侵染的反應，用核盤菌(從江蘇鎮(zhèn)江油菜中分離)接種油菜葉片，分別在接種0、12、24、36、48 h時采樣然后提取葉片總RNA，然后使用實時熒光定量PCR檢測BnWRKY33的表達量。用攜帶有1300-35S-WRKY33-N0S載體的農(nóng)桿菌以浸花法轉(zhuǎn)化甘藍型油菜，采用PCR技術鑒定出轉(zhuǎn)基因株系，通過RT -PCR技術鑒定出表達水平顯著高于非轉(zhuǎn)基因株系的過表達轉(zhuǎn)基因株系。菌核病抗病評價實驗表明，與非轉(zhuǎn)基因株系相比，BnWRKY33過表達轉(zhuǎn)基因株系顯著提高菌核病抗性。這些結(jié)果表明BnWRKY33基因在增強油菜菌核病抗性上具有重要的應用前景。
[0013]本發(fā)明的優(yōu)點:
1.本發(fā)明中所采用的從油菜CDNA文庫來克隆基因，可靠性高、速度快、效率高。
[0014]2.本發(fā)明中所采用的花粉管通道法轉(zhuǎn)化油菜，速度快、成本低、操作簡單。
[0015]3.本發(fā)明中克隆得到的基因，為其它作物抗病育種提供了新的基因源；為研究怎樣提高其它作物的菌核病抗性具有指導借鑒作用。
[0016]4.本發(fā)明所獲得的轉(zhuǎn)基因材料，為進一步培育高度菌核病抗性的油菜新品種提供新的育種材料。
[0017]5.BnWRKV33轉(zhuǎn)基因油菜植株顯著提高菌核病抗性，對油菜的生產(chǎn)具有重要意義。
[0018]^.BnVRKY33被鑒定為油菜菌核病抗性基因，對闡明BnWRKY33基因的生物學功能
有重要意義。
[0019]7.BnWRKY33這一油菜菌核病抗性基因的發(fā)現(xiàn)，為發(fā)掘和鑒定作物抗菌核病基因，并深入探討抗菌核病基因的分子作用機理，具有重要的理論指導意義；在作物抗菌核病的育種實踐、品種改良及品種推廣均具有重要的實踐指導價值。
[0020]【專利附圖】

【附圖說明】:
圖1為與其它物種WRKY33的氨基酸序列比對；其中各物種的縮寫為:Bn {Brassica 似/瓜^):甘藍型油菜；Bo ( Brassica oJeracea):花椰菜；Cr {Capsellarubella ):莽菜；AtPu_protein (Thellungi el la halophila unnamed protein):小鹽芥；AtPu—protein (.Arabidopsis thaliana putative WRKY33):擬南芥；A1 (.Arabidopsis深山南介；RcTF(TPicizw1S communis transcription factor):蓖麻；Jc?/rcM):桐油樹。黑色區(qū)域顯示的為相同的氨基酸，灰色區(qū)域顯示的為類似的氨基酸，WRKYGQK為WRKY結(jié)構(gòu)域，用方框標出。
[0021 ] 圖2為BnWRKY33對核盤菌侵染的反應。
[0022]圖3 為 BnWRKY33 表達載體 1300-35S-WRKY33-N0S 構(gòu)建示意圖；
圖4為油菜轉(zhuǎn)基因株系的鑒定；“正”為1300-35S-WRKY33-N0S載體的PCR陽性對照。#1到#20分別為20個轉(zhuǎn)基因株系。“負”為非轉(zhuǎn)基因野生型對照。
[0023]圖5為RT-PCR檢測轉(zhuǎn)基因過表達株系與非轉(zhuǎn)基因野生型株系中表達水平的比較；WT為非轉(zhuǎn)基因野生型對照；#6、#8、#10為獨立的轉(zhuǎn)基因株系。
[0024]圖6為過表達轉(zhuǎn)基因株系與非轉(zhuǎn)基因野生型株系的菌核病抗性比較；WT為非轉(zhuǎn)基因野生型對照；#8為轉(zhuǎn)基因株系。
[0025]圖7為過表達轉(zhuǎn)基因株系與非轉(zhuǎn)基因野生型株系菌核病病斑擴展的比較；WT為非轉(zhuǎn)基因野生型對照；#6、#8、#10為獨立的轉(zhuǎn)基因株系。
【具體實施方式】
[0026] 實施例1: BnWRKY33基因的分離克隆(I)BnWRKY33基因的分離和克隆
以甘藍型油菜的中雙9號品種作為實驗材料，生長條件為:溫度為20 土 2° C;濕度為60-90% ;每天光周期為光照8 h黑暗16 h ;光照強度為44 μ mo I m_2 s — 1。
[0027]油菜葉片總RNA的提取和cDNA的合成采用UNIQ- 10柱式Trizol試劑盒(購于上海英俊生物技術有限公司)，使用DNase I (寶生物工程(大連)有限公司)除去總RNA中混有的少量DNA，最后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。cDNA的合成按照MMLV反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(普洛麥格(北京)生物技術有限公司)的操作說明進行，引物用50μ mol/L Oligo (dT) 18 (Thermo Fisher Scientific)。然后使用引物(5'-ATGGCTGCTTCTTCCCTTC-3')和及(5' - TCAAGACAAAAACGAATCAAAG-3')來擴增目的條帶，然后將PCR產(chǎn)物克隆進pMD18-T載體(寶生物工程(大連)有限公司)。目的片段的回收、連接與轉(zhuǎn)化參照UNIQ- 10柱式DNA膠回收試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)進行操作。目的片段與T載體的連接體系為:4.6 UL目的片段、0.4 ULPMD-18T載體、5 μ L Solution I (寶生物工程(大連)有限公司)在16°C下連接過夜。將其送到生工生物工程(上海)股份有限公司測序。
[0028]基因序列結(jié)構(gòu)分析
經(jīng)測序，發(fā)現(xiàn)這個基因的核苷酸序列長為1452bp，含有一個全長的開放閱讀框，使用ClustalX (Thompson et al., 1997 )程序進行多種氨基酸序列的比對發(fā)現(xiàn),這個目的條帶與擬南芥、花椰菜、薺菜、小鹽芥、深山南介、蓖麻和桐油樹的WRKY33在氨基酸水平上有很高的同源性(圖1)。因此，這個基因被命名為將其提交到GenBank，登錄號為KF712488。BnWRKY33含有兩個WRKY結(jié)構(gòu)域，其上攜帶有各自的CXt5CX22I3HX1H的鋅指結(jié)構(gòu)，屬于 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族的 I 類(Eulgem et al., The WRKY superfamily of planttranscription factors [J], Trends Plant Sci, 2000 年，5 卷 5 期 199-206 頁)。比對發(fā)現(xiàn)，這些序列在C末端的WRKY結(jié)構(gòu)域保守位點都具有與蛋白互作相關的關鍵殘基天冬氨酸(Cheng et al., Structural and Functional Analysis of VQ Motif-ContainingProteins in Arabidopsis as Interacting Proteins of WRKY Transcription Factors[J], Plant Physiology, 2012年，159卷2期810-825頁)。同時，在相對保守的N-末端，都含有4-5個絲氨酸-脯氨酸殘基位點，其可能為潛在的MAP激酶磷酸化位點(Shairockset al., Docking domains and substrate-specificity determination for MAPkinases [J], Trends Biochem Sci, 2000 年，25 卷 9 期 448-453 頁)。通過軟件 PSORT II預測發(fā)現(xiàn)，這些蛋白序列中含有高度保守的核定位信號。
[0029]實施例2:對核盤菌的反應
(I)核盤菌的處理
對油菜幼苗(四葉一心期時)第三葉進行菌核病病原菌核盤菌的接種處理，處理前將植株進行23°C恒溫培養(yǎng)4~5天，然后葉片置于黑暗環(huán)境保濕24 h。然后用核盤菌的菌絲塊進行接種，對照接以無菌培養(yǎng)基塊。分別在接種后O h、12 h、24 h、36 h、48 h采樣。
[0030](2)甘藍型油菜RNA的提取
利用植物Trizol (上海英俊生物技術有限公司)試劑抽提其總RNA。
[0031](3)實時定量PCR
突光定量 PCR 使用 SYBR? Green Realtime PCR Master Mix - Plus -試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)，采用漢 napusUBC21 (ubiquitin-conjugating enzyme 21)作為內(nèi)標基因，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。UBC21的引物是F:5’ -CCTCTGCAGCCTCCTCAAGT-3 ’和 5Λ - CATATCTCCCCTGTCTTGAAATGC-3'，BnVRKY33 基因的引物序列:5Λ- AGAGGACGGTTACAACTGGAGAAA-3^ and 5^- TGTCGGACAGCTTGGGAAAG- 3Λ。熒光定量反應體系為20 μι:含有SYBR Mix 10 μL，正反向引物(10 Mmol/L)各0.8 μL，模板2 μL和DEPC處理過的無菌水。擴增條件為:95°C，30sec ;然后95°C 5s,60°C 30 s，72°C 27s，40個循環(huán)；每個循環(huán)于72°C復性末端進行熒光檢測。反應結(jié)束后先加熱到95°C，然后降至720C，再緩慢升溫至95°C，記錄熒光信號的變化，得出擴增產(chǎn)物的熔解曲線。每組實驗均完成三個生物學重復,每個生物學重復至少做三次技術重復。檢測分別在油菜核盤菌誘導的葉片0-48 h的動態(tài)表達變化。
[0032]首先以溶解曲線為標準，利用ABI (美國應用生物系統(tǒng)公司)型號為QPCR7300儀所自帶的軟件7300 System-SDSS hell，優(yōu)化內(nèi)標基因和目的基因PCR反應條件，使之擴增產(chǎn)物特異。本實驗以油菜BnUBC21為內(nèi)標基因，分別測定BnUBC21和目的基因的Ct值，取其平均值，用比較Ct法得到目的基因?qū)?nèi)標基因的DCt，然后以水處理的葉片為參照(即將其值轉(zhuǎn)換成I)分別獲得其它處理的DDCt，最后通過2-DDCt估算目的基因的相對表達值，并且求出系統(tǒng)誤差。[0033]結(jié)果顯示，當核盤菌侵染24h樹,BnWRKY33的轉(zhuǎn)錄水平升高9.1倍，當核盤菌侵染48h樹,BnWRKY33的表達量相較于未接種核盤菌菌株提高11倍(圖2)。說明油菜
對核盤菌的侵染有顯著的響應。
[0034]實施例3:過表達轉(zhuǎn)基因油菜植株的獲得
(I)植物表達載體構(gòu)建
設計引 物 5 ' -gaattcTTAATTAAGAGCTCGCATGCC-3 ' 和5 ' -ggtaccGTCCCCGTGTTCTCTCCAA-3 '，采用PCR的手段從pEGAD載體(購于寶生物工程(大連)有限公司)中擴增得到CaMV 35S片段，然后將其連接到pCAMBIA1300載體(購于北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)的EcoRI/Kpnl酶切位點；同時設計引物5'-ggatccGAATTTCCCCGATCGTTCAA ' -3 '和 5 ' -aagcttGATCTAGTAACATAGATGACACCGC-3 '，用PCR從pEGAD載體中擴增得到CaMV Nos片段，將其連接到pCAMBIA1300載體的Bamm/NindlII 酶切位點，則得到 pCAMBIA1300-35S_Nos 載體。所用內(nèi)切酶 EcoR1、KpnI^afflHI及均購于寶生物工程(大連)有限公司，酶切條件為37°C靜置12h。接著設計引物 5' -ggtaccATGGCTGCTTCTTCCCTTC-3 '和5' -ggatccTCAAGACAAAAACGAATCAAAG-3'，以甘藍型油菜cDNA為模板進行PCR擴增，得到所需的長為1473kb的目的片斷，將其連接到pCAMBIA1300-35S-Nos的KpnI/BamHI酶切位點上，反應體系為:1.KpnI I ul,10*Hbufferlul, DNA Iul (2ug)，ddH20 7ul ；I1.BamHI I ul,10*Kbufferlul, DNA Iul(2ug)，ddH20 7ul，將其置于37°C靜置12h。從而創(chuàng)建到甘藍型油菜轉(zhuǎn)基因過量表達載體1300-35S-WRKY33-N0S，在其T-DNA區(qū)內(nèi)含有抗潮霉素的篩選標記，過量表達的啟動子為35s啟動子(圖3)。
[0035](2)油菜的遺傳轉(zhuǎn)化
將1300-35S-WRKY33-N0S轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，浸染油菜花三次，每次五分鐘。浸染步驟
為:(I)在含有相應抗生素的LB液體培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101，然后按10%的比例接入含有相應抗生素的LB液體培養(yǎng)基的三角瓶使農(nóng)桿菌培養(yǎng)液終濃度為0D600約為2.0左右。
[0036](2)在培養(yǎng)基內(nèi)加入轉(zhuǎn)化緩沖液:
0.1%Silwet-77
2ng/L6-BA
8mg/L乙酰丁香酮
(3)把油菜的整個未開的花蕾部分浸泡在農(nóng)桿菌溶液中3-5min，同時輕輕搖動使花蕾充分接觸農(nóng)桿菌液。把浸泡過的花蕾套入羊皮紙袋24h，以保持花蕾具有較高的濕度，避免花蕾在過量的陽光中暴曬，防止農(nóng)桿菌失去活性。
[0037](4)隔一天重復步驟(3)，并把整個花蕾套在羊皮紙袋中48h。
[0038](5)浸花結(jié)束后，去掉花序上的羊皮紙袋，剪切新生出的側(cè)枝花序以及經(jīng)過浸花的花序其頂端新萌發(fā)的花蕾，并利用彩色絲線對浸染過農(nóng)桿菌的花序進行系線標記，不同重組質(zhì)粒的構(gòu)建進行標簽標記。
[0039](6)正常的澆灌培養(yǎng)植株，并定時剪除新生的側(cè)枝花序以及新生花蕾，直到種子成熟時停止灌溉。收獲干種子。通過重組質(zhì)粒上攜帶的選擇標記進行轉(zhuǎn)化子的篩選。通過此方法篩選出大量的轉(zhuǎn)基因植株。
[0040](3)轉(zhuǎn)基因植株鑒定
收獲的種子出苗以后先用25mg/L的潮霉素篩選，選取抗潮霉素的植株，提取基因組，用 PCR 進行鑒定，所用的引物為 5’ -CTTCGCAAGACCCTTCCTC-3’ 和 5’ -ggatccTCAAGACAAAAACGAATCAAAG-3’。對照為野生型非轉(zhuǎn)基因植株(WT)。
[0041]檢測結(jié)果表明(圖4)，陽性對照和#1-#2，#4-#9，#11-#15，#17_#20這17個轉(zhuǎn)化植株均能夠擴增出預期大小的電泳條帶(1021bp)，而陰性對照則沒有電泳條帶，表明轉(zhuǎn)基因油菜基因組中已經(jīng)含有外源基因DNA片段。
[0042](4)邊mkBnWRKY33轉(zhuǎn)基因油菜的RT-PCR鑒定
為了確定在油菜中是否過量表達，采樣RT-PCR方法進行分析，BnWRKY33的擴增引物為 5’ AGAGGACGGTTACAACTGGAGAAA 3’ 和 5’ TGTCGGACAGCTTGGGAAAG3’，內(nèi)參基因為 UBC21，其擴增引物 5’ - CCTCTGCAGCCTCCTCAAGT -3’ 和 5’ -CATATCTCCCCTGTCTTGAAATGC-3’，上海生工合成。PCR程序:95°C預變性30S，然后經(jīng)40個循環(huán)(95°C 10s、57°C 10s、72°C 26s)。
[0043]如圖所示，#6、#8、#10株系的表達水平顯著高于非轉(zhuǎn)基因的野生型對照，表明#6、#8、#10株系為三個獨立的過表達轉(zhuǎn)基因株系。
[0044]實施例4 MRKY33過表達轉(zhuǎn)基因油菜抗菌核病的評價
取上述PCR檢測為陽性的四葉一心期的轉(zhuǎn)他腸光7幻陽性植株的第四片真葉進行離體接種。葉片剪下置于白瓷盤中，每個轉(zhuǎn)基因植株葉片與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ詹⑴胖糜谝粋€盤中，葉片下鋪一層濕紗布，取新鮮制備的Φ5πιπι菌絲塊，有菌絲的面朝下，接種于葉片中部稍稍偏離主脈的位置，每葉接種兩個菌絲塊。用透氣膜蒙上盤口利于保濕，然后置22°C黑暗培養(yǎng)。
[0045]菌絲培養(yǎng)后12 h 開始觀察記錄菌絲的發(fā)生情況，培養(yǎng)后24 h開始觀測記錄菌斑生長量，每隔24 h一次，直至菌絲長到離體葉邊緣為止。[0046]離體葉片接種鑒定結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株明顯增強菌核病抗性。如圖6和圖7所示，核盤菌病斑在BnWRKY33過表達轉(zhuǎn)基因株系中的生長面積要比非轉(zhuǎn)基因株系中小很多，損傷組織的面積也要小。根據(jù)核盤菌的生長面積可以發(fā)現(xiàn)，軟腐壞死發(fā)生在核盤菌接種24h后，且在36-48 h期間生長迅速，在48 h時其生長面積達到最大。#6，#8和#10這三個獨立株系一直保持相同的趨勢，且對核盤菌的抗性表型相同。在接種48小時時，BnWRKY33轉(zhuǎn)基因植株#6，#8和#10葉片病斑僅為野生型對照的一半。在病菌的擴散速度方面，可以發(fā)現(xiàn)過表達轉(zhuǎn)基因株系的擴散速度要明顯緩于非轉(zhuǎn)基因株系中病斑的擴散速度，在油菜中BnWRKY33具有提高菌核病抗性的作用。
【權利要求】
1.一種控制油菜菌核病的基因，其序列為SEQ ID N0.1所示核苷酸序列。
2.一種控制油菜菌核病的基因編碼的蛋白質(zhì)，其序列為SEQ ID N0.2所示氨基酸序列。
3.一種重組載體1300-35S-WRKY33-N0S，它含有權利要求1所述的核苷酸序列。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種控制油菜菌核病的基因，其特征在于，該基因在控制油菜菌核病 中的應用。
【文檔編號】A01H5/00GK103911384SQ201410026575
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年1月21日 優(yōu)先權日:2014年1月21日
【發(fā)明者】王政, 方和娣, 譚小力, 陳克平, 張志燕, 陳宇, 李冠英, 顧守來 申請人:江蘇大學