專利名稱：一株防治菌核病的生防菌盾殼霉zs-1sb及制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株具有菌核病生防潛能的盾殼霉菌株及半敞開(kāi)式固體發(fā) 酵的培養(yǎng)方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
核盤(pán)菌[5Wero""/asc7er"/or咖(Lib.) de Bary]可以侵染64科540多種植物，包括油菜、大豆、 向曰葵等主要的油料作物和萵苣、大白菜、芹菜、胡蘿卜等重要的蔬菜作物，在世界范圍內(nèi)引起多種植物 的菌核病。由于迄今為止沒(méi)有發(fā)現(xiàn)對(duì)其具有明顯抗病性的種植資源，沒(méi)有抗病品種可以利用，由其引致的 菌核病仍然是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中世界性的難題。目前多采用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行控制，如于油菜開(kāi)花盛期噴施化學(xué)農(nóng)藥 "菌核凈"或"多菌靈"可在一定程度上緩解該病的危害，獲得較為理想的效果。由于菌核病多發(fā)生、流 行于油菜生長(zhǎng)的中后期，需要有特定的農(nóng)藥劑量和勞動(dòng)強(qiáng)度才能使農(nóng)藥抵達(dá)受害部位(油菜的莖部和枝 條)；并且另一個(gè)不容忽視的問(wèn)題是核盤(pán)菌的抗藥性，長(zhǎng)期大面積使用單一性質(zhì)的農(nóng)藥存在極高的風(fēng)險(xiǎn)。 早在1997年，就有學(xué)者發(fā)現(xiàn)江蘇省通州地區(qū)某些田塊的抗"多菌靈"菌株出現(xiàn)頻率高達(dá)100%。同時(shí)需要 關(guān)注的是食品安全和環(huán)境污染問(wèn)題，食品安全問(wèn)題往往是國(guó)際農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易壁壘中的籌碼，要參與國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)， 也必需貫徹綠色植保。因此，農(nóng)藥防治應(yīng)十分慎重，生產(chǎn)上急切需要建立安全持久的防控技術(shù)體系。利用 有益真菌防治植物真菌病害是安全持久的防控技術(shù)體系的重要組成部分。
盾殼霉(Cb/^o^m'Mz 則V Ws/7S)無(wú)性階段屬于腔孢綱，是植物病原真菌核盤(pán)菌的重寄生真菌，也 是菌核病的重要生防真菌，可以寄生和破壞核盤(pán)菌的菌絲和菌核。盾殼霉首次由美國(guó)學(xué)者Campbell (1947) 描述和命名，Whi卯s和Gerlagh (1992)對(duì)它的生物學(xué)特性及防病潛能給予了論述。盾殼霉的分生孢子可 以添加到土壤或噴施于作物地上部分用來(lái)控制多種作物的菌核病(Jones et al, 2003; Li et al, 2006)。 申請(qǐng)人:在前期研究中發(fā)現(xiàn)盾殼霉一些菌株可以形成分生孢子器，產(chǎn)生大量的分生孢子(Cheng et al, 2003)， 多年的大田試驗(yàn)示范表明具有良好的防病效果，并且盾殼霉對(duì)植物沒(méi)有致病能力，對(duì)人畜沒(méi)有毒害作用。
與其它生防真菌類似，盾殼霉的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用受到規(guī)?；a(chǎn)的限制，目前高效生產(chǎn)盾殼霉的分生孢子 是商業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的篩選一株選擇對(duì)核盤(pán)菌(5b/ero"/7ia sc7ero"Vjia)引起的菌核病具有顯著生物防治 效果的真菌菌株，并通過(guò)簡(jiǎn)便、易行的半敞開(kāi)式固體發(fā)酵培養(yǎng)方法進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)，將其開(kāi)發(fā)為多種作物 菌核病的生物防治的微生物菌劑。
本發(fā)明自湖北省竹山縣蔬菜種植菜園土壤中分離、篩選得到一株對(duì)核盤(pán)菌菌核具有極強(qiáng)寄生作用的盾 殼霉菌株ZS-1SB，申請(qǐng)人將其命名為盾殼霉(Co/7iot/u^/u/z/;s/77/^"s) ZS-1SB，該菌株已于2009年5月 31日送交用于專利程序的位于湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的國(guó)際生物材料樣品保藏機(jī)構(gòu)--中國(guó)典型培養(yǎng)物 保藏中心(英文簡(jiǎn)稱CCTCC)，其保藏編號(hào)為CCTCC N0: M209U4。
實(shí)施例的研究表明，本發(fā)明篩選的盾殼霉ZS-1SB菌株對(duì)植物病原真菌核盤(pán)菌和植物病原細(xì)菌水稻白 葉枯病菌(Ja""OTO/ as oirzae pv. wyzae)具有較強(qiáng)的拮抗作用，可作為對(duì)菌核病具有生防功能的微生 物菌劑。
盾殼霉ZS-1SB的菌學(xué)特征
分生孢子黑褐色、橢球形、表面不平，大小為3.5-4.7umX5.3-8.8ym (平均3.9X6.4um),取幼 嫩(白色小點(diǎn))的分生孢子器壓片可見(jiàn)成排排列的基部寬闊的產(chǎn)孢細(xì)胞。在PDA平板上，菌絲初期無(wú)色，
3氣生菌絲不發(fā)達(dá)，菌絲一邊擴(kuò)展，菌落表面一邊形成白色分生孢子器，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌落逐漸變褐， 孢子器吐出黑色水滴即溢出分生孢子。盾殼霉的菌絲在10-28'C范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為20'C， 最高溫度為30'C，盾殼霉在pH2-11的環(huán)境中均能生長(zhǎng)，pH3-4最適宜于其生長(zhǎng)。在pH4的PDA平板上菌 落日擴(kuò)展0.7 cm。
本發(fā)明還涉及提供了生產(chǎn)所述的盾殼霉ZS-1SB菌劑的半敞開(kāi)式固體發(fā)酵的規(guī)?；囵B(yǎng)方法。該方法 采用干燕麥片和米糠為材料，以蒸籠為發(fā)酵容器，實(shí)現(xiàn)了盾殼霉的規(guī)?；a(chǎn)，其工藝簡(jiǎn)便易行。 本發(fā)明具有下列特點(diǎn)
1、 本發(fā)明篩選的盾殼霉菌株ZS-1SB可以明顯拮抗水稻白葉枯病菌、寄生核盤(pán)菌菌核，具有廣泛的潛 在開(kāi)發(fā)價(jià)值；
2、 采用上述盾殼霉菌株可以有效的防治油菜菌核病。油菜始花期施用一次(10'°孢子/畝)、始花期施 用一次(10"孢子/畝)，防治效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于多菌靈；
3、 采用上述盾殼霉半敞開(kāi)式固體發(fā)酵的培養(yǎng)方法，培養(yǎng)料配方中，燕麥片和米糠材料廉價(jià)、易得，固 體培養(yǎng)料疏松，通透性好，可以使產(chǎn)孢量達(dá)到1.5X10"孢子/g干培養(yǎng)料；
4、 采用上述盾殼霉半敞開(kāi)式固體發(fā)酵的培養(yǎng)方法，設(shè)備簡(jiǎn)單，只需蒸籠、火爐和能控溫的培養(yǎng)室即可 滿足生產(chǎn)的需要，無(wú)需其他固體發(fā)酵方法所需的高壓滅菌設(shè)備和固態(tài)反應(yīng)器等專用設(shè)備。因此大大降低了 生產(chǎn)成本，適宜于盾殼霉的規(guī)?；a(chǎn)。
5、 采用上述盾殼霉半敞開(kāi)式固體發(fā)酵的培養(yǎng)方法，通過(guò)2(TC和16'C變溫發(fā)酵的措施，可以很好的控 制常見(jiàn)雜菌如根霉菌(ittizo/ws sp.)、曲霉菌Cispei^iL ws sp.)等的污染。


圖l:顯示本發(fā)明篩選的盾殼霉ZS-1SB菌株對(duì)水稻白葉枯病菌的拮抗作用。
圖2:是本發(fā)明實(shí)施例的盾殼霉ZS-1SB菌劑半敞開(kāi)式固體發(fā)酵情況。圖2A是本發(fā)明設(shè)計(jì)的半敞開(kāi)式 固體培養(yǎng)方式示意；圖2B和圖2C是培養(yǎng)終期形成的含有盾殼霉ZS-1SB菌劑的培養(yǎng)物。 圖3:是盾殼霉ZS-1SB菌株寄生和致腐核盤(pán)菌菌核情況。
具體實(shí)施例方式
在下面的實(shí)施例中，申請(qǐng)人在室內(nèi)驗(yàn)證了盾殼霉菌株ZS-1SB對(duì)水稻白葉枯病菌的拮抗作用，對(duì)該菌 株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)、培養(yǎng)物寄生、致腐核盤(pán)菌菌核的活性等進(jìn)行系統(tǒng)驗(yàn)證試驗(yàn)，同時(shí)將制備的微生物菌劑進(jìn) 行油菜菌核病的田間防治試驗(yàn)，以確定其對(duì)菌核病的控制作用；
實(shí)施例l
1、 盾殼霉ZS-1SB菌株的分離篩選
分離與鑒定從中國(guó)湖北省竹山縣蔬菜種植園土壤中分離、篩選得到一株對(duì)核盤(pán)菌菌核具有極強(qiáng)寄
生作用的盾殼霉菌株，申請(qǐng)人將其命名為盾殼霉(Ow/o^K/7'咖肌V 2'te/ s) ZS-1SB，試驗(yàn)表明本發(fā)明分 離的ZS-1SB菌株對(duì)核盤(pán)菌(i: sc化ro"咖)的菌絲生長(zhǎng)和水稻主要病原細(xì)菌a朋t力OTO朋s wyzae pv. oiTzae)具有較強(qiáng)的拮抗作用，可以作為油菜菌核病的防治的微生物菌劑的候選菌株。
本發(fā)明的盾殼霉ZS-lSB分離和篩選采用核盤(pán)菌菌核誘捕法(Ad細(xì)es等，1980)和稀釋平板方法，菌種 鑒定工作參照魏景超，《真菌鑒定手冊(cè)》上海科學(xué)技術(shù)出版社，1979版介紹的方法。
2、 菌株保藏本發(fā)明的盾殼霉菌株ZS-1SB菌株的保藏，按周德慶主編，《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊(cè)》， 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1986版介紹的方法操作。
3、 試驗(yàn)和對(duì)照菌株的制備
本實(shí)施例以本申請(qǐng)人篩選的盾殼霉ZS-1SB菌株為試驗(yàn)菌株，將報(bào)道的水稻白葉枯病菌086(成國(guó)英等，水稻白葉枯病菌單細(xì)胞系毒力分化研究.植物病理學(xué)報(bào)，2002， 32: 227-234)作為對(duì)照。供試的盾殼霉 ZS-1SB的活化條件是20。C PDA培養(yǎng)基(配方馬鈴薯200g,葡萄糖20g，瓊脂10g,補(bǔ)充蒸餾水至1000ml， 調(diào)pH至7. 0，在121'C高壓蒸汽滅菌30min)平板上活化培養(yǎng)2d。
水稻白葉枯病菌菌株086的活化條件是28'C下將水稻白葉枯病菌086接種至馬鈴薯固體培養(yǎng)基(配 方馬鈴薯300g， Ca(N0a)2 4H20 0. 5g, Na臭 12H20 2. 0g,蛋白胨5. 0g,蔗糖15. 0g, 17%的瓊脂， 加水至1000ml，調(diào)pH至6.8-7.0,在121'C高壓蒸汽滅菌30min，下同)劃線培養(yǎng)2d,挑取水稻白葉枯病 菌086單菌落，接種至水稻白葉枯病菌液體培養(yǎng)基(配方馬鈴薯300g，Ca(N03)2 4H20 0. 5g，Na2HP04 12H20 2.0g,蛋白胨5.0g，蔗糖15.0g，加水至1000ml,調(diào)pH至6.8-7.0,在121'C高壓蒸汽滅菌30min)中， 于28。C, 200r/min振蕩培養(yǎng)36h，使測(cè)定OD6oo值至2. 0。 4、實(shí)驗(yàn)方法
取上述水稻白葉枯病菌086菌液1. 3ml (使0D6。。=2. 0)和水稻白葉枯病菌固體培養(yǎng)基60ml (成分同前) 混勻，迅速倒入直徑150 mm的培養(yǎng)皿中，取盾殼霉ZS-1SB菌絲塊(直徑5mm)置于培養(yǎng)皿中央，于28°C 下培養(yǎng)3d后觀察盾殼霉ZS-1SB對(duì)水稻白葉枯病菌的拮抗活性。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，表明本發(fā)明的盾殼霉ZS-1SB對(duì)水稻白葉枯病菌086 (見(jiàn)圖l)具有明顯的拮抗作用。
實(shí)施例2:盾殼霉ZS-1SB菌劑的半敞開(kāi)式固體發(fā)酵培養(yǎng)
1、 盾殼霉ZS-1SB孢子懸浮液制備將盾殼霉ZS-1SB菌株置于PDA培養(yǎng)基(配方參同)斜面上，于 2(TC條件下培養(yǎng)7 d。用無(wú)菌水沖洗斜面，調(diào)至分生孢子懸浮液為1(f孢子/ml。
2、 盾殼霉ZS-1SB的擴(kuò)繁培養(yǎng)將步驟l的盾殼霉ZS-1SB的分生孢子懸浮液以質(zhì)量比為1: 100接種 于PDB培養(yǎng)基(配方馬鈴薯200g，葡萄糖20g,補(bǔ)充蒸餾水至1000ml，調(diào)pH至7.0)，將所述的PDB培 養(yǎng)基分裝入三角瓶(每瓶裝100ml/250ml)中，在150 r/min， 20。C條件下振蕩培養(yǎng)24 h，得到盾殼霉ZS-1 SB菌液，備用。
3、 盾殼霉ZS-1SB菌劑半敞開(kāi)式固體發(fā)酵培養(yǎng)將干培養(yǎng)料(含水量一般不超過(guò)8%)燕麥片(商購(gòu)) 和米糠(商購(gòu))以體積比為3: l混勻加入適量水浸漲后，裝入內(nèi)徑為49mm、高度為20. 5 irnn的家用蒸籠， 加蓋后，旺火常壓蒸汽滅菌2 h。冷卻后，加入滅菌蒸餾水調(diào)節(jié)所述的干培養(yǎng)料最終含水量至70%。在培 養(yǎng)室內(nèi)，將步驟2所述的盾殼霉ZS-1SB菌液以每公斤干培養(yǎng)料添加100 ml的比例接種于培養(yǎng)料，平鋪 于蒸籠，使培養(yǎng)料的厚度為5 mm，加蓋，置于2CTC培養(yǎng)室培養(yǎng)48 h，然后半敞開(kāi)蒸籠蓋(見(jiàn)圖2A)，于 16'C條件下繼續(xù)培養(yǎng)7 d。經(jīng)檢測(cè)本實(shí)施例的盾殼霉ZS-1SB菌劑含孢子數(shù)可達(dá)1. 5X 1(T孢子/g干培養(yǎng) 料(見(jiàn)圖2B和圖2)。
實(shí)施例3:盾殼霉ZS-1SB菌株寄生、致腐核盤(pán)菌菌核的活性試驗(yàn)
1、 核盤(pán)菌菌核及制備將報(bào)道的核盤(pán)菌菌株(5Wero"V^a sc/aro"咖)Ep-1PNA367 (Huiquan Liu， Yanping Fu， Daohong Ji肌g， Guoqing Li， Jun Xie, Youliang Peng, Xianhong Yi, and Said A- Ghabrial. A Novel Mycovirus That Is Related to the Human Pathogen Hepatitis E Virus and Rubi-Like Viruses. JOURNAL OF VIROLOGY, Feb. 2009, 1981 - 1991)作為對(duì)照，將核盤(pán)菌菌株Ep_lPNA367接種于胡蘿卜培 養(yǎng)基(將胡蘿卜切成條狀，12rC滅菌30min)的三角瓶中，20。C培養(yǎng)60 d獲得成熟的菌核。
2、 盾殼霉ZS-1SB的制備取實(shí)施例2中ZS-1SB的發(fā)酵培養(yǎng)終期含菌劑的培養(yǎng)物適量，加自來(lái)水后反 復(fù)搓洗，洗出盾殼霉的分生孢子液，在3000r/min離心5min,棄上清，以自來(lái)水重懸分生孢子沉淀，并 調(diào)整至盾殼霉ZS-1SB的分生孢子濃度為107ml。
3、 試驗(yàn)方法取過(guò)篩河沙，自來(lái)水清洗后，裝入三角瓶中于121'C下高壓蒸汽下滅菌2h,倒入滅菌的
5培養(yǎng)皿中，加適量無(wú)菌水至沙潮濕，然后分別取大小均勻一致的純培養(yǎng)核盤(pán)菌菌核，用70%乙醇消毒后， 無(wú)菌水沖洗3次，在盾殼霉ZS-1SB的分生孢子液(107ml)中浸泡30 min,然后將該菌核取出半浸入裝 有滅菌細(xì)沙的培養(yǎng)皿中，每皿沙盤(pán)中放菌核20粒，設(shè)5個(gè)重復(fù)，在20"C下培養(yǎng)。記錄盾殼霉ZS-1SB對(duì)該 核盤(pán)菌菌核的寄生致腐程度。核盤(pán)菌菌核腐爛程度分級(jí)如下0級(jí)，菌核表面無(wú)盾殼霉菌絲；1級(jí)，菌核 表面有盾殼霉菌絲，但無(wú)白色的分生孢子器原基；2級(jí)，菌核表面有分生孢子器原基，但表層不腐爛；3 級(jí)，菌核表層腐爛、內(nèi)部變色變軟；4級(jí)，整個(gè)菌核糜爛。
4、試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)檢測(cè)100粒核盤(pán)菌菌核均發(fā)生腐爛，腐爛程度評(píng)定為4級(jí)，在腐爛的核盤(pán)菌菌核上可 明顯見(jiàn)到盾殼霉ZS-1SB的黑色分生孢子器(見(jiàn)圖3)。
實(shí)施例4:利用盾殼霉ZS-1SB菌劑防治油菜菌核病的田間試驗(yàn)
為了驗(yàn)證本發(fā)明生產(chǎn)的盾殼霉ZS-1SB菌劑的防病效果，申請(qǐng)人選擇湖北省宜昌市、江西省都昌縣和 江西省彭澤縣的部分油菜大田進(jìn)行了油菜菌核病的田間防治試驗(yàn)。
1、 試驗(yàn)藥劑
盾殼霉ZS-1SB菌劑取實(shí)施例2中發(fā)酵終期的含盾殼霉ZS-1SB菌劑的培養(yǎng)物適量，加自來(lái)水后反復(fù) 搓洗，洗出的分生孢子液，在3000r/min離心5min，棄上清。為了生產(chǎn)上使用方便，將盾殼霉ZS-1SB菌 劑制成孢子沉淀物(107g),每10g為一個(gè)包裝袋，真空封口保存。
對(duì)照藥劑為40%多菌靈懸浮劑(購(gòu)自天津市漢邦植物保護(hù)有限責(zé)任公司的商品)。
2、 試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)共設(shè)3個(gè)大區(qū)處理，處理不設(shè)重復(fù)；示范面積共51畝(每畝為666平方米，下同)。 試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下
處理1: 40%多菌靈懸浮劑于油菜初花期施藥1次，每畝用40%多菌靈懸浮劑200g兌清水30kg噴霧， 處理面積1畝。
處理2:盾殼霉ZS-1SB菌劑于油菜始花期施藥1次，每畝用盾殼霉ZS-1SB菌劑1袋(109孢子/8, 共10g)兌清水30kg噴霧，試驗(yàn)面積為20畝。
處理3:盾殼霉ZS-1SB菌劑于油菜始花期施藥1次,油菜初花期再施藥1次，每次每畝用盾殼霉ZS-1SB 制劑l袋(10 g)，兌清水30kg噴霧，試驗(yàn)面積為20畝。
對(duì)照只噴清水，每畝施用清水30kg，噴霧，試驗(yàn)面積為10畝。
3、 試驗(yàn)地點(diǎn)的條件
(1) 試驗(yàn)地點(diǎn)選湖北省宜昌市夷陵區(qū)鴉鵲嶺鎮(zhèn)白合村，前巷作物為中稻，土質(zhì)為沙壤土，肥力中等；
(2) 江西省彭澤縣芙蓉墩鎮(zhèn)五聯(lián)村，棉油輪作區(qū)，田間油菜菌核病常年發(fā)生較重，肥力較高，油菜系 冬前育苗移栽，灌溉條件較好；
(3) 江西省都昌縣汪墩鄉(xiāng)，棉油輪作區(qū)，田間油菜菌核病常年發(fā)生較重，肥力較高，油菜系冬前育苗 移栽，灌溉條件較好。
4、 試驗(yàn)的油菜品種供試油菜品種為當(dāng)?shù)刂饕茝V的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)(雙低型)甘藍(lán)型雜交油菜新品種"華 油雜6號(hào)"(該品種由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)育成，已通過(guò)湖北省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定， 一個(gè)公開(kāi)推廣的油 菜新品種)，按照常規(guī)方法育苗和移栽。
5、 調(diào)査取樣方法菌核病病情調(diào)査在油菜收獲1周前進(jìn)行，每塊田采用棋盤(pán)式5點(diǎn)取樣方法，每點(diǎn)調(diào) 査20株油菜，記載每處理的主莖發(fā)病病情指數(shù)和相對(duì)防效。
病情指數(shù)=E [病級(jí)數(shù)X該級(jí)病株數(shù)]/ (調(diào)査總數(shù)X最高病級(jí)數(shù))X100
相對(duì)防效(％)=(對(duì)照菌核病病情指數(shù)-處理防菌核病病情指數(shù))/對(duì)照菌核病病情指數(shù)
6、 結(jié)果分析表1本發(fā)明盾殼霉ZS-1SB菌劑對(duì)油菜菌核病的防治效果
相對(duì)防效a)
處 理
_宜昌市彭澤縣都昌縣
盾殼霉ZS-1SB菌劑施藥1次31.4 67.0 79.6 盾殼霉ZS-1SB菌劑施藥2次58.3 83.0 85.0 40%多菌靈懸浮劑施藥1次 29.0 60.2 74.0 說(shuō)明兩省防治效果出現(xiàn)的差異是各地田間油菜菌核病的自然發(fā)生程度的差異 本發(fā)明的盾殼霉ZS-1SB菌劑在湖北省和江西省3地各50畝防治試驗(yàn)結(jié)果表明，盾殼霉ZS-1SB菌劑 可以有效控制田間油菜菌核病的危害。在油菜始花期施藥一次(1(T孢子/畝))，防治效果與化學(xué)農(nóng)藥"40% 多菌靈懸浮劑"相當(dāng)，在油菜始花期施藥一次(101(1孢子/畝)、始花期再施藥一次(10""孢子/畝)，其防治 效果顯著高于40%多菌靈懸浮劑。 上述油菜始花期是指約5_10%的油菜主莖開(kāi)花；油菜初花期是指油菜始花期后6天。 田間試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明制備盾殼霉ZS-1SB菌劑是一株具有良好的生防價(jià)值的真菌菌株(菌劑)，該菌 劑對(duì)油菜菌核病或其他作物的菌核病具有較好的防治作用，顯示其具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。
主要參考文獻(xiàn)
1. Campbell W A. A new species of tb"yo^r/咖yffi/ it3/751 parasitic on sclerotia. Mycologia， 1947， 39: 190- 195
2. Cheng J S， Jiang D H， Yi X H， Fu Y P， Li G Q， Whipps J M. production, survival and efficacy of Cb/7/o^r"' /z /ff// _^/7Sconidia produced in shaken liquid culture. FEMS Microbiology Letters. 2003， 127- 131
3. Li， G.Q. ， Huang, H. C. ， Miao， H. J. ， Erickson， R. S. ， Jiang, D. H. ， Xiao, Y. N. ， 2006. Biological control of sclerotinia diseases of r即eseed by aerial applications of the mycoparasite Cb/ yo^r/咖/z i/ ^朋s. Eur. J. Plant Pathol. 114， 345 - 355.
4. Jones, E. E. ， Stewart, A. ， Whipps， J.M， 2003. Use of C》t力yW鵬transformed with the hygromycin B resistance gene to study survival and infection of 6WerW"/a sc7ero"or咖 sclerotia in soil. Mycol. Res. 107， 267 -276.
5. Whipps J M， Gerlagh M. Biology of C"A_Kr/ 恵'/^朋s and its potential use in disease biocontrol. Mycol Res， 1992， 11: 897- 907
6 Ad雄s P B. Ayers W A. 5^ar他，'咖sc7ero"Vor咖its distribution and function in natural biological control of sclerotial fungi. Phytopathology. 1980. 71: 90-9權(quán)利要求
1、一株油菜菌核病的生防菌盾殼霉(Coniothyrium minitans)ZS-1SB，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NOM209114。
2、 一株由保藏號(hào)為CCTCC NO: M209114的盾殼霉(Com'o/m'"/toraJ ZS-1SB 制備的微生物菌劑。
3、 一種盾殼霉菌劑的制備方法，其特征是，包括采用半敞開(kāi)式固體發(fā)酵培養(yǎng)所述的盾殼 霉菌劑，它還包括如下步驟(1) 盾殼霉ZS-ISB孢子懸浮液的制備將保藏號(hào)為CCTCCNO: M209114的盾殼霉ZS-1 SB菌株置于PDA培養(yǎng)基斜面上，于20。C條件下培養(yǎng)7 d;用無(wú)菌水沖洗斜面，調(diào)整分生孢子 懸浮液至1()6孢子/ml;(2) 盾殼霉ZS-1SB的擴(kuò)繁培養(yǎng)將步驟(1)的盾殼霉ZS-1SB的分生孢子懸浮液以質(zhì)量 比為l: 100接種于PDB培養(yǎng)基的三角瓶中，于150r/min， 2(TC條件下振蕩培養(yǎng)24 h，得到 盾殼霉ZS-1SB菌液，備用。(3) 盾殼霉半敞開(kāi)式固體發(fā)酵培養(yǎng)將干培養(yǎng)料燕麥片和米糠按體積比為3: 1混勻，加 入適量水浸漲后，裝入蒸籠加蓋后于旺火常壓蒸汽滅菌2 h，冷卻后，加入滅菌蒸餾水調(diào)節(jié) 所述培養(yǎng)料的最終含水量為70%，在培養(yǎng)室內(nèi)，將步驟(2)所述的盾殼霉ZS-1SB菌液以每 公斤干培養(yǎng)料添加100ral的比例接種于該培養(yǎng)料中，平鋪于蒸籠，使所述培養(yǎng)料的厚度為5 mm，加蓋，置于20。C培養(yǎng)室培養(yǎng)48 h，然后將蒸籠蓋半敞開(kāi)，于16。C條件下繼續(xù)培養(yǎng)7 d， 得到所述的盾殼霉菌劑；其中步驟(1)所述的PDA培養(yǎng)基組分及配比為馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂10g，補(bǔ)充蒸 餾水至1000ml，調(diào)pH至7.0，在12rC高壓蒸汽滅菌30min;步驟(2)所述的PDB培養(yǎng)基組分及配比為馬鈴薯200g，葡萄糖20g，補(bǔ)充蒸餾水至1000ml， 調(diào)pH至7.0，在12rC高壓蒸汽滅菌30min。
4、 權(quán)利要求1所述的盾殼霉(Com'oA;^'"m脂'"/to"^ ZS-1SB在制備防治油菜菌核病微 生物制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株對(duì)核盤(pán)菌菌核具有強(qiáng)寄生、致腐活性的盾殼霉菌株的分篩選、鑒定及在微生物菌劑中的應(yīng)用。所述的盾殼霉(Coniothyrium minitans)ZS-1SB菌株，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NOM209114。本發(fā)明還公開(kāi)了所述微生物菌劑的半敞開(kāi)式固體發(fā)酵培養(yǎng)方法及盾殼霉(Coniothyriumminitans)ZS-1SB菌劑在防治油菜菌核病中的應(yīng)用。本發(fā)明的微生物菌劑對(duì)油菜菌核病等植物真菌病害具有良好的生防效果。
文檔編號(hào)C12R1/645GK101603009SQ20091006240
公開(kāi)日2009年12月16日 申請(qǐng)日期2009年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月5日
發(fā)明者付艷蘋(píng), 姜道宏, 李國(guó)慶, 程家森, 謝甲濤 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)