專利名稱：：miR-378生物標(biāo)志物在胃癌檢測(cè)、診斷中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種內(nèi)源性非編碼小RNA(MicroRNA，miRNA)作為生物標(biāo)志物的應(yīng)用，特別是涉及一種miR-378(miRNA-378)在胃癌檢測(cè)和診斷中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：胃癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，每年約有100萬(wàn)個(gè)新發(fā)病例，男性胃癌的死亡率為各種腫瘤的第二位，女性則為第四位GarciaMetal.2007.GlobalCancerFacts&Figures2007[online].AccessedAug20,2008.URL:www.cancer,gov。而我國(guó)是胃癌的高發(fā)區(qū)，每年我國(guó)新發(fā)現(xiàn)40萬(wàn)胃癌患者，約占世界胃癌發(fā)病人數(shù)的42%左右。由于胃癌早期癥狀不明顯，又缺乏特異的早期診斷方法diMarioFetal.Non-invasivetestsingastricdiseases.DigLiverDis40:523-530(2008)，現(xiàn)有的腫瘤標(biāo)志物CEA、CA19-9、CA50、CA125在胃癌中的敏感度與特異性不高，對(duì)胃癌具較高特異性的CA72-4也通常在胃癌的III-IV期增高。胃癌的明確診斷通常在疾病的進(jìn)展期才能做出，而此時(shí)病人的平均生存期只有79個(gè)月WagnerADetal.Chemotherapyinadvancedgastriccancerasystematicreviewandmeta-analysisbasedonaggregatedata.JClinOncol.24:2903-2909(2006)。因而尋找利于早期診斷和早期治療的生物標(biāo)志物一直是胃癌研究的熱點(diǎn)。MicroRNA(miRNA)是在動(dòng)植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)度約為2125個(gè)核苷酸的非編碼RNA分子，主要通過切斷降解和翻譯抑制來完成它對(duì)靶基因的負(fù)調(diào)控ReinhartBJetal.The21-nucleotidelet-7RNAregulatesdevelopmentaltiminginCaenorhabditiselegans.Nature403，901-906(2000)；BrenneckeJetal.BantamencodesadevelopmentalIyregulatedmicroRNAthatcontrolscellproliferationandregulatestheproapoptoticgenehidinDrosophila.Cell113，25-36(2003)；ZengYetal.SequencerequirementsformicroRNAprocessingandfunctioninhumancells.RNA9，112-123(2003)；HakeSetal.MicroRNAsAroleinplantdevelopment.Curr.Biol.13，R851-R852(2003)。由于它的序列、結(jié)構(gòu)、豐度和表達(dá)方式的多樣性，使其在真核基因表達(dá)調(diào)控中有著廣泛的作用。作為人類腫瘤信號(hào)通路積極的參與者，miRNA不僅扮演著原癌基因和抑癌基因的角色DewsMetal.AugmentationoftumorangiogenesisbyaMyc-activatedmicroRNAcluster.NatGenet.38，1060-1065(2006)；HeLetal.AmicroRNApolycistronasapotentialhumanoncogene.Nature435,828-33(2005)；BonciDetal.ThemiR-15a-miR-16-lclustercontrolsprostatecancerbytargetingmultipleoncogenicactivities.NatMed.14，1271-1277(2008)，與腫瘤的轉(zhuǎn)移凋亡也有關(guān)聯(lián)HuangQetal.ThemicroRNAsmiR-373andmiR_520cpromotetumorinvasionandmetastasis.NatCellBiol.10，202-210(2008)；MaLetal.TumourinvasionandmetastasisinitiatedbymicroRNA-10binbreastcancer.Nature449，682—688(2007)；TavazoieSFetal.EndogenoushumanmicroRNAsthatsuppressbreastcancermetastasis.Nature451，147-152(2008)。由于不同的腫瘤顯不出特異性的miRNA表達(dá)譜[LuJetal.MicroRNAexpressionprofilesclassifyhumancancers.Nature435，834-838(2005)，miRNA在福爾馬林固定的組織中有很高的穩(wěn)定性XiYetal.SystematicanalysisofmicroRNAexpressionofRNAextractedfromfreshfrozenandformalin-fixedparaffin-embeddedsamples.RNA13,1668-1674(2007)；NelsonPTetal.RAKEandLNA-ISHrevealmicroRNAexpressionandlocalizationinarchivalhumanbrain.RNA12,187-191(2006)，所以越來越多的科學(xué)家提出miRNA在血清和血漿中也能有穩(wěn)定的表達(dá)，并可以作為潛在的新型腫瘤標(biāo)志物。單個(gè)miRNA能夠影響數(shù)百個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)，21-25個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度也決定了miRNA沒有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)與修飾過程，這些特點(diǎn)都預(yù)示了miRNA作為生物學(xué)標(biāo)志的優(yōu)越性。已有研究發(fā)現(xiàn)，miR-141在包括人前列腺癌在內(nèi)的上皮細(xì)胞性腫瘤患者血清中有明顯的表達(dá)上調(diào)，提示miR-141可以作為判斷腫瘤類型的生物學(xué)標(biāo)志PatrickSetal.CirculatingmicroRNAsasstableblood-basedmarkersforcancerdetection.PNAS.105,10513-10518(2008)。缺乏明顯臨床癥狀及有效生物學(xué)標(biāo)志的卵巢癌患者也可以用血清miRNA檢測(cè)來提高早期診斷及早期治療的可能性?？茖W(xué)家們發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了miR-21，92，93，126和29a在腫瘤血清樣本中有明顯的過量表達(dá)，而miR-155,127及99b的表達(dá)卻明顯降低ResnickKEetal.ThedetectionofdifferentiallyexpressedmicroRNAsfromtheserumofovariancancerpatientsusinganovelreal-timePCRplatform.GynecolOncol.112,55-59(2009)；TaylorDetal.MicroRNAsignaturesoftumor-derivedexosomesasdiagnosticbiomarkersofovariancancer.GynecolOncol.110,13-21(2008)。此外在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤血清中miR-21的表達(dá)明顯增高,增高的miR-21還暗示了較好的無復(fù)發(fā)生存率LawrieCHetal.Detectionofelevatedlevelsoftumour-associatedmicroRNAsinserumofpatientswithdiffuselargeB-celllymphoma.BrJHaematol.141,672-5(2008)；ChinLJetal.Atruthserumforcancer-microRNAshavemajorpotentialascancerbiomarkers.CellRes.18,983-984(2008)。這一結(jié)果顯不，檢驗(yàn)miRNA的特異性表達(dá)不僅有助于腫瘤的早期診斷，還可用于病人的預(yù)后判斷。這些研究都充分證實(shí)，血清及血漿miRNA的測(cè)定是一個(gè)檢測(cè)癌癥生物學(xué)標(biāo)志物很有前途的領(lǐng)域?，F(xiàn)有的腫瘤標(biāo)志物CEA、CA19-9、CA50、CA125在胃癌中的敏感度與特異性不高，對(duì)胃癌具較高特異性的CA72-4也通常在胃癌的III-IV期增高。胃癌的明確診斷通常在疾病的進(jìn)展期才能做出，因而尋找利于早期診斷和早期治療的生物標(biāo)志物一直是胃癌研究的熱
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種miR-378生物標(biāo)志物在胃癌檢測(cè)、診斷中的應(yīng)用。利用該生物標(biāo)志物可以簡(jiǎn)單、快捷地進(jìn)行胃癌檢測(cè)、診斷，以便更好的治療。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的一種用于胃癌檢測(cè)的miRNA生物標(biāo)志物，是如SEQIDNO.I所示miRNA序列的miR-378。該miR-378在胃癌患者血清中特異性表達(dá)上調(diào)。該生物標(biāo)志物還可以應(yīng)用于胃癌的診斷。另外，本發(fā)明還提供了一種利用上述生物標(biāo)志物進(jìn)行胃癌檢測(cè)的方法，具體包括以下步驟(I)收集人血清樣本；(2)提取血清中總RNA(包含miRNA)；(3)對(duì)miR-378生物標(biāo)志物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和Realtime-PCR(RT_PCR，實(shí)時(shí)定量PCR)，并計(jì)算miR-378生物標(biāo)志物的PCR相對(duì)定量值；(4)當(dāng)樣本中的miR-378生物標(biāo)志物的PCR相對(duì)定量值小于或等于2.9時(shí)，則認(rèn)為是非胃癌樣本；大于2.9時(shí)，則認(rèn)為是胃癌樣本。其中，步驟⑴收集人血清樣本的具體操作為將收集的血樣本放入不含EDTA(乙二胺四乙酸)的試管中，靜置凝固后，取上清在4°C下600g900g離心515分鐘后，再取上清并在4°C下12000g16000g離心515分鐘，取上清即得。步驟⑵中的總RNA抽提，可按照商業(yè)化的RNA抽提試劑盒進(jìn)行操作，并測(cè)量RNA的濃度。步驟(3)中的反轉(zhuǎn)錄可按照商業(yè)化的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行；Realtime_PCR反應(yīng)也可按照商業(yè)化RT-PCR反應(yīng)試劑盒進(jìn)行操作，其中，Realtime-PCR反應(yīng)中，以U6snRNA作為內(nèi)參，并自行設(shè)計(jì)U6snRNA的引物，以及使用2Δα公式來計(jì)算miR-378生物標(biāo)志物的PCR相對(duì)定量值，式中ACt=Ct^feift-Ctu6,Ct是域值循環(huán)數(shù)，Ct是miR-378生物標(biāo)志物的Ct值，Ctu6是U6snRNA的Ct值。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為37°CI小時(shí)，95°C5分鐘。Realtime-PCR反應(yīng)中U6snRNA的引物序列設(shè)計(jì)為ttcgtgaagcgttccatatttt(SEQIDNO.2所示),miR-378生物標(biāo)志物的引物序列為actggacttggagtcagaagg(SEQIDNO.3所示),其Realtime-PCR反應(yīng)條件為95°C15分鐘，然后進(jìn)行循環(huán)，循環(huán)條件為94°C15秒，55°C30秒，700C34秒，共40個(gè)循環(huán)。再者，本發(fā)明還提供一種用于胃癌檢測(cè)的miR-378生物標(biāo)志物檢測(cè)試劑盒，該檢測(cè)試劑盒包括常規(guī)實(shí)時(shí)定量PCR試劑(包括Taq酶、dNTP試劑、熒光試劑、PCR緩沖液、DEPC處理水等)、內(nèi)參U6snRNA的檢測(cè)引物(SEQIDNO.2所示),miR-378的檢測(cè)引物(SEQIDN0.3所示)。其中，該檢測(cè)試劑盒的操作方法可參照利用上述生物標(biāo)志物進(jìn)行胃癌檢測(cè)的方法進(jìn)行。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示不同的腫瘤樣本都具有特異性的血清miRNA表達(dá)譜。本發(fā)明中的miR-378在正常人和胃癌患者血清中存在差異表達(dá)，在胃癌血清中有顯著的表達(dá)上調(diào)。另外，本發(fā)明以miR-378生物標(biāo)志物的PCR相對(duì)定量值取2.9為臨界值作為判斷胃癌的依據(jù)是根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)所得，其中，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)包括以下具體實(shí)施例中的實(shí)施例I和實(shí)施例2。因此，可以成為胃癌檢測(cè)診斷、病理分級(jí)、臨床分期、治療療效判斷的有效工具，具有良好的臨床應(yīng)用前景。圖I是實(shí)施例I中的24個(gè)血清樣本的miRNA表達(dá)譜聚類圖。橫排代表miRNA，縱排代表樣本。從左到右，左側(cè)區(qū)域顯示的是10個(gè)正常樣本，中間區(qū)域顯示的是7個(gè)結(jié)直腸癌樣本，右側(cè)區(qū)域顯示的是7個(gè)胃癌樣本。圖2是實(shí)施例I中的胃癌樣本與正常樣本中miR-378表達(dá)量的比值，其中，左側(cè)顯示的是芯片結(jié)果，右側(cè)為RT-PCR的驗(yàn)證結(jié)果。圖3是實(shí)施例2中的正常血清樣本和胃癌血清樣本中的miR-378表達(dá)豐度的比較圖，其中，縱坐標(biāo)為miR-378的PCR相對(duì)定量值。圖4是實(shí)施例2中的正常血清樣本和胃癌血清樣本中的miR-378表達(dá)豐度的比較圖(箱圖)，其中，縱坐標(biāo)為miR-378的PCR相對(duì)定量值。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明實(shí)施例I用于胃癌檢測(cè)的生物標(biāo)志物組合的建立I.收集血清樣本采集10個(gè)正常人、7個(gè)結(jié)直腸癌、7個(gè)胃癌各病期病人術(shù)前外周血2mL(采血時(shí)間一般為早晨或上午)，其中，這24個(gè)血清樣本的具體臨床數(shù)據(jù)如表I所示。將采集的2mL外周血迅速轉(zhuǎn)入不含EDTA的普通試管中，在2225°C(室溫)靜置1530分鐘至完全凝固。取O.6mlImL上清轉(zhuǎn)至潔凈的I.5mL離心管中，在I小時(shí)(室溫條件下)或2小時(shí)(4°C條件下)內(nèi)進(jìn)行以下操作4°C下820g離心10分鐘；再次吸取上清轉(zhuǎn)至潔凈的I.5mL離心管中，4°C下16000g離心10分鐘，小心吸取上清到新的離心管中，置于-80°C保存?zhèn)溆?。表I24個(gè)血清樣本的具體臨床數(shù)據(jù)權(quán)利要求1.一種用于胃癌檢測(cè)的miRNA生物標(biāo)志物，其特征在于所述miRNA生物標(biāo)志物是如SEQIDNO.I所示miRNA序列的miR-378。2.如權(quán)利要求I所述的用于胃癌檢測(cè)的miRNA生物標(biāo)志物，其特征在于所述miR-378在胃癌患者血清中的特異性表達(dá)上調(diào)。3.如權(quán)利要求I或2所述的miR-378生物標(biāo)志物還應(yīng)用于胃癌的診斷。4.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用于miR-378生物標(biāo)志物的實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)中的內(nèi)參，其特征在于所述內(nèi)參為U6snRNA，其引物序列如SEQIDNO.2所示。5.如權(quán)利要求I所述的利用miR-378生物標(biāo)志物進(jìn)行胃癌檢測(cè)的方法，包括步驟(1)收集人血清樣本；(2)提取血清中總RNA；(3)對(duì)miR-378生物標(biāo)志物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，并計(jì)算miR-378生物標(biāo)志物的PCR相對(duì)定量值；(4)當(dāng)樣本中的miR-378生物標(biāo)志物的PCR相對(duì)定量值小于或等于2.9時(shí)，則認(rèn)為是非胃癌樣本；大于2.9時(shí)，則認(rèn)為是胃癌樣本。6.如權(quán)利要求5所述的利用miR-378生物標(biāo)志物進(jìn)行胃癌檢測(cè)的方法，其特征在于所述步驟(I)收集人血清樣本的具體操作為將收集的人血樣本放入不含EDTA的試管中，靜置凝固后，取上清在4°C下600g900g離心515分鐘后，再取上清，并在4°C下12000g16000g離心515分鐘，取上清即得。7.如權(quán)利要求5所述的利用miR-378生物標(biāo)志物進(jìn)行胃癌檢測(cè)的方法，其特征在于所述步驟(3)中的實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)中，以U6snRNA作為內(nèi)參，該內(nèi)參的引物序列如SEQIDNO.2所示，miR-378生物標(biāo)志物的引物序列如SEQIDNO.3所示；并使用2Δα公式來計(jì)算miR-378生物標(biāo)志物的PCR相對(duì)定量值，式中ΛCt=Ct_CtU6。8.如權(quán)利要求I所述的用于胃癌檢測(cè)的miR-378生物標(biāo)志物檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述檢測(cè)試劑盒包括常規(guī)實(shí)時(shí)定量PCR試劑、如SEQIDNO.2所示的內(nèi)參U6snRNA的檢測(cè)引物、如SEQIDNO.3所示的miR-378生物標(biāo)志物的檢測(cè)引物。9.如權(quán)利要求8所述的用于胃癌檢測(cè)的miR-378生物標(biāo)志物檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述常規(guī)實(shí)時(shí)定量PCR試劑包括Taq酶、dNTP試劑、熒光試劑、PCR緩沖液、DEPC處理水。全文摘要本發(fā)明公開了一種miR-378生物標(biāo)志物在胃癌檢測(cè)、診斷中的應(yīng)用，該miR-378生物標(biāo)志物的miRNA序列如SEQIDNO.1所示；其檢測(cè)的方法，包括1)收集人血清樣本；2)提取血清中總RNA；3)對(duì)miR-378生物標(biāo)志物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，以U6snRNA作為內(nèi)參，計(jì)算miR-378生物標(biāo)志物的PCR相對(duì)定量值；4)當(dāng)樣本中的miR-378生物標(biāo)志物的PCR相對(duì)定量值小于或等于2.9時(shí)，則認(rèn)為是非胃癌樣本，大于2.9時(shí)，則認(rèn)為是胃癌樣本。利用該生物標(biāo)志物可以簡(jiǎn)單、快捷地進(jìn)行胃癌檢測(cè)、診斷，以便更好的治療。文檔編號(hào)C12Q1/68GK102605042SQ20111002269公開日2012年7月25日申請(qǐng)日期2011年1月20日優(yōu)先權(quán)日2011年1月20日發(fā)明者劉寒梢,孟憲欣,張偉,張春秀,肖華勝申請(qǐng)人:上海生物芯片有限公司