專(zhuān)利名稱(chēng)：調(diào)控的表達(dá)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于可調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)領(lǐng)域，更具體地，屬于空間(在特定組織中)和時(shí)間(響應(yīng)誘導(dǎo)劑的添加)形式的可調(diào)控表達(dá)領(lǐng)域。本發(fā)明還涉及允許調(diào)控肝特異性表達(dá)的基因構(gòu)建體和病毒粒子，以及其在治療肝病中的用途。
背景技術(shù)：
肝功能包括，除其它外，糖類(lèi)和脂類(lèi)的代謝、細(xì)胞因子分泌、胰島素和其它激素的消解、膽汁的產(chǎn)生等。而且，在肝臟中產(chǎn)生影響許多遺傳疾病、心血管疾病、代謝疾病、出血性疾病和癌癥的因子。肝細(xì)胞的半衰期很長(zhǎng)，并直接連接到血流，其有利于治療劑的到達(dá)。由于這些原因，肝臟被認(rèn)為是基因治療的良好候選器官。然而，為了防止在非肝組織中與靶基因表達(dá)相關(guān)的次生效應(yīng)，產(chǎn)生允許肝臟中目的基因特異性表達(dá)的有效系統(tǒng)是有利的。 為此，使用這樣的構(gòu)建體，其中目的基因受肝特異性啟動(dòng)子控制，所述啟動(dòng)子諸如磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶啟動(dòng)子(PEPCK)、糖異生酶(Yang，Y. W.，J.等，GeneMed.，5:417' -424(2003))、α-I-抗胰蛋白酶、白蛋白、FVII、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(OATP-C)、乙型肝炎病毒核心蛋白(Kramer, M. G.,等，Mol. Ther.，7:375-385，2003)及甲狀腺素-結(jié)合球蛋白(ffang, L.,等，Proc. Natl. Acad. Sci, 96:3906-3910 (1999)。然而，這種類(lèi)型系統(tǒng)的缺點(diǎn)是導(dǎo)致目的基因的恒定表達(dá)，其可能引起毒性及非預(yù)期的影響。為了防止目的基因的恒定表達(dá)所產(chǎn)生的影響，開(kāi)發(fā)了在僅存在給定誘導(dǎo)劑時(shí)進(jìn)行表達(dá)的可誘導(dǎo)系統(tǒng)。因此，可誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)被視為時(shí)間和空間上是可控的，基于啟動(dòng)子的使用，存在嵌合轉(zhuǎn)錄因子時(shí)啟動(dòng)子可被激活，轉(zhuǎn)錄因子活性由米非司酮(RU-486)誘導(dǎo)(見(jiàn)Wang等，Nat. Biotechnol.，1997, 15:239-43)。使用組織特異性啟動(dòng)子可將這種類(lèi)型的調(diào)控應(yīng)用于任何細(xì)胞類(lèi)型。這種系統(tǒng)是特定的、可逆的且無(wú)毒的。然而，其缺點(diǎn)是基礎(chǔ)條件下導(dǎo)致高表達(dá)水平，這使得其希望的體內(nèi)應(yīng)用不可接受。Zabala 等(Cancer Research 2004, 64:2799-2804)描述了包括不同四環(huán)素-可誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)(tet-on)的實(shí)施方案的質(zhì)粒載體，這些質(zhì)粒載體都包括編碼轉(zhuǎn)基因(熒光素酶或IL-12)的序列，轉(zhuǎn)基因由操縱基因(operator)-啟動(dòng)子序列控制的轉(zhuǎn)錄單位轉(zhuǎn)錄，所述操縱基因-啟動(dòng)子序列由7個(gè)四環(huán)素操縱基因(tet07)連接白蛋白啟動(dòng)子(Palb)構(gòu)成；這個(gè)系統(tǒng)還包括編碼逆向反式激活因子rtTA (rtTA2s-M2)的序列，在肝特異性啟動(dòng)子序列的控制下，根據(jù)不同的實(shí)施方案，啟動(dòng)子序列不同，其選自EIIP a IAT (人α-I-抗胰蛋白酶基因的啟動(dòng)子Pa IAT與增強(qiáng)乙型肝炎病毒核心抗原的區(qū)域EII相融合)、EalbPa IAT (人α-l-抗胰蛋白酶基因的啟動(dòng)子Pa IAT與增強(qiáng)白蛋白基因的區(qū)域Ealb相融合)以及Phpx(人類(lèi)血色素結(jié)合蛋白基因的啟動(dòng)子)。在本文中，證明了轉(zhuǎn)基因的基礎(chǔ)表達(dá)與用于控制rtTA表達(dá)的肝特異性啟動(dòng)子的強(qiáng)度成正比；誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的能力與基礎(chǔ)表達(dá)成反比(使用最弱啟動(dòng)子Phpx時(shí)，誘導(dǎo)率最大)；然而，誘導(dǎo)后的最大表達(dá)水平與啟動(dòng)子的能力成正比，即，最強(qiáng)啟動(dòng)子表達(dá)誘導(dǎo)后的最高水平。另一方面，當(dāng)rtTA轉(zhuǎn)錄單位和轉(zhuǎn)基因依次放置時(shí)，轉(zhuǎn)基因的表達(dá)強(qiáng)于它們位于相反方向時(shí)。然而，在該研究中，指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的Palb啟動(dòng)子的使用伴隨著轉(zhuǎn)基因的較低表達(dá)，相比較于使用最小巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子的系統(tǒng)。Kramer 等(Molecular Therapy, 2003，7:375-385)比較了不同啟動(dòng)子構(gòu)建體的啟動(dòng)子活性，包括肝特異性EIIPalAT、EalbPalAT和Phpx啟動(dòng)子。他們證明了 PalAT啟動(dòng)子自身或與VHB病毒的Ealb或EII增強(qiáng)子結(jié)合，指導(dǎo)肝細(xì)胞中基因穩(wěn)定表達(dá)的效能最高。Chtarto等(Gene Therapy, 2003, 10:84-94)描述了由四環(huán)素-可誘導(dǎo)的雙向轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)可誘導(dǎo)表達(dá)轉(zhuǎn)基因(eGFP報(bào)告基因，增強(qiáng)的GFP)的AAV載體。所述系統(tǒng)包括含有tet07操縱基因區(qū)域的序列，該操縱基因區(qū)域兩側(cè)是最小巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子序列(pCMVm)，其在相反方向指導(dǎo)反式激活因子(rtTA)的轉(zhuǎn)錄，所述反式激活因子由四環(huán)素和轉(zhuǎn)基因激活，這樣，在存在強(qiáng)力霉素時(shí)，rtTA反式激活因子誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因及其自身的轉(zhuǎn)錄。該系統(tǒng)還包括雙向SV40聚腺苷酸化信號(hào)。這種自我調(diào)節(jié)系統(tǒng)顯示出在腫瘤細(xì)胞系和腦內(nèi)體 內(nèi)表達(dá)中誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的能力。在最近的報(bào)告中(Chtarto等Experimental Neurology2007，204:387 - 399)，這一相同的組描述了改進(jìn)版載體，其攜帶突變的rtTA反式激活因子，其可以在生物活性濃度下在紋狀體核中表達(dá)GDNF，該濃度抑制強(qiáng)力霉素處理的大鼠中的酪氨酸羥化酶，但在非誘導(dǎo)的對(duì)照鼠中不抑制酪氨酸羥化酶。然而，根據(jù)上述規(guī)定的要求，無(wú)相關(guān)數(shù)據(jù)表明這些載體是否適合獲得肝內(nèi)轉(zhuǎn)基因表達(dá)。然而，目前技術(shù)水平需要開(kāi)發(fā)用于目的基因的可誘導(dǎo)的肝特異性表達(dá)的可代替的系統(tǒng)，該系統(tǒng)不存在目前所述系統(tǒng)的缺點(diǎn)。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明的作者表明，基于使用四環(huán)素-敏感型反式激活因子和最小CMV啟動(dòng)子的可誘導(dǎo)表達(dá)載體在肝臟中不表現(xiàn)出可控特異性表達(dá)的良好狀況，但是，正相反的是，包括人白蛋白啟動(dòng)子(PAlb)替代最小pCMV啟動(dòng)子的外源基因表達(dá)系統(tǒng)不僅能獲得較低的肝特異性基礎(chǔ)表達(dá)，而且更令人驚訝的是能在誘導(dǎo)后獲得強(qiáng)于那些最小CMV型的強(qiáng)啟動(dòng)子獲得的表達(dá)水平。因此，本發(fā)明的第一方面涉及一種基因構(gòu)建，其允許目的多核苷酸響應(yīng)誘導(dǎo)劑的可誘導(dǎo)的肝特異性表達(dá)，該構(gòu)建體包含⑴可誘導(dǎo)的雙向操縱基因-啟動(dòng)子，其包含至少一個(gè)所述誘導(dǎo)劑的應(yīng)答元件，所述應(yīng)答元件兩側(cè)是第一肝特異性啟動(dòng)子序列和第二肝特異性啟動(dòng)子序列，其中兩個(gè)肝特異性啟動(dòng)子序列以不同方式作用，(ii)第一核苷酸序列，其包含編碼可以由所述誘導(dǎo)劑激活的反式激活因子的序列及位于相對(duì)于編碼反式激活因子區(qū)域的3’端的聚腺苷酸化信號(hào)，其中編碼反式激活因子的所述序列可操作地連接到第一肝特異性啟動(dòng)子序列，以及(iii)第二核苷酸序列，其包含可操作地連接到第二肝特異性啟動(dòng)子序列的多核苷酸及位于相對(duì)于目的多核苷酸的3’端的聚腺苷酸化信號(hào)，其中由于誘導(dǎo)劑存在時(shí)反式激活因子與操縱基因-啟動(dòng)子的操縱基因區(qū)域結(jié)合而誘導(dǎo)了所述第一和第二肝特異性啟動(dòng)子序列的啟動(dòng)子活性。本發(fā)明的第二方面涉及包含本發(fā)明基因構(gòu)建體的載體、病毒基因組或病毒粒子。本發(fā)明的另一方面涉及通過(guò)在合適的包裝細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的病毒基因組而獲得的病毒粒子。本發(fā)明的另一方面涉及在肝源性細(xì)胞中表達(dá)目的多核苷酸的體外方法，其包含以下步驟(i)將所述細(xì)胞與根據(jù)本發(fā)明的基因構(gòu)建體、根據(jù)本發(fā)明的載體、根據(jù)本發(fā)明的病毒基因組或根據(jù)本發(fā)明的病毒粒子在所述構(gòu)建體、所述載體或所述病毒粒子進(jìn)入細(xì)胞的合適條件下相接觸，以及(ii)在必要的時(shí)間將所述細(xì)胞與誘導(dǎo)劑接觸以產(chǎn)生目的多核苷酸的表達(dá)。本發(fā)明的其它方面涉及根據(jù)本發(fā)明的基因構(gòu)建體、根據(jù) 本發(fā)明的載體、根據(jù)本發(fā)明的病毒基因組或根據(jù)本發(fā)明的病毒粒子的藥物組合物，以及其作為藥物的用途或用于治療肝病。本發(fā)明的另一方面涉及可誘導(dǎo)的雙向操縱基因-啟動(dòng)子，其適合誘導(dǎo)劑對(duì)兩個(gè)目的多核苷酸的可誘導(dǎo)的肝特異性表達(dá)，其包含(i)至少一個(gè)所述誘導(dǎo)劑的應(yīng)答元件，(ii)第一肝特異性啟動(dòng)子序列，以及(iii)第二肝特異性啟動(dòng)子序列，其中第一和第二肝特異性啟動(dòng)子序列相對(duì)于誘導(dǎo)劑的應(yīng)答元件以不同方式作用，且其中存在所述誘導(dǎo)劑和與應(yīng)答元件結(jié)合的反式激活因子時(shí)，第一和第二肝特異性啟動(dòng)子序列的啟動(dòng)子活性增加。本發(fā)明的其它方面涉及適合誘導(dǎo)劑對(duì)目的多核苷酸的可誘導(dǎo)肝特異性表達(dá)的基因構(gòu)建體，其包含(a)可誘導(dǎo)的雙向操縱基因-啟動(dòng)子，其包含(i)至少一個(gè)所述誘導(dǎo)劑的應(yīng)答元件，(ii)第一肝特異性啟動(dòng)子序列，以及(iii)第二肝特異性啟動(dòng)子序列，(b)編碼由所述誘導(dǎo)劑激活的反式激活因子的核苷酸序列及位于相對(duì)于編碼反式激活因子區(qū)域3’端的聚腺苷酸化信號(hào)，所述核苷酸序列可操作地連接到第一肝特異性啟動(dòng)子序列，其中第一和第二肝特異性啟動(dòng)子序列相對(duì)于誘導(dǎo)劑的應(yīng)答元件以不同方式作用，且其中在可誘導(dǎo)的雙向操縱基因-啟動(dòng)子中存在所述誘導(dǎo)劑和與應(yīng)答元件結(jié)合的反式激活因子時(shí)，第一和第二肝特異性啟動(dòng)子序列的啟動(dòng)子活性增加。


圖I.本發(fā)明的四環(huán)素-可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)圖。(I)雙向操縱基因-啟動(dòng)子序列；(2)激活形式的反式激活因子的雙向應(yīng)答元件；(3)包含肝特異性啟動(dòng)子(優(yōu)選為白蛋白啟動(dòng)子(pAlb)或最小的白蛋白啟動(dòng)子(pmAlb))的啟動(dòng)子序列；(4)編碼由誘導(dǎo)劑激活的逆向反式激活因子的序列，優(yōu)選地由四環(huán)素(rtTA)激活；(5)編碼目的轉(zhuǎn)基因的序列；(6)聚腺苷酸化信號(hào)(polyA或pA)。雙向操縱基因-啟動(dòng)子序列控制編碼反式激活因子(優(yōu)選為rtTA) (4)和目的轉(zhuǎn)基因(5)的序列的轉(zhuǎn)錄；反之，存在誘導(dǎo)劑(優(yōu)選為四環(huán)素或四環(huán)素的類(lèi)似物，諸如強(qiáng)力霉素)時(shí)，反式激活蛋白(優(yōu)選為rtTA)誘導(dǎo)其啟動(dòng)子活性。圖2.實(shí)施例中使用的不同重組腺相關(guān)病毒的結(jié)構(gòu)，其中已經(jīng)整合了四環(huán)素-可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)。A)rAAV-pTetbidi-pCMV_luc :該腺相關(guān)病毒的基因組具有整合的四環(huán)素-可誘導(dǎo)的雙向表達(dá)系統(tǒng)，其包括有7個(gè)42堿基的四環(huán)素操縱基因(tet07)的操縱基因區(qū)域，兩側(cè)是2個(gè)最小巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(PCMV);操縱基因-啟動(dòng)子控制2個(gè)序列的表達(dá)，每側(cè)放置一個(gè)，其分別編碼逆向反式激活因子rtTA-M2和作為目的轉(zhuǎn)基因的熒光素酶(Iuc);將雙向SV40聚腺苷酸化信號(hào)整合作為聚腺苷酸化信號(hào)(PA) t;表達(dá)盒兩側(cè)包括2型腺相關(guān)病毒(AAV2)的5，-ITR(反向末端重復(fù)序列)和3，ITR0B)rAAV-pTetbidi-pAlb-luc :這種腺相關(guān)病毒的基因組具有整合的四環(huán)素-可誘導(dǎo)的雙向表達(dá)系統(tǒng)，其包括與rAAV-pTetbidi-pCMV-luC病毒相同的元件，唯一的區(qū)別是白蛋白基因啟動(dòng)子(PAlb)序列取代了最小的pCMV啟動(dòng)子。C)rAAV-pTetbidi-pAlb_mIL12 :該腺相關(guān)病毒的基因組具有整合的四環(huán)素-可誘導(dǎo) 的雙向表達(dá)系統(tǒng)，其包括與rAAV-pTetbidi-pCMV-luC病毒相同的元件，唯一的區(qū)別是鼠單鏈IL12 序列取代了突光素酶基因(Lieschke, G. J.,等 mNat Biotechnol, 1997. 15:35-40)。圖3.通過(guò)CXD相機(jī)獲得的生物發(fā)光圖像。圖像示出了選為測(cè)量熒光素酶活性水平的區(qū)域。A)上腹區(qū)(包括肝臟)，及B)整個(gè)動(dòng)物發(fā)出的生物發(fā)光水平。圖4.在注射了含有重組rAAV-pTetbidi-pCMV-luc病毒(劑量為每只鼠1x10'3xl01(l及IxlO11病毒基因組(vg)，取決于組)的基因組的病毒粒子或病毒顆粒的雌性BALB/c小鼠中，測(cè)量熒光素酶活性(光子/S)。注射的病毒粒子為AAV2/8病毒粒子，其含有構(gòu)建于AAV2病毒ITRs上的基因組，但包裝于AAV8衣殼內(nèi)(由對(duì)應(yīng)于血清型8的腺相關(guān)病毒的衣殼蛋白組成)。為了誘導(dǎo)熒光素酶的表達(dá)，施用病毒載體21天后，對(duì)每個(gè)動(dòng)物施用強(qiáng)力霉素(50mg/kg重量；腹腔內(nèi)注射途徑)，并且施用強(qiáng)力霉素(dox) 24小時(shí)后在飲用水(2mg/ml強(qiáng)力霉素；5%蔗糖)中維持誘導(dǎo)7天。線條表示根據(jù)時(shí)間測(cè)量的熒光素酶活性，從第一次通過(guò)腹腔內(nèi)注射途徑施用強(qiáng)力霉素(O天)以天數(shù)t(d)表示。肝區(qū)的活性水平用實(shí)線表示；整個(gè)動(dòng)物的活性水平用虛線表示。圖5.在注射了含有rAAV-pTetbidi-pCMV-luC病毒(劑量為每只鼠IxIOiqJxIOiq及IxlO11vg)基因組的AAV2/8病毒粒子的小鼠中，測(cè)量熒光素酶活性(光子/S)。在用增加劑量的強(qiáng)力霉素(mg/kg;腹腔內(nèi)注射途徑)以15天為間隔重復(fù)誘導(dǎo)后進(jìn)行測(cè)量。自腹腔內(nèi)注射施用強(qiáng)力霉素24小時(shí)后在上腹部或肝區(qū)測(cè)量熒光素酶活性。圖6.在通過(guò)靜脈途徑注射了含有重組rAAV-pTetbidi-pAlb_luc病毒(IXlO11Vg/小鼠)基因組的AAV2/8病毒粒子的雌性BALB/c小鼠中，測(cè)量熒光素酶活性(光子/s)。在強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)前測(cè)量基礎(chǔ)狀態(tài)下(劑量O)的活性，且在腹腔內(nèi)注射施用50mg/kg重量24小時(shí)后測(cè)量誘導(dǎo)狀態(tài)下(劑量50)的活性；均在上腹部(肝臟)和整個(gè)動(dòng)物(合計(jì))中進(jìn)行這
些測(cè)量。圖7.在注射了 含有 rAAV-pTetbidi-pCMV_luc 或rAAV-pTetbidi-pAlb-luc (I X IO1Vg/小鼠；靜脈注射途徑)基因組的AAV2/8病毒粒子的雌性BALB/c小鼠中，測(cè)量基礎(chǔ)狀態(tài)下(劑量O)和腹腔內(nèi)注射施用50mg/kg的強(qiáng)力霉素24小時(shí)后的誘導(dǎo)狀態(tài)下(劑量50)的熒光素酶活性(光子/s)的比較。在上腹部區(qū)域(肝臟)進(jìn)行測(cè)量。圖8.在注射了 整合 rAAV-pTetbidi-pAlb-luC 病毒(劑量為 I X IO11 及 I X IO10Vg/小鼠，取決于組，靜脈注射途徑)基因組的AAV2/8病毒粒子的雌性BALB/c小鼠中的熒光素酶活性(光子/s)。在基礎(chǔ)狀態(tài)下(誘導(dǎo)O)和50mg/kg的強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)24小時(shí)后的4次重復(fù)誘導(dǎo)周期(分別為誘導(dǎo)1、2、3和4)測(cè)量活性。在誘導(dǎo)I和誘導(dǎo)2之間，及誘導(dǎo)2與誘導(dǎo)3之間，經(jīng)過(guò)15天；在誘導(dǎo)3和誘導(dǎo)4之間，經(jīng)過(guò)80天。圖9. A)對(duì)于注射了攜帶 rAAV-pTetbidi-pAlb_luc (I X IO11Vg/ 小鼠；靜脈注射途徑)基因組的AAV2/8病毒粒子的雌性和雄性C57BL/6鼠，測(cè)量其在基礎(chǔ)狀態(tài)下和不同劑量的強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)后的誘導(dǎo)狀態(tài)下的熒光素酶活性(光子/S)。對(duì)每組小鼠(N=5)施用不同劑量的強(qiáng)力霉素(劑量為mg/kg重量；靜脈注射途徑)。在注射相應(yīng)病毒后14天測(cè)量基礎(chǔ)活性；在注射病毒后22天及施用強(qiáng)力霉素劑量24小時(shí)后進(jìn)行誘導(dǎo)狀態(tài)下的測(cè)量。B)A)中所示活性數(shù)據(jù)的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換[Lo gltl(光子/s)]。圖10.在注射了攜帶 rAAV-pTetbidi-pAlb_luc (I X IO11Vg/ 小鼠；靜脈注射途徑)的AAV2/8病毒粒子的雌性和雄性C57BL/6鼠中，測(cè)量基礎(chǔ)狀態(tài)下(O天)和在飲用水(2mg/ml+5%蔗糖)中施用強(qiáng)力霉素期間不同天數(shù)的熒光素酶活性(光子/S)。圖11.體外熒光素酶活性的生物分布。雌性BALB/c (A)和C57BL/6 (B)品種(N=4 -8)注射了 攜帶 rAAV-pTetbidi-pCMV_luc 或 rAAV-pTetbidi-pAlb_luc (劑量為 IX IO11Vg/ 小鼠，靜脈注射途徑)的AAV2/8病毒粒子。注射病毒后21天，施用強(qiáng)力霉素(50mg/kg;腹腔內(nèi)注射途徑)誘導(dǎo)熒光素酶的表達(dá)；誘導(dǎo)后24小時(shí)，處死動(dòng)物；提取器官并測(cè)量每個(gè)器官中的熒光素酶活性(RLU)，以總蛋白量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(RLU/mg蛋白質(zhì))。圖12.體外熒光素酶活性的生物分布。雄性BALB/c (A)和C57BL/6 (B)品種(N=4 -8)注射了 攜帶 rAAV-pTetbidi-pCMV_luc 或 rAAV-pTetbidi-pAlb_luc (劑量為 IX IO11Vg/ 小鼠，靜脈注射途徑)的AAV2/8病毒粒子。注射病毒后21天，施用強(qiáng)力霉素(50mg/kg;腹腔內(nèi)注射途徑)誘導(dǎo)熒光素酶的表達(dá)；誘導(dǎo)后24小時(shí)，處死動(dòng)物；提取器官并測(cè)量每個(gè)器官中的熒光素酶活性(RLU)，以總蛋白量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(RLU/mg蛋白質(zhì))。圖13.移植來(lái)自MC28同源腫瘤系的細(xì)胞后，施用于雌性C57BL/6小鼠的抗腫瘤治療方案圖。在第O天，施用了 3種不同劑量的攜帶rAAV-pTetbidipAlb-mIL12 (3 X 101、I X 101°和3X109vg/小鼠)的AAV2/8病毒粒子，且留下一組不施用載體的小鼠(N=5)。30天后，肝內(nèi)植入5X105MC38細(xì)胞。植入后10天(該方案的第40天)，通過(guò)腹腔內(nèi)注射施用強(qiáng)力霉素(50mg/kg)開(kāi)始對(duì)系統(tǒng)的誘導(dǎo)。接下來(lái)的一天，在飲用水中(2mg/ml強(qiáng)力霉素+5%蔗糖)繼續(xù)誘導(dǎo)，且維持后6天(直到該方案的第47天)。在第90天，皮下再次給藥I X 106MC38細(xì)胞/小鼠，2組接受最高劑量的載體，且5只天然鼠作為對(duì)照。再次給藥后第13、23與42天(該方案的103、113與132天)測(cè)量腫瘤大小。在第113天，給小鼠抽血并提取PBLs。最后，在第132天，處死動(dòng)物并從未完全保護(hù)的小鼠中提取皮下腫瘤。紅色垂直線表示用于測(cè)量血清指標(biāo)而進(jìn)行的抽血的天數(shù)。藍(lán)色垂直線表示測(cè)量再次給藥后腫瘤大小的天數(shù)。圖14.在注射了攜帶 rAAV-pTetbidi-pAlb-mIL12 (3 個(gè)不同劑量3 X 101CI、I X 101°和3X IO9Vg/小鼠)的AAV2/8病毒粒子的雌性C57BL/6動(dòng)物的血清中，轉(zhuǎn)氨酶、ALT(A)和AST(B)的水平。所示水平為基礎(chǔ)狀態(tài)下(誘導(dǎo)的第O天)，開(kāi)始腹腔內(nèi)注射施用50mg/kg的強(qiáng)力霉素后的第1、4和7天，在誘導(dǎo)的第O天進(jìn)行，然后在飲用水中(2mg/ml強(qiáng)力霉素+5%蔗糖)施用強(qiáng)力霉素。圖15.應(yīng)用圖13中描述的方案，C57BL/6小鼠的及時(shí)存活率。說(shuō)明文字示出了每組在方案開(kāi)始通過(guò)靜脈途徑接受的病毒劑量(以Vg/小鼠表示)。對(duì)照組不接受任何載體。使用時(shí)序檢驗(yàn)(GraphPad Prism軟件)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)評(píng)價(jià)(***ρ〈0· 001)。圖16.比較未處理小鼠的對(duì)照組⑷與經(jīng)過(guò)I X 106MC38細(xì)胞/小鼠皮下再次給藥處理的小鼠的腫瘤大小。括號(hào)內(nèi)(在B中)，示出了每只小鼠根據(jù)圖13描述的方案接受的病毒劑量，該劑量以vg表示。(C)示出了試驗(yàn)結(jié)束時(shí)(方案的第132天)通過(guò)不同組得到的腫瘤大小。括號(hào)內(nèi)，示出了每只小鼠根據(jù)圖13描述的方案接受的病毒劑量，該劑量以vg表不。圖17. CD8+/Tet+PBLs (MC38)的百分比。再次給藥后23天(圖13中所述方案的第113天)給小鼠抽血，獲得PBLs并用抗-CD8+抗體和加載MC38細(xì)胞特異性肽的四聚物標(biāo)記。使用FlowJo計(jì)算機(jī)程序分析Q)8+-MC38Tet+PBLs的百分比。用Student t_檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)評(píng)價(jià)(*P〈0. 05)。
圖18. MC38四聚物特異性及活化標(biāo)記物⑶44陽(yáng)性的腫瘤內(nèi)⑶8+淋巴細(xì)胞的百分t匕。已處理小鼠的組組合在一起，因?yàn)樗鼈冎g沒(méi)有顯著性差異(A)、B)和C)分別示出了關(guān)于對(duì)照組和已處理組的代表小鼠的點(diǎn)圖。用Student t_檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)評(píng)價(jià)O**p〈0. 001)。圖19.施用于雌性C57BL/6小鼠的治療性抗腫瘤處理的方案圖。在第O天，植入同源腫瘤系MC38細(xì)胞。7天后，向其中注射單劑量lX101QrAAV-pTetbidipAlb-mIL12病毒基因組(vg)，且留下一組沒(méi)有施用載體的小鼠(N=5)。15天后，腹腔內(nèi)注射施用強(qiáng)力霉素(50mg/Kg)起始對(duì)系統(tǒng)的誘導(dǎo)。接下來(lái)的一天，在飲用水中(2mg/ml強(qiáng)力霉素+5%鹿糖)繼續(xù)誘導(dǎo)，且維持隨后6天，之后分析兩組的存活。圖20.應(yīng)用圖19中描述的方案，C57BL/6小鼠隨時(shí)間的存活百分比。圖例示出了通過(guò)已處理動(dòng)物接受的病毒劑量(以vg/小鼠表示)。對(duì)照組不接受載體。使用時(shí)序檢驗(yàn)(GraphPad Prism 軟件)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)評(píng)價(jià)(***ρ〈0· 001)。發(fā)明詳述本發(fā)明的基因構(gòu)津體本發(fā)明作者已開(kāi)發(fā)出用于目的多核苷酸的表達(dá)系統(tǒng)，其允許在肝臟中所述多核苷酸時(shí)間及空間上的精確表達(dá)。為此，發(fā)明人使用與控制反式激活因子表達(dá)的第一肝特異性啟動(dòng)子和控制目的基因表達(dá)的第二肝特異性啟動(dòng)子相關(guān)的可激活的雙向操縱基因-啟動(dòng)子，存在誘導(dǎo)劑時(shí)所述反式激活因子激活所述雙向啟動(dòng)子的表達(dá)。在基礎(chǔ)狀態(tài)下(未誘導(dǎo))，肝特異性啟動(dòng)子指導(dǎo)反式激活因子和轉(zhuǎn)基因的少量表達(dá)，引起所謂的系統(tǒng)殘余表達(dá)。缺乏誘導(dǎo)劑時(shí)，反式激活因子不能與雙向啟動(dòng)子的操縱基因位點(diǎn)構(gòu)象地結(jié)合，因此，不能激活雙向啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。存在誘導(dǎo)劑時(shí)，后者與細(xì)胞中存在的殘余反式激活因子分子結(jié)合，產(chǎn)生構(gòu)象變化，以允許其與可誘導(dǎo)的雙向啟動(dòng)子-操縱基因結(jié)合并激活其轉(zhuǎn)錄。如此，誘導(dǎo)了轉(zhuǎn)基因和反式激活因子的表達(dá)。這些新合成的反式激活因子分子能與細(xì)胞游離的誘導(dǎo)劑結(jié)合并產(chǎn)生正反饋環(huán)，直到達(dá)到一種狀態(tài)，其中可能出現(xiàn)以下兩種情況(a)所有的操縱基因位點(diǎn)都被誘導(dǎo)劑-反式激活因子復(fù)合物分子占據(jù)；或(b)細(xì)胞的游離誘導(dǎo)劑耗盡，如果其沒(méi)有被過(guò)量施用，且合成的反式激活因子分子不能繼續(xù)與操縱基因位點(diǎn)結(jié)合。因此，施用誘導(dǎo)劑后，將開(kāi)始誘導(dǎo)步驟或誘導(dǎo)狀態(tài)。反式激活因子和轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平都取決于施用的誘導(dǎo)劑劑量。一旦移除誘導(dǎo)劑，反式激活因子恢復(fù)到其無(wú)活性構(gòu)象狀態(tài)，且不能有效地結(jié)合到操縱基因位點(diǎn)，其使轉(zhuǎn)基因表達(dá)降低直到恢復(fù)到起始或基礎(chǔ)狀態(tài)。當(dāng)誘導(dǎo)劑-反式激活因子復(fù)合物分子占據(jù)所有操縱基因位點(diǎn)時(shí)獲得最高表達(dá)。出乎預(yù)料地，本發(fā)明的作者已示出研發(fā)的載體允許誘導(dǎo)后的肝特異性表達(dá)，其達(dá)到比使用帶有更高基礎(chǔ)表達(dá)的啟動(dòng)子的載體獲得的更高水平表達(dá)。因此，盡管所描述誘導(dǎo)系統(tǒng)的最高表達(dá)迄今與基礎(chǔ)狀態(tài)下啟動(dòng)子的效能直接相關(guān)，但在本發(fā)明的系統(tǒng)中，其使用通常弱于普通CMV型啟動(dòng)子的組織特異性啟動(dòng)子，誘導(dǎo)后獲得與使用CMV相比較高的基礎(chǔ)表達(dá)。具體地，在本發(fā)明實(shí)施例2中，可觀察到，施用誘導(dǎo)劑后使用本發(fā)明的肝特異性系統(tǒng)獲得的報(bào)告基因的誘導(dǎo)率比使用基于普通CMV啟動(dòng)子的系統(tǒng)的誘導(dǎo)率高約85倍(見(jiàn)圖7)，其與 Zabala 等(Zabala, Μ.,等，Cancer Res. 2004; 64:2799-2804)獲得的結(jié)果不同，其中使用Palb啟動(dòng)子指導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)與使用巨細(xì)胞病毒最小的啟動(dòng)子的系統(tǒng)獲得的表達(dá)相t匕，引起了較低的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。而且，在誘導(dǎo)狀態(tài)下用于兩個(gè)系統(tǒng)的強(qiáng)力霉素劑量的差異、非常顯著。另一方面，由本發(fā)明的可誘導(dǎo)的肝特異性表達(dá)系統(tǒng)控制的報(bào)告基因肝內(nèi)表達(dá)與基于普通CMV啟動(dòng)子的系統(tǒng)控制的表達(dá)相比，其達(dá)到更高的熒光素酶活性誘導(dǎo)水平(見(jiàn)圖11)。因此，本發(fā)明的第一方面涉及一種基因構(gòu)建體，其允許目的多核苷酸響應(yīng)誘導(dǎo)劑的可誘導(dǎo)的肝特異性表達(dá)，該構(gòu)建體包含(i)可誘導(dǎo)的雙向操縱基因-啟動(dòng)子，其包含所述誘導(dǎo)劑的應(yīng)答元件，所述應(yīng)答元件兩側(cè)是第一肝特異性啟動(dòng)子序列和第二肝特異性啟動(dòng)子序列，其中兩個(gè)肝特異性啟動(dòng)子序列以不同方式定向，(ii)第一核苷酸序列，其包含編碼可以由所述誘導(dǎo)劑激活的反式激活因子的序列及位于相對(duì)于編碼反式激活因子區(qū)域3’端的聚腺苷酸化信號(hào)，其中編碼反式激活因子的序列可操作地連接到第一肝特異性啟動(dòng)子序列，以及(iii)第二核苷酸序列，其包含可操作地連接到第二肝特異性啟動(dòng)子序列的多核苷酸及位于相對(duì)于目的多核苷酸3’端的聚腺苷酸化信號(hào)，其中所述第一和第二肝特異性啟動(dòng)子序列的啟動(dòng)子活性由于誘導(dǎo)劑存在時(shí)反式激活因子與操縱基因-啟動(dòng)子的操縱基因區(qū)域結(jié)合而誘導(dǎo)。本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“基因構(gòu)建體”，是指單鏈或雙鏈核酸，其包含能夠被表達(dá)的區(qū)域，及可選地，在所述核酸之前(非編碼5’ -序列)或所述核酸之后(非編碼3’ -序列)的調(diào)控序列。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“基因構(gòu)建體”和“核酸構(gòu)建體”交換使用。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”是指基因或基因構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)RNA (rRNA.tRNA)或mRNA，隨后將所述RNA翻譯為蛋白質(zhì)或不翻譯。本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“可誘導(dǎo)的表達(dá)”，是指響應(yīng)激活劑/誘導(dǎo)劑表達(dá)可能增加。本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“目的多核苷酸”，是指與細(xì)胞或被導(dǎo)入細(xì)胞的受試者部分或完全異源的核酸序列，且由于存在相對(duì)于所述目的多核苷酸的5’或3’端的表達(dá)調(diào)控區(qū)域，核酸序列可被轉(zhuǎn)錄，且最終被翻譯以產(chǎn)生具有所需生物活性的多肽。術(shù)語(yǔ)“目的多核苷酸”不應(yīng)該僅被理解為能夠編碼多肽的多核苷酸，還可被用來(lái)指與細(xì)胞或被導(dǎo)入細(xì)胞的受試者的內(nèi)源多核苷酸部分或完全互補(bǔ)的核酸序列，這樣，在其轉(zhuǎn)錄后，它會(huì)產(chǎn)生能夠雜合(hibridisin)或抑制內(nèi)源多核苷酸表達(dá)的RNA分子(microRNA、shRNA或siRNA)。目的多核苷酸可以是DNA或cDNA。本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“誘導(dǎo)劑”是指能夠引起基因轉(zhuǎn)錄增加的任何分子。通常，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的有效控制下，響應(yīng)所述誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄，反之，轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域具有轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)合位點(diǎn)，存在所述誘導(dǎo)劑時(shí)轉(zhuǎn)錄激活因子的活性增加。因此，在本發(fā)明的文本中，因?yàn)槠渲改康幕虻霓D(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，使用的術(shù)語(yǔ)“誘導(dǎo)劑的應(yīng)答元件”是指轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)合位點(diǎn)，該轉(zhuǎn)錄激活因子通過(guò)與誘導(dǎo)劑結(jié)合其活性增加。優(yōu)選地，誘導(dǎo)劑是在體內(nèi)容易施用并分散的化合物，且激活系統(tǒng)的劑量是無(wú)害的。而且，誘導(dǎo)劑必需能夠滲入到所需組織或器官，且其半衰期為幾小時(shí)(不是分鐘或天)?？烧{(diào)控的雙向操縱基因-啟動(dòng)子本發(fā)明的基因構(gòu)建體的元件(a)包含可誘導(dǎo)的雙向操縱基因-啟動(dòng)子，其包含活性形式的反式激活因子的應(yīng)答元件，該應(yīng)答元件兩側(cè)是第一肝特異性啟動(dòng)子序列和第二肝特異性啟動(dòng)子序列，其中兩個(gè)肝特異性啟動(dòng)子序列以不同方式定向。
本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“可調(diào)控的雙向操縱基因-啟動(dòng)子”，是指存在給定信號(hào)時(shí)能夠從所述“操縱基因-啟動(dòng)子”的相反方向激活特定多核苷酸的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。術(shù)語(yǔ)“誘導(dǎo)劑的應(yīng)答元件”是指一個(gè)或多個(gè)順式作用的DNA元件且使啟動(dòng)子能夠激活響應(yīng)所述元件與轉(zhuǎn)錄因子或反式激活因子的DNA結(jié)合域相互作用的轉(zhuǎn)錄，存在誘導(dǎo)劑時(shí)誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄活性，通常的原因是結(jié)合誘導(dǎo)劑引起反式激活因子的構(gòu)象改變。因此，術(shù)語(yǔ)“誘導(dǎo)劑的應(yīng)答元件”必需理解為存在誘導(dǎo)劑時(shí)轉(zhuǎn)錄激活因子的應(yīng)答元件。轉(zhuǎn)錄因子或反式激活因子的DNA結(jié)合域，在存在或不存在誘導(dǎo)劑的情況下，都能與應(yīng)答元件的DNA序列結(jié)合，以啟動(dòng)或抑制位于相對(duì)于啟動(dòng)子3’端的基因的轉(zhuǎn)錄。術(shù)語(yǔ)“應(yīng)答元件”、“轉(zhuǎn)錄應(yīng)答元件”或TRE可互換地使用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可調(diào)控的雙向啟動(dòng)子-操縱基因包含至少一個(gè)可由抗生素激活的反式激活因子的應(yīng)答元件，優(yōu)選為四環(huán)素-應(yīng)答元件，且更優(yōu)選為包含可變拷貝數(shù)的42堿基對(duì)操縱基因序列(稱(chēng)為T(mén)etO)的四環(huán)素-應(yīng)答元件，如最初由Baron等所述(Nucleic Acids Res.，1995，17:3605-3606)。TetO 的拷貝數(shù)可至少為 2、至少為5或優(yōu)選地，不超過(guò)7。這種類(lèi)型的四環(huán)素-應(yīng)答元件可在存在反向四環(huán)素-激活的反式激活因子(或類(lèi)似物強(qiáng)力霉素)的情況下激活雙向轉(zhuǎn)錄，如最初由Gossen等所述(Science, 1995，278:1766-1769)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，反式激活因子+四環(huán)素的應(yīng)答元件包含7份操縱基因序列，這種情況下其被稱(chēng)為T(mén)et07。在更優(yōu)選的方案中，操縱基因-啟動(dòng)子包含序列SEQ ID NO : I或由其組成?；驑?gòu)建體的元件(a)還包含第一肝特異性啟動(dòng)子序列。本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子序列”，是指由宿主細(xì)胞識(shí)別的核酸序列并使激活位于所述啟動(dòng)子區(qū)域3’端的核酸序列的轉(zhuǎn)錄。通常，啟動(dòng)子序列含有允許目的多核苷酸表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“肝特異性”，是指轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子區(qū)域，其指所述區(qū)域能夠選擇性地激活肝細(xì)胞中或源于肝細(xì)胞的細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)錄。適合本發(fā)明的肝特異性啟動(dòng)子包括，但不限制于，α -I-抗胰蛋白酶(AAT)啟動(dòng)子、甲狀腺激素結(jié)合球蛋白啟動(dòng)子、α -甲胎蛋白啟動(dòng)子、醇脫氫酶啟動(dòng)子、IGF-II啟動(dòng)子、因子VIII (FVIII)啟動(dòng)子、HBV基礎(chǔ)核心蛋白啟動(dòng)子或BCP及PreS2啟動(dòng)子、甲狀腺素-結(jié)合球蛋白(TBG)啟動(dòng)子、肝臟控制區(qū)域(HCR)-Ap0CII的雜合啟動(dòng)子、HCR-hAAT雜合啟動(dòng)子、與小鼠白蛋白基因的增強(qiáng)子元件(Ealb)結(jié)合的AAT啟動(dòng)子、載脂蛋白E啟動(dòng)子、低密度脂蛋白啟動(dòng)子、丙酮酸激酶啟動(dòng)子、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶啟動(dòng)子、卵磷脂-膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)啟動(dòng)子、載脂蛋白H(ApoH)啟動(dòng)子、鐵傳遞蛋白啟動(dòng)子、甲狀腺素運(yùn)載蛋白啟動(dòng)子、α-纖維蛋白原及β_纖維蛋白原的啟動(dòng)子、α-I-抗糜蛋白酶啟動(dòng)子、α-2-HS糖蛋白啟動(dòng)子、觸珠蛋白啟動(dòng)子、血漿銅藍(lán)蛋白啟動(dòng)子、血纖維蛋白溶酶原啟動(dòng)子、補(bǔ)體蛋白(CIq、CIr、C2、C3、C4、C5、C6、C8、C9、補(bǔ)體的因子I及因子H)啟動(dòng)子、補(bǔ)體C3激活子的啟動(dòng)子、血液結(jié)合素啟動(dòng)子及α-I-酸性糖蛋白啟動(dòng)子?？稍诮M織特異性啟動(dòng)子數(shù)據(jù)庫(kù)TiProD中找到另外的組織特異性啟動(dòng)子(Nucleic AcidsResearch, J4:D104-D107 (2006))。可替代地，可使用包含肝特異性增強(qiáng)子和肝特異性啟動(dòng)子的雜合啟動(dòng)子。這種類(lèi)型的啟動(dòng)子包括肝臟控制區(qū)域(HCR)-Ap0CII的雜合啟動(dòng)子、HCR-hAAT雜合啟動(dòng)子、與小鼠白蛋白基因的增強(qiáng)子元件(Ealb)結(jié)合的AAT啟動(dòng)子及載脂蛋白E啟動(dòng)子、由小鼠白蛋白基因增強(qiáng)子(Ealb)和小鼠α-l-抗胰蛋白酶(AAT)的啟動(dòng)子(Ealb-AATp)形成的雜合啟動(dòng)子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一表達(dá)盒的一部分的肝特異性啟動(dòng)子是鼠源或人源的白 蛋白基因啟動(dòng)子。特別地，本發(fā)明考慮使用完整的白蛋白基因啟動(dòng)子(SEQ ID NO 2)或?qū)?yīng)于SEQ ID NO 2中限定的完整啟動(dòng)子的核苷酸113至196的所述啟動(dòng)子(SEQ ID NO 3)的最小區(qū)域。本發(fā)明考慮使用啟動(dòng)子的任何片段，其包括至少最小的啟動(dòng)子(SEQ ID Ν02的殘基113-196)。在本發(fā)明中，肝特異性啟動(dòng)子是那些在肝臟中的活性比在其它任何身體組織中活性都高的啟動(dòng)子。通常，肝特異性啟動(dòng)子在肝臟中的活性比在其它組織中高很多。例如，這種啟動(dòng)子在肝臟中的活性比在其它類(lèi)型細(xì)胞中可以高至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或至少10倍。所述啟動(dòng)子在肝源細(xì)胞與參照細(xì)胞中的活性對(duì)比可通過(guò)其指導(dǎo)在特定組織中的表達(dá)同時(shí)阻止在其它細(xì)胞或組織中的表達(dá)的能力測(cè)定。因此，肝特異性啟動(dòng)子允許基因在肝臟中的活性表達(dá)并阻止基因在其它細(xì)胞或組織中的表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)注意到第一和第二肝特異性轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子區(qū)域可以是相同的或不同的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，兩個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域是相同的。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子區(qū)域和第二轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子區(qū)域都包含白蛋白基因啟動(dòng)子。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，形成第一和/或第二轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子區(qū)域的白蛋白基因啟動(dòng)子包含選自SEQ ID NO :2與SEQID NO 3的序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可調(diào)控的雙向啟動(dòng)子-操縱基因包含由7個(gè)反式激活因子的結(jié)合位點(diǎn)組成的四環(huán)素-應(yīng)答元件，反式激活因子可由誘導(dǎo)劑激活，誘導(dǎo)劑優(yōu)選為四環(huán)素，應(yīng)答元件兩側(cè)為以不同方式定向的兩個(gè)白蛋白基因啟動(dòng)子。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含Tet07操縱基因和兩個(gè)白蛋白啟動(dòng)子的所述操縱基因-啟動(dòng)子包含SEQ ID N0:4序列。具有肝特異性啟動(dòng)子活性的序列與操縱基因區(qū)域以不同方式定向排列。本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“不同方向”，是指肝特異性啟動(dòng)子，指啟動(dòng)子對(duì)，其中由啟動(dòng)子對(duì)的第一啟動(dòng)子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活發(fā)生在一條DNA分子鏈上，從而允許RNA聚合酶以5’-3’方向作用，而第二啟動(dòng)子在相反鏈上作用，導(dǎo)致RNA聚合酶在相反方向的置換，其中其與第一啟動(dòng)子共同作用。組成本發(fā)明基因構(gòu)建體的雙向操縱基因-啟動(dòng)子的元件以這種方式構(gòu)成，S卩，存在誘導(dǎo)劑時(shí)，反式激活因子與操縱基因-啟動(dòng)子的操縱基因區(qū)域結(jié)合，因此誘導(dǎo)第一和第二肝特異性啟動(dòng)子序列的啟動(dòng)子活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)注意到所述轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子活性的誘導(dǎo)，除其它因素，將取決于操縱基因元件和肝特異性啟動(dòng)子序列的距離。優(yōu)選地，操縱基因和第一或第二啟動(dòng)子序列的距離可在O至30個(gè)核苷酸之間變化，更優(yōu)選地在O至20個(gè)核苷酸之間變化，甚至更優(yōu)選，在O至15個(gè)核苷酸之間變化。本發(fā)明基因構(gòu)建體的第一核苷酸序列本發(fā)明基因構(gòu)建體的元件(b)是核苷酸序列，其包含編碼可以由所述誘導(dǎo)劑激活的反式激活因子的序列，該序列可操作地連接到第一肝特異性啟動(dòng)子序列，及位于相對(duì)于編碼反式激活因子的區(qū)域3’端的聚腺苷酸化信號(hào)。本發(fā)明中互換使用的術(shù)語(yǔ)“核苷酸序列”、“核酸”及“多核苷酸”是指核糖核苷(腺苷、鳥(niǎo)苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脫氧核糖核苷(脫氧腺苷、脫氧鳥(niǎo)苷、脫氧胸苷或脫氧胞苷；“DNA分子”)的磷酸酯的聚合物形式，或其任何類(lèi)似的磷酸酯，諸如單鏈或雙鏈形式的硫代磷酸酯及硫酯。因此，由DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA組成的螺旋是可能的。術(shù)語(yǔ)“核酸序列”，特別是DNA或RNA分子，僅指分子的一級(jí)或二級(jí)結(jié)構(gòu)，且不限制任何特定類(lèi)型的三級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，這個(gè)術(shù)語(yǔ)包括雙鏈DNA，如以線狀或環(huán)狀DNA分子、超螺旋DNA質(zhì)粒及染色體呈現(xiàn)。本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“可以被誘導(dǎo)劑激活的反式激活因子”是指多肽，S卩，當(dāng)其與所述誘導(dǎo)劑結(jié)合時(shí)，通過(guò)在所述基因的非編碼區(qū)與所述多肽的特定識(shí)別區(qū)域相結(jié)合能夠促進(jìn)給定基因的轉(zhuǎn)錄，即其活性可通過(guò)其它因子調(diào)節(jié)，根據(jù)促進(jìn)包含所述調(diào)節(jié)子的特異性結(jié)合位點(diǎn)的基因轉(zhuǎn)錄的需要，提供或除去所述因子。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)注意到由本發(fā)明第一核苷酸序列編碼的反式激活因子能夠與包含所述誘導(dǎo)劑的應(yīng)答元件的操縱基因-啟動(dòng)子的區(qū)域結(jié)合，以致存在誘導(dǎo)劑時(shí)，反式激活因子與操縱基因-啟動(dòng)子的操縱基因區(qū)域結(jié)合后，反式激活因子激活所述第一和第二肝特異性啟動(dòng)子序列的轉(zhuǎn)錄。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)注意到本發(fā)明考慮到調(diào)控轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子表達(dá)的任何方法，只要其允許最低基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄的調(diào)控表達(dá)。特別地，本發(fā)明考慮到轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的用途，不通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子表達(dá)水平的增加產(chǎn)生誘導(dǎo)，而通過(guò)響應(yīng)誘導(dǎo)劑結(jié)合的構(gòu)象變化，其可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子易位至細(xì)胞核，在細(xì)胞核中發(fā)揮作用或增加轉(zhuǎn)錄活性。這種類(lèi)型的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子通常由DNA結(jié)合域或DBD,配體結(jié)合域或LBD及轉(zhuǎn)錄激活域或AD組成。DNA結(jié)合域可以是任何具有已知特定結(jié)合元件的結(jié)合域，包括合成的、嵌合的或類(lèi)似的DNA結(jié)合域。適合本發(fā)明的DNA結(jié)合域包括(i)同源異型域(Scott等，1989, Biochim. Biophys. Acta 989:25-48; Rosenfeld 等，1991，Genes Dev. 5:897-907)，其通常由大約 61 個(gè)氨基酸的鏈組成，呈現(xiàn)由3個(gè)α -螺旋組成的二級(jí)結(jié)構(gòu)，(ii)由24至36個(gè)DNA指結(jié)構(gòu)及通式Cys2His2串聯(lián)排列組成的鋅指結(jié)構(gòu)(例如，TFIIIA、Zif268、Gli及SRE-ZBP)，其中每個(gè)組件包含能與3至5個(gè)堿基對(duì)的DNA區(qū)域接觸的α -螺旋，至少3個(gè)鋅指對(duì)于產(chǎn)生高親和性DNA結(jié)合位點(diǎn)是必須的，及至少2個(gè)鋅指對(duì)于產(chǎn)生低親和性DNA結(jié)合位點(diǎn)是必須的，
(iii)稱(chēng)為螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋或HLH的DNA結(jié)合域，諸如TetR、ΜΑΤΙ、ΜΑΤ2、MATal、觸足蛋白、超級(jí)雙胸基因(Ultrabithorax)、波紋(Engrailed)、Paired、Fushi tarazu、H0X、Unc86、 OctU 0ct2 及 Pit-1, (iv)亮氨酸拉鏈類(lèi)型的 DNA 結(jié)合域,諸如 GCN4、C/EBP、c-Fos/c-Jun 與JunB。適合本發(fā)明的DNA結(jié)合域的實(shí)例包括GAL4、LexA、轉(zhuǎn)錄因子、H組核受體、類(lèi)固醇 /甲狀腺激素超 家族核受體的DNA結(jié)合域。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)注意到本發(fā)明考慮到由幾個(gè)DNA結(jié)合基序組成的雜合DNA結(jié)合域的用途，所述基序可識(shí)別不同于組成自身的元件的 DNA結(jié)合位點(diǎn)。因此，可能使用由鋅指與同源異型框結(jié)合形成的DNA結(jié)合域。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，DNA結(jié)合域是由大腸桿菌的Tet轉(zhuǎn)錄阻遏物中獲得的。適合本發(fā)明使用的能夠促進(jìn)轉(zhuǎn)錄激活子的核定位的配體結(jié)合序列包括存在15-脫氧-δ-前列腺素J2時(shí)移位至細(xì)胞核的PPAR-衍生的定位序列(受體由過(guò)氧化物酶激活子激活)，存在9-順式維甲酸的a、β或Y異構(gòu)體時(shí)移位至細(xì)胞核的維甲酸受體，可由維甲酸和TTNPB激活的類(lèi)法尼醇X受體，可由24-羥基膽固醇激活的肝X受體，可由4-氨基-苯甲酸丁酯激活的苯甲酸鹽X受體，組成型雄烷受體，可由孕烯醇酮-16-腈誘導(dǎo)的孕甾(pregnan)受體，可由甲哌力復(fù)霉素誘導(dǎo)的類(lèi)固醇和異生物素的受體，可由甲羥孕酮激活的孕酮受體，以及米非司酮的激動(dòng)劑和拮抗劑與 19-去甲睪酮的衍生物，可由糖皮質(zhì)激素激活的糖皮質(zhì)激素受體，可由T3和/或T4激活的甲狀腺激素受體，及可由雌激素及其衍生物，諸如17-β-雌二醇和雌二醇激活的雌激素受體，可由“tet-off”四環(huán)素/強(qiáng)力霉素激活的tTA反式激活因子(Gossen和 Bujard, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551),可由 “tet-on” 四環(huán)素激活的rtTA反式激活因子(Gossen等,1995, Science, 268:1766-1769),可由米樂(lè)留酮A或類(lèi)似蛻皮激素受體的配體誘導(dǎo)的反式激活因子(No等，1996，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，93:3346-3351)，可由RSLl配體激活的反式激活因子，諸如Palli等最初描述的 RheoSwitch 系統(tǒng)(2003, Eur. J. Biochem. , 270:1308-1315),可由雷帕霉素或雷帕霉素類(lèi)似物激活的反式激活因子(Ho 等，1996, Nature, 382:822-826; Amara 等，1997，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:10618-10623)，及可由香豆霉素/新生霉素激活的反式激活因子， 其中香豆霉素與新生霉素分別競(jìng)爭(zhēng)性地作為誘導(dǎo)劑和阻遏物(Zhao等，2003, Hum. Gene Ther.，14:1619-1629)。最后，轉(zhuǎn)錄激活域可以是酸性激活域、富含·脯氨酸的激活域、富含絲氨酸/蘇氨酸的激活域及富含谷氨酰胺的激活域。酸性激活域的實(shí)例包括由氨基酸753-881組成的VP16 區(qū)域和GAL4區(qū)域。富含脯氨酸的轉(zhuǎn)錄激活域的實(shí)例包括CTF/NF1的氨基酸399-499及AP2 的氨基酸31-76。富含絲氨酸/蘇氨酸的激活域的實(shí)例包括ITFl的氨基酸1-427及ITF2 的氨基酸2-452。富含谷氨酰胺的激活域的實(shí)例包括Octl的氨基酸175-269及Spl的氨基酸132-243。每個(gè)所述區(qū)域的序列，以及其它轉(zhuǎn)錄激活域，已由Seipel，K.等描述(ΕΜΒ0 J. (1992) 13:4961-4968)。此外，可使用本領(lǐng)域已知的方法從上面提到的激活域中獲得其它轉(zhuǎn)錄激活域。此外，激活域可以是H組核受體、甲狀腺或類(lèi)固醇激素的核受體的激活域， VP16、GAL4、NF- κ B、Β42、ΒΡ64 或 ρ65 的激活域。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄激活域是單純性皰疹病毒粒子(以下稱(chēng)為 VP16)的蛋白質(zhì)16,其氨基酸序列已經(jīng)由Triezenberg, S. J.，等所描述(Genes Dev.，1988, 2:718-729) ο這種結(jié)構(gòu)域可以由VP16的C-末端的約127個(gè)氨基酸組成。 可替代地，轉(zhuǎn)錄激活域可以由VP16的C-末端區(qū)域的11氨基酸組成，其仍然具有激活轉(zhuǎn)錄的能力。適合用作轉(zhuǎn)錄激活域的VP16的C-末端區(qū)域如Seipel, K.等所述(ΕΜΒ0 J. (1992) 13:4961-4968)。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄激活子包含由13個(gè)氨基酸和序列 PADALDDFDLDML(SEQ ID NO 5)組成的所述蛋白質(zhì)的最小區(qū)域，如Baron等所述(Nucleics Acids. Res.，1997，25:2723-2729)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄激活子是可以由四環(huán)素或其類(lèi)似物激活的轉(zhuǎn)錄激活子。本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“四環(huán)素類(lèi)似物”，是指與四環(huán)素結(jié)構(gòu)相關(guān)的化合物，其能夠在至少約IO-6M-1的Ka與四環(huán)素阻遏物結(jié)合。優(yōu)選地，四環(huán)素類(lèi)似物對(duì)至少 IO-9M-1的TetR有親和性。適合本發(fā)明的四環(huán)素類(lèi)似物的實(shí)例包括，但不限于，無(wú)水四環(huán)素、強(qiáng)力霉素(Dox)、金霉素、土霉素、差向土霉素、氰基四環(huán)素、地美環(huán)素、甲氯環(huán)素、甲烯土霉素及其它如Hlavka和Boothe所述，在“Handbook of Experimental Pharmacology” 78 中的"The Tetracyclines " , R. K. Blackwood 等(eds. )，Spr inger-Verlag, Berlin-New York, 1985;L. A. Mitscher, " The Chemistry of the Tetracycline Antibiotics " , Medicinal Research 9,Dekker,N. Y. , 1978;Noyee Development Corporation, " Tetracycline Manufacturing Processes " , Chemical Process Reviews, Park Ridge, N. J. , 2volumes, 1969;R.C.Evans, " The Technology of the Tetracyclines " , Biochemical Reference Series I,Quadrangle Press,New York, 1968;和 H. F. Dowling, " Tetracycline" , Antibiotic Monographs, no. 3, Medical Encyclopedia, New York, 1955。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可由四環(huán)素激活的反式激活因子可以是所謂的反向四環(huán)素阻遏蛋白、或反向tetR，是指多肽，其⑴顯示了對(duì)于誘導(dǎo)劑的特異性親和力，(ii)當(dāng)與誘導(dǎo)劑結(jié)合時(shí)，顯示了對(duì)于tet-型應(yīng)答元件的特異性親和力，及(iii)不與誘導(dǎo)劑結(jié)合時(shí)，從 tet元件分離。這種激活子包括其自然形式及功能衍生物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可由四環(huán)素調(diào)控的激活子可以是所謂的反向四環(huán)素-依賴(lài)型反式激活因子(rtTA)，其特征在于，存在四環(huán)素或其類(lèi)似物時(shí)，發(fā)生構(gòu)象變化使其變成轉(zhuǎn)錄激活子，而在不存在四環(huán)素時(shí)其失活。 如此，防止了與源于大腸桿菌的tetR阻遏物的反式激活因子相關(guān)的問(wèn)題，不存在四環(huán)素時(shí)反式激活因子能夠激活具有四環(huán)素-應(yīng)答元件的基因的轉(zhuǎn)錄，且存在四環(huán)素時(shí)反式激活因子停止激活轉(zhuǎn)錄。優(yōu)選地，反向四環(huán)素-依賴(lài)型反式激活因子(rtTA)包括rtTA反式激活因子或任何Urlinger, S.,等所述的rtTA變體(Proc. Natl. Acad. Sci USA, 2000; 97:7963 -7968)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，rtTA變體是已知變體rtTA-M2，其特征在于，使其激活所需的強(qiáng)力霉素濃度比所需的原始rtTA濃度低10倍。rtTA-M2反式激活因子是由多核苷酸和序列SEQ ID NO :6編碼的多肽。本發(fā)明基因構(gòu)建體的第一核苷酸序列的元件(b)還包含位于相對(duì)于編碼反式激活因子的多核苷酸3’端的聚腺苷酸化序列。本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“聚腺苷酸序列”或“聚腺苷酸化信號(hào)”，是指含有轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的核酸，且當(dāng)其出現(xiàn)在RNA轉(zhuǎn)錄物時(shí)，在存在具有聚腺嘌呤轉(zhuǎn)移酶活性的酶時(shí)使所述轉(zhuǎn)錄物聚腺苷酸化。如本文所使用的“聚腺苷酸化”，是指在mRNA的3’末端添加聚腺嘌呤尾巴。適合本發(fā)明使用的聚腺苷酸化信號(hào)包括，但不限于， SV40早期-后期聚腺苷酸化信號(hào)、HSV胸苷激酶的聚腺苷酸化信號(hào)、魚(yú)精蛋白基因的聚腺苷酸化信號(hào)、腺病毒5EIb的聚腺苷酸化信號(hào)、牛生長(zhǎng)激素的聚腺苷酸化信號(hào)、人生長(zhǎng)激素變體及相似物的聚腺苷酸化信號(hào)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚腺苷酸化信號(hào)是雙向聚腺苷酸化信號(hào)。當(dāng)使用病毒載體表達(dá)本發(fā)明基因構(gòu)建體時(shí)使用雙向聚腺苷酸化信號(hào)是特別有利的，其中終止序列具有特的的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子活性(特別是AAVs、慢病毒)。如此，防止其被可誘導(dǎo)的系統(tǒng)干擾，從而降低基礎(chǔ)活性。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，雙向聚腺苷酸化信號(hào)對(duì)應(yīng)于SV40聚腺苷酸化信號(hào)。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，SV40聚腺苷酸化信號(hào)包含序列SEQ ID NO :7。
_4] 本發(fā)明基因構(gòu)建體的第二核苷酸序列本發(fā)明基因構(gòu)建體還包含操作地連接到第二肝特異性啟動(dòng)子序列的多核苷酸及位于相對(duì)于目的多核苷酸3’端的聚腺苷酸化信號(hào)。術(shù)語(yǔ)“核苷酸序列”、“多核苷酸”、“肝特異性啟動(dòng)子序列”、“可操作的控制”及“聚腺苷酸化信號(hào)”如上定義且以和第一核苷酸表達(dá)序列中相同的方式用于第二核苷酸序列。 本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“目的多核苷酸”，是指出于不同目的進(jìn)行操縱的DNA序列，且其包括 DNA、cDNA、基因組DNA、RNA或核酸類(lèi)似物，以及能夠產(chǎn)生蛋白質(zhì)或RNA分子的相應(yīng)的反義分子，諸如，例如，以非限制的方式，小干擾RNA(siRNA)、短環(huán)RNA(shRNA)或核酶。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，目的多核苷酸編碼多肽。這種多肽可以是熒光素酶報(bào)告基因型的基因編碼的多肽、綠色熒光蛋白(GFP)、GFP(EGFP、YFP或BFP)變體、堿性磷酸酶、 β -半乳糖苷酶、β -葡糖苷酸酶、鄰苯二酚脫氫酶?？商娲?，目的多核苷酸編碼多肽，其在肝臟或肝細(xì)胞中的表達(dá)對(duì)肝病的修復(fù)是有益的，將從所述多肽的表達(dá)獲益。因此，適合用于治療肝變化的多肽包括，但不限于干擾素α及，具體地，選自由IFN-α 2a、IFN-a 2b、IFN-α 4、IFN-α 5、IFN-α 8組成的組中的 IFN-α、制瘤素、心肌營(yíng)養(yǎng)素、IL-6、IGF-I及其變體、雙調(diào)蛋白、IL_15、IL_12、CD134、CD137、 PB⑶、抗體、TGF-β I抑制劑，諸如國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)W00031135、W0200519244和W00393293中描述的肽Ρ17和Ρ144，通過(guò)引用將上述申請(qǐng)納入本文，IL-10抑制劑、FoxP3抑制劑、TNFa 抑制劑、VEGF抑制劑、PD-I抑制劑和CD 152抑制劑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，目的多核苷酸編碼IL-12或其同功能變體。白細(xì)胞介素-12(IL-12)是主要由巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞分泌的I型細(xì)胞因子，包括天然IL-12和以重組方式制備的IL-12，且白細(xì)胞介素-12能夠通過(guò)多種機(jī)制增強(qiáng)抗腫瘤免疫力，所述機(jī)制包括(1)增加細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的應(yīng)答，(2)激活溶細(xì)胞性自然殺傷細(xì)胞(NK，自然殺傷)，(3)強(qiáng)化溶細(xì)胞性自然殺傷細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的增殖，(4)誘導(dǎo)I型輔助性T細(xì)胞 (Thl，輔助性Tl)子系列的極化(5)誘導(dǎo)抗血管生成作用。多數(shù)這些作用是通過(guò)溶細(xì)胞性自然殺傷細(xì)胞和活化的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生和分泌干擾素-Y (INF-y)介導(dǎo)的。細(xì)胞因子IL-12是由重鏈(p40)和輕鏈(p35)組成的異源二聚體。人源重鏈和輕鏈的序列如 Gubler 等所述(Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 1991，88:4143)。如果輕鏈?zhǔn)峭庠刺峁┑?，目的多核苷酸可以編碼重鏈，如果重鏈?zhǔn)峭庠刺峁┑?，目的多核苷酸可以編碼輕鏈，或其可以編碼兩種鏈。編碼IL-12的多核苷酸生成單一 RNA，其包含兩個(gè)由內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)隔開(kāi)的開(kāi)放閱讀框，內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)使來(lái)自每個(gè)開(kāi)放閱讀框的每條鏈表達(dá)。優(yōu)選地，編碼IL-12的多核苷酸包含編碼融合蛋白的單一開(kāi)放閱讀框，融合蛋白包含通過(guò)連接子相互結(jié)合的輕鏈和重鏈，如W09624676 中和Lieschke G. J.等所述(Nat Biotechnol. 1997，15:35-40)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，編碼單鏈IL-12的多核苷酸包含序列SEQ ID NO :8。
本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“同功能變體”是指與IL-12序列相差一個(gè)或多個(gè)插入、缺失或取代的多肽，但其實(shí)質(zhì)上保持IL-12的生物活性。適合用于本發(fā)明的IL-12的同功能變體與所述細(xì)胞因子的序列同一性為至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的計(jì)算機(jī)算法和方法測(cè)定變體和免疫刺激細(xì)胞因子的同源度。優(yōu)選地使用BLASTP算法測(cè)定兩個(gè)氨基酸序列的同一性[BLASTManual，Altschul, S.，等，NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S.,等，J Mol Biol, 215:403-410 (1990)]。可監(jiān)測(cè)IL-12的功能以確定給定多肽是否是IL-12的變體，所述功能包括，但不限于，Thl細(xì)胞中分化未成熟T細(xì)胞，刺激T細(xì)胞的生長(zhǎng)和功能，通過(guò)NK (自然殺傷)細(xì)胞合成IFN-Y和 TNF-α，減少I(mǎi)L-4-介導(dǎo)的IFN-Y抑制作用，增加NK細(xì)胞和⑶8+淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒活性， 刺激IL-12受體的β I和β 2鏈的表達(dá)及抗血管生成活性。優(yōu)選地,通過(guò)測(cè)量增加抗腫瘤免疫力的能力以測(cè)定變體的IL-12活性，例如，通過(guò)如Zabala，M.等，2007所述的試驗(yàn)[J Hepatology, vol. 47(6):807-815]。本發(fā)明的載體、病毒基因組及病毒粒子
本發(fā)明的基因構(gòu)建體可以分離的形式呈現(xiàn)。然而，為了促進(jìn)其操縱和增殖，有利的是將構(gòu)建體納入載體中。因此，本發(fā)明的另一方面涉及包含本發(fā)明基因構(gòu)建體的載體。本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“載體”是指多核苷酸或DNA分子被操縱或?qū)爰?xì)胞所憑借的媒介。載體可以是線狀或環(huán)狀多核苷酸，或其可以是較大尺寸的多核苷酸或任何其它類(lèi)型結(jié)構(gòu)，諸如來(lái)自病毒基因組、病毒粒子或任何其它可以操縱DNA或?qū)⑵鋵?dǎo)入細(xì)胞的生物構(gòu)建體的DNA或RNA。據(jù)了解，術(shù)語(yǔ)“重組載體”和“重組系統(tǒng)”可以與術(shù)語(yǔ)“載體”互換使用。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)注意到對(duì)于可使用的載體類(lèi)型沒(méi)有限制，因此所述載體可以是適于增殖的克隆載體并獲得足夠的多核苷酸或在不同異源生物體中適于共軛物純化的基因構(gòu)建體或表達(dá)載體。因此，根據(jù)本發(fā)明的合適載體包括原核生物中的表達(dá)載體，諸如pUC18、pUC19、 Bluescript 及其衍生物、mpl8、mpl9、pBR322、pMB9、CoIEl、pCRl、RP4、噬菌體及“穿梭”載體，諸如PSA3和pAT28，酵母中的表達(dá)載體，諸如2 μ m質(zhì)粒型載體、整合質(zhì)粒、YEP載體、著絲粒質(zhì)粒及其相似物，昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)載體，諸如PAC和pVL系列中的載體，植物中的載體，諸如來(lái)自 pIBI、pEarleyGate、pAVA、pCAMBIA、pGSA、pGWB、pMDC、pMY、pORE 系列及其相似物的載體，及基于病毒載體(腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒及逆轉(zhuǎn)錄酶病毒和慢病毒載體)與非病毒載體的真核細(xì)胞中的表達(dá)載體，所述非病毒載體諸如pSilencer 4. I-CMV(Ambion)、 pcDNA3、pcDNA3. 1/hyg、pHCMV/Zeo、pCR3. I、pEFl/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、 pTRACER-HCMV、pUB6/V5_His、pVAXl、pZeoSV2、pCI、pSVL 和 pKSV-10、pBPV-1、pML2d 和 pTDTl。本發(fā)明的載體可用于轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染易于被所述載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染的細(xì)胞。 所述細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。舉例來(lái)說(shuō)，將DNA序列導(dǎo)入其中的載體可以是質(zhì)粒或載體，當(dāng)其導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，其被整合到所述細(xì)胞基因組并與整合為一體的染色體共同復(fù)制?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法獲得所述載體(Sambrook等，2001，如上所述)。因此，本發(fā)明的另一方面涉及包含本發(fā)明的多核苷酸、基因構(gòu)建體或載體的細(xì)胞； 為此，所述細(xì)胞由本發(fā)明提供的構(gòu)建體或載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法獲得轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染的細(xì)胞(Sambrook等，2001，如上所述)。在特定實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是由合適的載體轉(zhuǎn)染或感染的動(dòng)物細(xì)胞。 適用于本發(fā)明的共軛物表達(dá)的宿主細(xì)胞包括，但不限于，哺乳動(dòng)物、植物、昆蟲(chóng)、真菌和細(xì)菌的細(xì)胞。細(xì)菌細(xì)胞包括，但不限于，革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞，諸如芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬和葡萄球菌屬的菌種，革蘭氏陰性菌細(xì)胞，諸如埃希氏菌屬和假單胞菌屬的細(xì)胞。真菌細(xì)胞優(yōu)選地包括酵母菌細(xì)胞，諸如酵母屬、畢赤酵母和漢遜酵母。昆蟲(chóng)細(xì)胞包括但不限于，果蠅細(xì)胞和Sf9細(xì)胞。植物細(xì)胞包括，其中包括，栽培植物細(xì)胞，諸如谷物，藥用植物，觀賞植物或鱗莖。適用于本發(fā)明的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括上皮細(xì)胞系(豬的，等等)、骨肉瘤細(xì)胞系(人的，等等)、神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(人的，等等)、上皮細(xì)胞癌(人的，等等)、膠質(zhì)細(xì)胞(鼠的， 等等)、肝細(xì)胞系(猴子的，等等)、CHO(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢)細(xì)胞、COS細(xì)胞、BHK細(xì)胞、HeLa, 911、AT1080、A549、293 或 PER. C6 細(xì)胞、人 NTERA-2ECC 細(xì)胞、mESC 系的 D3 細(xì)胞、人類(lèi)胚胎干細(xì)胞，諸如 HS293 和 BGVOU SHEFU SHEF2 和 HS181、NIH3T3、 293T、REH 和 MCF-7 細(xì)胞，及 hMSC細(xì)胞。可替代地，本發(fā)明的基因構(gòu)建體可以是重組病毒基因組的一部分。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含根據(jù)本發(fā)明的基因構(gòu)建體的重組病毒基因組。本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“病毒基因組”，是指病毒的遺傳補(bǔ)體，無(wú)論是否完整或以這樣的方式操縱，去除非必要元件且保留必要元件，從而保持將目的核苷酸序列感染、轉(zhuǎn)導(dǎo)及導(dǎo)入靶細(xì)胞的足夠功能性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含本發(fā)明構(gòu)建體的病毒基因組是重組腺相關(guān)病毒的基因組。如本文所使用的術(shù)語(yǔ)“腺相關(guān)病毒”(AVV)包括AAV的任何血清型。通常，AAV血清型具有在氨基酸和核酸水平上顯著同源性的基因組序列，提供了相同系列的遺傳功能， 產(chǎn)生物理和功能上本質(zhì)上相同的病毒粒子，且通過(guò)幾乎相同的機(jī)制復(fù)制并組裝。特別地， 可使用 AAV 血清型 I (AAVl)、AAV2、AAV3 (包括 3A 型和 3B 型)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、 AAV8、AAV9、AAVlO、AAV11、鳥(niǎo)AAV、牛AAV、犬AAV、馬AAV、羊AAV，及任何其它目前已知或可能在未來(lái)發(fā)現(xiàn)的AAV進(jìn)行本發(fā)明。參見(jiàn)，例如，F(xiàn)ields等，Virology, volume 2, chapter 69 (4th ed.，Lippincott-Raven Publishers)。近期，已確定許多由AAV克隆的公認(rèn)的新血清型(參見(jiàn)例如，Gao 等，(2004) J. Virology 78:6381-6388;Moris 等，(2004) Virology 33:375-383)。幾種AAV血清型和自主性細(xì)小病毒的基因組序列，以及反向末端重復(fù)序列(ITR)、Rep蛋白與衣殼亞基序列在本領(lǐng)域是已知的?？稍谖墨I(xiàn)或公共數(shù)據(jù)庫(kù)諸如 GenBank 中找到這些序列。參見(jiàn)例如，GenBank 登錄號(hào) NC_002077、NC_001401、NC_001729、 NC_001863、NC_001829、NC_001862、NC_000883、NC_001701、NC_001510、NC_006152、 NC_006261、AF063497、U89790、AF043303、AF028705、AF028704、J02275、J01901、J02275、 X01457、AF288061、AH009962、AY028226、AY028223、NC_001358、NC_001540、AF513851、 AF513852、AY530579 ;這些信息通過(guò)引用納入本文中以用于研究細(xì)小病毒和AAV的核酸序列和氨基酸序列。還參見(jiàn)，例如，Srivistava 等(1983), J. Virology 45:555; Chiorini 等 (1998).J. Virology 71:6823 ;Chiorini 等(1999), J. Virology 73:1309;Bantel-Schaal 等(1999)，J. Virology 73:939 ;Xiao 等(1999)，J. Virology 73:3994 ；Muramatsu 等 (1996),Virology 221:208 ; Shade 等(1986)，J. Virol. 58:921 ;Gao 等(2002). Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99:11854 ;Moris 等(2004), Virology 33: 375-383 ;國(guó)際專(zhuān)利
發(fā)明者格洛麗亞·岡薩雷斯阿塞古伊諾拉薩, 赫蘇斯瑪麗亞·普列托巴爾圖埃納, 露西婭瑪麗亞·班雷利馬霍 申請(qǐng)人:西馬生物醫(yī)學(xué)計(jì)劃公司