專利名稱：含有a型流感特異性啟動子的重組細胞及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中含有A型流感特異性啟動子的重組細胞及其應(yīng)用。
技術(shù)背景
流感病毒(influenza virus)基因組由8段分段的RNA組成，每一段病毒RNA和 病毒的NP蛋白及聚合酶復合體(PA，PBl, PB2)組成病毒核蛋白復合體(vRNP)。每一段病 毒RNA都包括編碼區(qū)和兩端的非編碼區(qū)(UTR)組成，非編碼區(qū)3’的12個堿基和5’端的13 個堿基在八個片段中是高度保守的，這兩段保守堿基部分互補，形成一個部分配對的結(jié)構(gòu)， 對于病毒的轉(zhuǎn)錄和復制都是必須的，稱為流感病毒的啟動子。
熒光酶編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列4所示。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供如下重組質(zhì)粒在制備檢測流感病毒的試劑盒中的應(yīng)用； 或，如下重組細胞在制備檢測流感病毒的試劑盒中的應(yīng)用
所述重組質(zhì)粒是在出發(fā)表達載體的多克隆位點間插入如下融合基因，得到的重組 質(zhì)粒；
所述融合基因，是由片段1、報告基因和片段2依次連接構(gòu)成的融合基因；片段1 的核苷酸序列為 AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAA，片段 2 的核苷酸序 列為 AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT ；
所述重組細胞，是向出發(fā)細胞中轉(zhuǎn)入所述重組質(zhì)粒，得到的重組細胞。
本發(fā)明的另一個目的是提供如下重組質(zhì)粒在制備篩選抗流感病毒藥物的試劑盒 中的應(yīng)用；或，如下重組細胞在制備篩選抗流感病毒藥物的試劑盒中的應(yīng)用
所述重組質(zhì)粒是在出發(fā)表達載體的多克隆位點間插入如下融合基因，得到的重組 質(zhì)粒；
所述融合基因，是由片段1、報告基因和片段2依次連接構(gòu)成的融合基因；片段1 的核苷酸序列為 AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAA，片段 2 的核苷酸序 列為 AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT ；
所述重組細胞，是向出發(fā)細胞中轉(zhuǎn)入所述重組質(zhì)粒，得到的重組細胞。
本發(fā)明的又一個目的是提供如下重組質(zhì)粒在篩選抗流感病毒藥物中的應(yīng)用；或， 如下重組細胞在篩選抗流感病毒藥物中的應(yīng)用
所述重組質(zhì)粒是在出發(fā)表達載體的多克隆位點間插入如下融合基因，得到的重組 質(zhì)粒；
所述融合基因，是由片段1、報告基因和片段2依次連接構(gòu)成的融合基因；片段1 的核苷酸序列為 AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAA，片段 2 的核苷酸序 列為 AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT ；
所述重組細胞，是向出發(fā)細胞中轉(zhuǎn)入所述重組質(zhì)粒，得到的重組細胞。
所述報告基因為熒光素酶編碼基因；
所述出發(fā)表達載體為pR印4載體；
所述出發(fā)細胞為Hela細胞；
所述流感病毒為A/WSN/33流感病毒；
所述融合基因的核苷酸序列如序列表中序列3自5'末端第14到1734位所示。
本發(fā)明的又一個目的是提供一種重組細胞。
本發(fā)明所提供的重組細胞，是向出發(fā)細胞中轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒，得到的重組細胞；所述 重組質(zhì)粒是在出發(fā)表達載體的多克隆位點間插入如下融合基因，得到的重組質(zhì)粒；
所述融合基因，是由片段1、報告基因和片段2依次連接構(gòu)成的融合基因；片段1 的核苷酸序列為 AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAA，片段 2 的核苷酸序 列為 AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT。
所述出發(fā)細胞為Hela細胞；
所述報告基因為熒光素酶編碼基因；
所述出發(fā)表達載體為pR印4載體；
所述融合基因的核苷酸序列如序列表中序列3自5'末端第14到1734位所示。
如下融合基因在制備檢測流感病毒的試劑盒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范 圍
由片段1、報告基因和片段2依次連接構(gòu)成的融合基因；片段1的核苷酸序 列為 AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAA，片段 2 的核苷酸序列為 AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT。
如下融合基因在制備篩選抗流感病毒藥物的試劑盒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保 護范圍
由片段1、報告基因和片段2依次連接構(gòu)成的融合基因；片段1的核苷酸序 列為 AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAA，片段 2 的核苷酸序列為 AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT。
如下融合基因在篩選抗流感病毒藥物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍
由片段1、報告基因和片段2依次連接構(gòu)成的融合基因；片段1的核苷酸序 列為 AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAA，片段 2 的核苷酸序列為 AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT。
所述報告基因為熒光素酶編碼基因；
所述流感病毒為A/WSN/33流感病毒；
所述融合基因的核苷酸序列如序列表中序列3自5'末端第14到1734位所示。
本發(fā)明所提供的含有A型流感特異性啟動子的報告基因的重組細胞系在感染流 感病毒后可以通過檢測報告基因的表達監(jiān)測流感病毒的繁殖程度，同時可用于有效篩選抗 流感病毒藥物。


圖1為pR印4-IAV-Luc質(zhì)粒圖譜。
圖2為不同量病毒感染Hela-IAV-Luc細胞后測量熒光素酶活性結(jié)果。
圖3為檢測已知抗病毒藥物利巴韋林(ribavirin)的抗病毒效果的結(jié)果圖。
具體實施方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
293T細胞(腎上皮細胞)購自ATCC，細胞系編號為CRL_11268 ；
Hela細胞(子宮頸癌細胞)購自ATCC，細胞系編號為CCL_2 ；
細胞培養(yǎng)基DMEM(Dulbecco，s Modified Eagle，s Medium)購自 Gibco 公司，含 有10%的胎牛血清(PAA) ·；培養(yǎng)條件:37°C,5% CO2 ；
A/WSN/33流感病毒毒株(公眾可從中國科學院微生物學研究所獲得，記載過 該材料的非專利文獻是 Gabriele Neumann PNAS 1999Generation of influenza A virusesentirely from cloned cDNAs)；
轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 2000 購自 invitrogen 公司；
熒光素酶活性測量試劑盒購自promega公司；
三氮唑核苷病毒唑(利巴韋林)購自Sigma公司；
潮霉素(Hygromycin)購自Roche 公司。
實施例1、構(gòu)建含有A型流感特異性啟動子的報告基因質(zhì)粒及細胞系
一、構(gòu)建含有A型流感特異性啟動子的報告基因質(zhì)粒及活性驗證
1、構(gòu)建含有A型流感特異性啟動子的報告基因質(zhì)粒
含有A型流感特異性啟動子的報告基因質(zhì)粒是通過如下步驟的方法制備得到的
(1)以引物1和引物2組成的引物為引物對，以pGL3載體為模板，進行PCR擴增得 到DNA片段，該DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列3所示。
引物1(上游引物)
ATACGTCTCGGGG |AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAAl ATGGAAGACGCCAAAAACATAAAG(序列表中序列 1 所示)；
引物2 (下游引物)
ATACGTCTCATATT jAGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT] TTA CA CGGCGA TCTTTCCGCCC(序列表中序列2所示)(以上上下游引物中下劃線部分含有BsmBI酶切位點， 框線部分為流感啟動子序列，斜體部分為熒光素酶編碼基因序列)。
(2)將步驟(1)得到的DNA片段經(jīng)BsmBI酶切后，連接到經(jīng)BsmBI酶切的pHH21 載體(購自Promega公司)上，得到重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，抗性篩選，挑 取陽性克隆，將陽性克隆進行液體培養(yǎng)，提取陽性克隆質(zhì)粒進行測序驗證，測序結(jié)果表明在 PHH21載體的BsmBI酶切位點上插入了序列表中序列3自5'末端第14到1734位核苷酸 序列，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確，將該質(zhì)粒命名為pHH21-IAV-Luc質(zhì)粒。
(3)將pHH21-IAV_Luc質(zhì)粒以NheI和PciI內(nèi)切酶(Takara)酶切，回收酶切片段， 以Klenow酶(購自Takara公司)補平末端后連入PvuII內(nèi)切酶消化的pR印4質(zhì)粒(購自 hvitrogen公司)，挑取陽性克隆，將陽性克隆進行液體培養(yǎng)，提取陽性克隆質(zhì)粒進行測序驗證，測序結(jié)果表明在PR印4中正確插入了序列表中序列3自5'末端第14到1734位核苷 酸序列，其中，序列表中序列3自5'末端第14-58位和第1712位-1734位為流感啟動子序 列；序列表中序列3自5'末端第59位-1711位為熒光素酶編碼基因序列。將得到的重組 質(zhì)粒命名為pR印4-IAV-Luc (圖1)。
2、含有A型流感特異性啟動子的報告基因質(zhì)粒的活性驗證
為驗證該質(zhì)粒的活性，將該質(zhì)粒用轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染細胞， 用細胞培養(yǎng)基DMEM培養(yǎng)細胞，然后分別感染或不感染A/WSN/33病毒(Μ0Ι = 1)，1 后測量 熒光素酶活性，通過luminometer儀(ftOmega)讀取熒光素酶酶活，結(jié)果未感染病毒組只有 本底活性，而感染病毒組的酶活性高達數(shù)百萬，這說明該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進入細胞后，可以在RNA 聚合酶I的作用下轉(zhuǎn)錄形成包含流感病毒啟動子及熒光酶的類病毒RNA片段，在有病毒感 染的情況下，病毒的聚合酶就可以啟動熒光酶報告基因的轉(zhuǎn)錄而顯示報告基因活性，該報 告基因活性就反應(yīng)了流感病毒在細胞里面的復制情況。
二、構(gòu)建含有A型流感特異性啟動子的報告基因的細胞系
1、pR印4-IAV-Luc 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 Hela 細胞
pR印4-IAV-Luc質(zhì)粒擴增后，測量質(zhì)粒濃度，轉(zhuǎn)染20 μ g質(zhì)粒至IOcm培養(yǎng)皿中的 Hela細胞。同時，用同樣的方法用空質(zhì)粒pR印4轉(zhuǎn)染Hela細胞，用細胞培養(yǎng)基DMEM培養(yǎng)細 胞。
2、篩選穩(wěn)定表達流感特異啟動子報告基因的細胞
轉(zhuǎn)染36h之后，更換新鮮培養(yǎng)基，并加入200 μ g/ml的潮霉素進行篩選，每隔2_3 天換新鮮培養(yǎng)基，同時維持潮霉素的篩選壓力，三周后獲得穩(wěn)定表達流感特異啟動子報告 基因的細胞系，命名為Hela-IAV-Luc。同時獲得轉(zhuǎn)空質(zhì)粒對照細胞系。
3、Hela-IAV-Luc 細胞的增殖
在獲得Hela-IAV-Luc細胞系后，增殖細胞時潮霉素濃度減半，改為100 μ g/ml潮 霉素，并進行細胞的凍存。
4、Hela-IAV-Luc 細胞的鑒定
將Hela-IAV-Luc細胞傳代至12孔板中，過夜培養(yǎng)后，吸棄培養(yǎng)基，以PBS溶液洗 滌后，不接種或接種A/WSN/33病毒(Μ0Ι = 2)，12h后測量熒光酶活性，在不接種病毒時，只 能檢測到本底的酶活性，而在接種病毒后酶活性高達數(shù)百萬以上；轉(zhuǎn)空質(zhì)粒對照細胞系只 能檢測到本底的酶活性。此結(jié)果說明所得到的Hela-IAV-Luc細胞系能夠反應(yīng)流感病毒在 細胞中的轉(zhuǎn)錄活性。
實施例2、含有A型流感特異性啟動子的報告基因質(zhì)粒及細胞系的應(yīng)用
1、病毒粒子數(shù)量與熒光素酶活性線性關(guān)系區(qū)間確認
在96孔板中每孔接種15000個Hela-IAV-Luc細胞，15小時后分別感染不同數(shù)量 的流感病毒(A/WSN/33流感病毒毒株)，感染12小時后通過Meady-Glo Luciferase檢測 試劑盒在glomax儀(promega公司)讀取每孔中熒光素酶發(fā)光量(熒光素酶發(fā)光量與樣品 中熒光素酶活性成正比)，實驗設(shè)三次重復，結(jié)果取平均值，得到的結(jié)果如圖2和表1所示。 在病毒數(shù)量和細胞數(shù)量比例(MOI)低于40時，熒光素酶發(fā)光量與MOl兩者之間就是正對應(yīng) 關(guān)系，MOI低于5時，兩者之間是線性關(guān)系(y = 32873x+62007,R2 = 0. 984)。在應(yīng)用96孔 板檢測每孔接種15000個細胞數(shù)時，能檢測到的病毒粒子數(shù)可達9375個。
MOI =病毒粒子個數(shù)與細胞個數(shù)的比值。
表權(quán)利要求
1.如下重組質(zhì)粒在制備檢測流感病毒的試劑盒中的應(yīng)用；或，如下重組細胞在制備檢 測流感病毒的試劑盒中的應(yīng)用所述重組質(zhì)粒是在出發(fā)表達載體的多克隆位點間插入如下融合基因，得到的重組質(zhì)粒；所述融合基因，是由片段1、報告基因和片段2依次連接構(gòu)成的融合基因；片段1的核 苷酸序列為 AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAA，片段 2 的核苷酸序列為 AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT ；所述重組細胞，是向出發(fā)細胞中轉(zhuǎn)入所述重組質(zhì)粒，得到的重組細胞。
2.如下重組質(zhì)粒在制備篩選抗流感病毒藥物的試劑盒中的應(yīng)用；或，如下重組細胞在 制備篩選抗流感病毒藥物的試劑盒中的應(yīng)用所述重組質(zhì)粒是在出發(fā)表達載體的多克隆位點間插入如下融合基因，得到的重組質(zhì)粒；所述融合基因，是由片段1、報告基因和片段2依次連接構(gòu)成的融合基因；片段1的核 苷酸序列為 AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAA，片段 2 的核苷酸序列為 AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT ；所述重組細胞，是向出發(fā)細胞中轉(zhuǎn)入所述重組質(zhì)粒，得到的重組細胞。
3.如下重組質(zhì)粒在篩選抗流感病毒藥物中的應(yīng)用；或，如下重組細胞在篩選抗流感病 毒藥物中的應(yīng)用所述重組質(zhì)粒是在出發(fā)表達載體的多克隆位點間插入如下融合基因，得到的重組質(zhì)粒；所述融合基因，是由片段1、報告基因和片段2依次連接構(gòu)成的融合基因；片段1的核 苷酸序列為 AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAA，片段 2 的核苷酸序列為 AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT ；所述重組細胞，是向出發(fā)細胞中轉(zhuǎn)入所述重組質(zhì)粒，得到的重組細胞。
4.根據(jù)1-3中任一所述的應(yīng)用，其特征在于 所述報告基因為熒光素酶編碼基因； 所述出發(fā)表達載體為PR印4載體；所述出發(fā)細胞為Hela細胞； 所述流感病毒為A/WSN/33流感病毒；所述融合基因的核苷酸序列如序列表中序列3自5'末端第14到1734位所示。
5.一種重組細胞，是向出發(fā)細胞中轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒，得到的重組細胞；所述重組質(zhì)粒是 在出發(fā)表達載體的多克隆位點間插入如下融合基因，得到的重組質(zhì)粒；所述融合基因，是由片段1、報告基因和片段2依次連接構(gòu)成的融合基因；片段1的核 苷酸序列為 AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAA，片段 2 的核苷酸序列為 AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組細胞，其特征在于 所述出發(fā)細胞為Hela細胞；所述報告基因為熒光素酶編碼基因； 所述出發(fā)表達載體為PR印4載體；所述融合基因的核苷酸序列如序列表中序列3自5'末端第14到1734位所示。
7.如下融合基因在制備檢測流感病毒的試劑盒中的應(yīng)用由片段1、報告基因和片段2依次連接構(gòu)成的融合基因；片段1的核苷酸序列 為 AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAA，片段 2 的核苷酸序列為 AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT。
8.如下融合基因在制備篩選抗流感病毒藥物的試劑盒中的應(yīng)用由片段1、報告基因和片段2依次連接構(gòu)成的融合基因；片段1的核苷酸序列 為 AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAA，片段 2 的核苷酸序列為 AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT。
9.如下融合基因在篩選抗流感病毒藥物中的應(yīng)用由片段1、報告基因和片段2依次連接構(gòu)成的融合基因；片段1的核苷酸序列 為 AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAA，片段 2 的核苷酸序列為 AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT。
10.根據(jù)7-9中任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述報告基因為熒光素酶編碼基因；所述流感病毒為A/WSN/33流感病毒；所述融合基因的核苷酸序列如序列表中序列3自5'末端第14到1734位所示。
全文摘要
本發(fā)明公開了含有A型流感特異性啟動子的重組細胞及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的重組細胞的應(yīng)用為所述重組細胞在制備檢測流感病毒的試劑盒中的應(yīng)用、所述重組細胞在制備篩選抗流感病毒藥物的試劑盒中的應(yīng)用或所述重組細胞在篩選抗流感病毒藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的含有A型流感特異性啟動子的報告基因的重組細胞在感染流感病毒后可以通過檢測報告基因的表達監(jiān)測流感病毒的繁殖程度，同時可用于有效篩選抗流感病毒藥物。
文檔編號C12Q1/68GK102031305SQ201010532889
公開日2011年4月27日 申請日期2010年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月2日
發(fā)明者劉婷, 葉昕, 張軍杰, 李剛, 童曉梅 申請人:中國科學院微生物研究所