專利名稱：一種促進脂肪酶催化豬油甲醇解的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶化學領(lǐng)域，涉及通過反應(yīng)介質(zhì)提高脂肪酶活性，同時促進脂肪酶催 化豬油甲醇解的技術(shù)。
背景技術(shù)：
脂肪酶即三酰基甘油?；饷?，以脂肪酶催化動植物油脂轉(zhuǎn)酯化制備生物柴 油，反應(yīng)條件溫和、醇用量少、甘油易回收、無廢物，可以解決目前化學法生產(chǎn)生物柴油存在 的分離難、耗能多等問題。脂肪酶是一種油水界面激活酶，介質(zhì)對酶促反應(yīng)的影響極其重要。有人曾研究微 水環(huán)境、叔丁醇、正己烷、石油醚以及緩沖液離子濃度等對酵母來源的脂肪酶催化甘油三酯 甲醇解或水解的影響[1-4]。通過有機溶劑為反應(yīng)介質(zhì)，改變脂肪酶分子的構(gòu)象W]、促進 酶與底物的結(jié)合，改善酶的催化性能，進而提高脂肪酶的經(jīng)濟性和實用性。參考文獻[1] Jeong, G. T. Park D. H. Lipase-Catalyzed Transesterification of rapeseedoi1 for biodiesel production with tert—butanol, Appl Biochem Biotechnol，2008，148 :131-139[2]Nelson, L. A. Foglia, T. A. Marmer, W. N. Lipase-catalyzed production ofbiodiesel[J]· · Am. Oil. Chem. Soc.，1996,73 :1191-1195[3] Lu, J. Chen, Y. W. Wang, F. Tan T. W. Effect of water on methanolysis ofglycerol trioleate catalyzed by immobilized lipase Candida sp. 99—125 inorganic solvent system[J]. J Molecular Catalysis B:Enzymatic,2009, 56 :122-125[4]王丹，宋少芳，劉愛榮，于專妮，黃錫榮，李越中，曲音波，油包水微乳液介質(zhì)中 脂肪酶催化α-單硬脂酸甘油酯水解反應(yīng)活性研究.山東大學學報(理學版)2002，37: 527-53
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在提高脂肪酶在豬油甲醇解反應(yīng)體系中的活性，進而促進脂肪酶 催化豬油甲醇解生成脂肪酸甲酯。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是提供一種促進脂肪酶催化豬油甲醇 解的方法，通過采用液態(tài)烷烴、甘油和磷酸緩沖液的混合液為反應(yīng)介質(zhì)，提高脂肪酶在豬油 甲醇解反應(yīng)體系中的催化活性。在豬油和甲醇的混合液中，加入脂肪酶液和一定量的反應(yīng) 介質(zhì)，控制適當?shù)臏囟群蛿嚢柁D(zhuǎn)速，即可實現(xiàn)豬油的甲醇解反應(yīng)。其方法包括如下步驟a、脂肪酶液制備按Ig 6mL的比例將脂肪酶加入pH7. 0,0. 05mol/ LK2HPO4-KH2PO4的磷酸緩沖液；b、脂肪酶液存放于4°C放置Mi ；C、反應(yīng)介質(zhì)制備反應(yīng)介質(zhì)的制備采用下述①或②的方法；
①按體積比為液態(tài)烷烴磷酸緩沖液=100 50 75，在液態(tài)烷烴中加入磷酸緩 沖液，攪拌混勻；或者②按體積比為液態(tài)烷烴磷酸緩沖液甘油=100 50 75 5，在液態(tài)烷 烴中加入磷酸緩沖液和甘油，攪拌混勻；在①或②中，所述液態(tài)烷烴為C6液態(tài)烷烴，所述磷酸緩沖液為pH接近中性的磷酸 緩沖液；d、將豬油、甲醇和脂肪酶液按質(zhì)量比為1 3.74X10—5 3.47X10—4進行混 合，加入占整個反應(yīng)體系40vt% 70vt%的反應(yīng)介質(zhì)，密封后，于38°C、160rmp振蕩反 應(yīng)；分別在反應(yīng)他和16h時再各加一次甲醇，每次甲醇的加入量為豬油和甲醇質(zhì)量比為 1 3. 74X10—5，共反應(yīng)24h結(jié)束反應(yīng)。優(yōu)選的，步驟c的反應(yīng)介質(zhì)制備中所述的液態(tài)烷烴為C6液態(tài)直鏈烷烴或環(huán)烷烴， 所述的PH接近中性的磷酸緩沖液為pH6. 8或pH7. 0的磷酸鹽緩沖液。更優(yōu)選的，步驟c的反應(yīng)介質(zhì)制備中所述的C6液態(tài)直鏈烷烴或環(huán)烷烴為正己烷或 環(huán)己烷；所述的PH6. 8或pH7. 0的磷酸鹽緩沖液為30 70mmol/L的磷酸鹽緩沖液。本發(fā)明的有益效果在于采用本發(fā)明所述的方法，通過使用由有機溶劑中加入甘油 和緩沖液構(gòu)成的反應(yīng)介質(zhì)，即可提高脂肪酶在豬油甲醇解反應(yīng)體系中的活性，進而促進脂 肪酶催化豬油甲醇解生成脂肪酸甲酯。豬油甲醇解的轉(zhuǎn)化率為對照的1. 2 4. 8倍(以不 加相應(yīng)介質(zhì)的體系為對照)，改善了脂肪酶的使用性能。與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本方法的突出優(yōu)點為操作簡單，能有效提高脂肪酶對豬油甲 醇解的催化活性，具有推廣利用價值。以下結(jié)合實施例和說明書附圖對本發(fā)明作進一步說明。


圖1為應(yīng)用反應(yīng)介質(zhì)促進脂肪酶催化豬油甲醇解生成脂肪酸甲酯的工藝流程示 意圖。
具體實施例方式實施例1a、脂肪酶液制備按Ig 6mL的比例將脂肪酶加入pH7. 0,0. 05mol/L K2HPO4-KH2PO4的磷酸緩沖液；所述的脂肪酶為深圳綠微康生物工程有限公司生產(chǎn)的產(chǎn)品名 稱為LVK-F100的脂肪酶。b、脂肪酶液存放于4°C放置Mh ；C、反應(yīng)介質(zhì)制備在正己烷或環(huán)己烷中加入0.5倍正己烷或環(huán)己烷體積的 50mmol/L、pH6. 8的磷酸鹽緩沖液，攪拌混勻；d、豬油甲醇解將豬油、甲醇和脂肪酶液按質(zhì)量比為1 3. 74X ΙΟ"5 3.47X10-4 進行混合，加入占整個反應(yīng)體系40vt%的反應(yīng)介質(zhì)，密封后，于38°C、160rmp振蕩反應(yīng)。分 別在反應(yīng)他和IMi時再各加入按豬油和甲醇質(zhì)量比為1 3.74X10_5的甲醇一次，共反應(yīng) 24h結(jié)束反應(yīng)。甲醇解轉(zhuǎn)化率測定將反應(yīng)物倒入分液漏斗靜置至分層，分離出下層液體，并洗滌上層液體3次，把直接分層和洗滌分層的下層液體混合均勻，測定甲醇解轉(zhuǎn)化率。以不添加正己烷和環(huán)己烷、僅加磷酸緩沖液的體系為對照，豬油甲醇解的轉(zhuǎn)化率 為對照的1.5倍以上。以不加磷酸緩沖液、僅加正己烷或環(huán)己烷的體系為對照，豬油甲醇解的轉(zhuǎn)化率為 對照的4. 4倍以上。實施例2a、脂肪酶液制備按Ig 6mL的比例將脂肪酶加入pH7. 0,0. 05mol/L K2HPO4-KH2PO4的磷酸緩沖液；所述的脂肪酶為深圳綠微康生物工程有限公司生產(chǎn)的產(chǎn)品名 稱為LVK-F100的脂肪酶。b、脂肪酶液存放于4°C放置Mh ；C、反應(yīng)介質(zhì)制備在正己烷中加入0. 75倍正己烷體積的50mmol/L、pH6. 8的磷酸 鹽緩沖液，攪拌混勻；d、豬油甲醇解將豬油、甲醇和脂肪酶液按質(zhì)量比為1 3. 74X ΙΟ"5 3.47X10-4 進行混合，加入占整個反應(yīng)體系70vt%的反應(yīng)介質(zhì)，密封后，于38°C、160rmp振蕩反應(yīng)。分 別在反應(yīng)他和IMi時再各加入按豬油和甲醇質(zhì)量比為1 3.74X10_5的甲醇一次，共反應(yīng) 24h結(jié)束反應(yīng)。甲醇解轉(zhuǎn)化率測定將反應(yīng)物倒入分液漏斗靜置至分層，分離出下層液體，并洗滌 上層液體3次，把直接分層和洗滌分層的下層液體混合均勻，測定甲醇解轉(zhuǎn)化率。以不加磷酸緩沖液、僅加正己烷的體系為對照，豬油甲醇解的轉(zhuǎn)化率為對照的4. 6 倍以上。實施例3a、脂肪酶液制備按Ig 6mL的比例將脂肪酶加入pH7. 0,0. 05mol/L K2HPO4-KH2PO4的磷酸緩沖液；所述的脂肪酶為深圳綠微康生物工程有限公司生產(chǎn)的產(chǎn)品名 稱為LVK-F100的脂肪酶。b、脂肪酶液存放于4°C放置Mi ；C、反應(yīng)介質(zhì)制備在正己烷中加入0. 5倍正己烷體積30mmol/L、pH7. 0的磷酸鹽緩 沖液，攪拌混勻。d、豬油甲醇解將豬油、甲醇和脂肪酶液按質(zhì)量比為1 3.74X10_5 3.47X10_4 進行混合，加入占整個反應(yīng)體系60vt%的反應(yīng)介質(zhì)，密封后，于38°C、160rmp振蕩反應(yīng)。分 別在反應(yīng)他和IMi時再各加入按豬油和甲醇質(zhì)量比為1 3.74X10_5的甲醇一次，共反應(yīng) 24h結(jié)束反應(yīng)。甲醇解轉(zhuǎn)化率測定將反應(yīng)物倒入分液漏斗靜置至分層，分離出下層液體，并洗滌 上層液體3次，把直接分層和洗滌分層的下層液體混合均勻，測定甲醇解轉(zhuǎn)化率。以不加正己烷和環(huán)己烷、僅加磷酸緩沖液的體系為對照，豬油甲醇解的轉(zhuǎn)化率為 對照的1.2倍。以不加磷酸緩沖液、僅加正己烷的體系為對照，豬油甲醇解的轉(zhuǎn)化率為對照的4. 8 倍。以不加磷酸緩沖液、僅加正己烷和去離子水的體系為對照，豬油甲醇解的轉(zhuǎn)化率為對照 的3. 7倍。實施例4
a、脂肪酶液制備按Ig 6mL的比例將脂肪酶加入pH7. 0,0. 05mol/L K2HPO4-KH2PO4的磷酸緩沖液；所述的脂肪酶為深圳綠微康生物工程有限公司生產(chǎn)的產(chǎn)品名 稱為LVK-F100的脂肪酶。b、脂肪酶液存放于4°C放置Mh ；C、反應(yīng)介質(zhì)制備在正己烷中加入0. 5倍正己烷體積70mmol/L、pH7. 0的磷酸鹽緩 沖液，攪拌混勻。d、豬油甲醇解將豬油、甲醇和脂肪酶液按質(zhì)量比為1 3. 74X ΙΟ"5 3.47X10-4 進行混合，加入占整個反應(yīng)體系60vt%的反應(yīng)介質(zhì)，密封后，于38°C、160rmp振蕩反應(yīng)。分 別在反應(yīng)他和IMi時再各加入按豬油和甲醇質(zhì)量比為1 3.74X10_5的甲醇一次，共反應(yīng) 24h結(jié)束反應(yīng)。甲醇解轉(zhuǎn)化率測定將反應(yīng)物倒入分液漏斗靜置至分層，分離出下層液體，并洗滌 上層液體3次，把直接分層和洗滌分層的下層液體混合均勻，測定甲醇解轉(zhuǎn)化率。以不加磷酸緩沖液、僅加正己烷和去離子水的體系為對照，豬油甲醇解的轉(zhuǎn)化率 為對照的2. 2倍。實施例5a、脂肪酶液制備按Ig 6mL的比例將脂肪酶加入pH7. 0,0. 05mol/L K2HPO4-KH2PO4的磷酸緩沖液；脂肪酶為深圳綠微康生物工程有限公司生產(chǎn)的產(chǎn)品名稱為 LVK-F100的脂肪酶。b、脂肪酶液存放于4°C放置Mh ；C、反應(yīng)介質(zhì)制備按體積比為液態(tài)烷烴磷酸緩沖液甘油=100 50 75 5，在液態(tài)烷烴中加入70mmol/L、pH6.8的磷酸鹽緩沖液和甘油，攪拌混勻。d、豬油甲醇解將豬油、甲醇和脂肪酶液按質(zhì)量比為1 3. 74X ΙΟ"5 3.47X10-4 進行混合，加入占整個反應(yīng)體系60vt%的反應(yīng)介質(zhì)，密封后，于38°C、160rmp振蕩反應(yīng)。分 別在反應(yīng)他和IMi時再各加入按豬油和甲醇質(zhì)量比為1 3.74X10_5的甲醇一次，共反應(yīng) 24h結(jié)束反應(yīng)。e、甲醇解轉(zhuǎn)化率測定將反應(yīng)物倒入分液漏斗靜置至分層，分離出下層液體，并洗 滌上層液體3次，把直接分層和洗滌分層的下層液體混合均勻，測定甲醇解轉(zhuǎn)化率。以不加甘油、僅加正己烷或環(huán)己烷和磷酸緩沖液的體系為對照，豬油甲醇解的轉(zhuǎn) 化率為對照的1.4倍以上。
權(quán)利要求
1.促進脂肪酶催化豬油甲醇解生成脂肪酸甲酯的方法，其特征在于包括如下步驟a、脂肪酶液制備按Ig 6mL的比例將脂肪酶加入pH7. 0,0. 05mol/LK2HPO4-KH2PO4的 磷酸緩沖液；b、脂肪酶液存放于4°C放置24h；c、反應(yīng)介質(zhì)制備反應(yīng)介質(zhì)的制備采用下述①或②的方法；①按體積比為液態(tài)烷烴磷酸緩沖液=100 50 75，在液態(tài)烷烴中加入磷酸緩沖 液，攪拌混勻；或者②按體積比為液態(tài)烷烴磷酸緩沖液甘油=100 50 75 5，在液態(tài)烷烴中 加入磷酸緩沖液和甘油，攪拌混勻；在①或②中，所述液態(tài)烷烴為C6液態(tài)烷烴，所述磷酸緩沖液為pH接近中性的磷酸緩沖液；d、豬油甲醇解將豬油、甲醇和脂肪酶液按質(zhì)量比為1 3.74X10—5 3.47X10—4進 行混合，加入占整個反應(yīng)體系40vt% 70vt%的反應(yīng)介質(zhì)，密封后，于38°C、160rmp振蕩反 應(yīng)；分別在反應(yīng)他和16h時再各加一次甲醇，每次甲醇的加入量同樣按照豬油和甲醇質(zhì)量 比為1 3.74X10—5加入，共反應(yīng)24h結(jié)束反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述促進脂肪酶催化豬油甲醇解生成脂肪酸甲酯的方法，其特征在 于步驟c的反應(yīng)介質(zhì)制備中所述的液態(tài)烷烴為C6液態(tài)直鏈烷烴或環(huán)烷烴，所述的pH接近 中性的磷酸緩沖液為PH6. 8或pH7. 0的磷酸鹽緩沖液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述促進脂肪酶催化豬油甲醇解生成脂肪酸甲酯的方法，其特 征在于步驟c的反應(yīng)介質(zhì)制備中所述的C6液態(tài)直鏈烷烴或環(huán)烷烴為正己烷或環(huán)己烷；所述 的pH6. 8或pH7. 0的磷酸鹽緩沖液為30 70mmol/L的磷酸鹽緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述促進脂肪酶催化豬油甲醇解生成脂肪酸甲酯的方法，其特 征在于所述的脂肪酶為深圳綠微康生物工程有限公司生產(chǎn)的產(chǎn)品名稱為LVK-F100的脂肪 酶。
全文摘要
一種促進脂肪酶催化豬油甲醇解生成脂肪酸甲酯的方法。采用能改變脂肪酶分子構(gòu)象以及含水量的以液態(tài)烷烴和磷酸緩沖液構(gòu)成的反應(yīng)介質(zhì)或以液態(tài)烷烴、磷酸緩沖液和甘油構(gòu)成的反應(yīng)介質(zhì)，在其中進行脂肪酶催化豬油甲醇解的反應(yīng)；所述的液態(tài)烷烴選取C6液態(tài)烷烴，所述的磷酸緩沖液為pH接近中性的磷酸緩沖液。所構(gòu)成的反應(yīng)介質(zhì)可用于脂肪酶催化豬油甲醇解，豬油甲醇解的轉(zhuǎn)化率為不加介質(zhì)的對照體系的1.2～4.8倍。
文檔編號C12P7/62GK102051387SQ201010531729
公開日2011年5月11日 申請日期2010年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月28日
發(fā)明者孫玉梅, 張瑤瑤, 曹方 申請人:大連工業(yè)大學