專利名稱：一種新的制備肝實質(zhì)細胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及一種新的制備肝實質(zhì)細胞及其制備方法。
背景技術(shù)：
肝臟是人體最重要的器官之一，調(diào)控著多種生理功能。肝臟本身具有很強的再生能力，但是在罹患各種肝臟疾病，包括肝炎，肝纖維化，肝癌，肝臟代謝疾病和肝功能衰竭時，肝臟逐漸失去再生能力，從而導(dǎo)致其生理功能的下降，最終危害著人們健康和生命。由于飲食、環(huán)境和遺傳等因素的影響，中國是世界上終末期肝病和急性肝衰竭發(fā)病人數(shù)最多的國家。特別是目前中國有約一億多的人口被乙型肝炎病毒感染，由于乙型肝炎病毒感染造成的終末期肝硬化、肝癌和肝功能衰竭發(fā)病占據(jù)了世界第一。對于終末期肝病以及急性肝衰竭的治療，目前唯一有效手段是進行肝臟移植。但是由于肝臟供體緊缺以及術(shù)后免疫系統(tǒng)對異體器官的排斥，移植手術(shù)的發(fā)展受到了嚴(yán)重的制約。最近基于肝細胞移植的技術(shù)受到廣泛的關(guān)注。其中一個在臨床上已經(jīng)使用的方法是將供體肝臟消化后得到的肝細胞移植入病人，從而使得一個供體器官可以治療若干個病人。然而該方法仍舊依賴于捐獻的供體器官，并且不能改變移植后的免疫排斥。此外，體外培養(yǎng)的肝細胞還是一個非常好的藥物肝臟代謝模型，被制藥公司大量使用在藥物開發(fā)早期檢測代謝毒性實驗中。因此如何獲得穩(wěn)定而大量的肝細胞來源，成為目前最迫切的需要。隨著對干細胞研究的深入和新技術(shù)的突破，利用干細胞或其他細胞來分化獲得肝細胞被普遍認(rèn)為是未來的發(fā)展方向。從干細胞獲得肝臟細胞主要有以下的一些方法方法一、從人胚胎干細胞(hES細胞)定向分化成肝細胞。最近的研究包括中國科學(xué)家在內(nèi)的工作已經(jīng)表明，在使用特定的培養(yǎng)基和細胞因子的條件下，hES細胞可以被定向的分化成具有肝細胞功能的細胞。并且利用這些分化的肝細胞，在動物實驗也已經(jīng)驗證這些細胞在體內(nèi)可以表現(xiàn)出功能。方法二、利用來源于臍帶中分離的間充質(zhì)干細胞來獲得肝細胞?，F(xiàn)有的證據(jù)表明分離純化的臍帶間充質(zhì)干細胞可以在體外分化成非常接近肝細胞的細胞，并且臍帶間充質(zhì)干細胞到注射肝臟內(nèi)后可以分化表達許多肝細胞特異的功能蛋白。中國的科學(xué)家也發(fā)現(xiàn)用臍帶間充質(zhì)干細胞可以改善晚期肝硬化病人的肝功能。這些研究工作都指出臍帶間充質(zhì)干細胞極有可能是在體外大量獲得肝細胞的另一個來源。方法三、上述的方法都受到了取材的限制，特別是ES細胞的獲得存在很大的倫理道德問題。此外這些干細胞并非來自病人自身，因而由其分化而來的肝細胞還是不能避免移植后免疫排斥的問題。因此有人提出用人類iPS全能干細胞定向分化成為肝細胞。將病人自身終末分化細胞誘導(dǎo)為iPS全能干細胞，再定向分化iPS全能干細胞為有肝細胞功能的細胞。目前中國和美國的科學(xué)家已經(jīng)報道成功的把人類iPS細胞定向分化成了具有肝臟功能的細胞。但是無論由ES干細胞，iPS干細胞還是臍帶干細胞定向分化獲得細胞，都不可能達到完全分化的效率，所以總有少量的干細胞存在于分化的細胞中。這些殘存的干細胞注射入動物體內(nèi)后可以形成畸胎瘤和腺瘤，因此嚴(yán)重影響了這些細胞的應(yīng)用。最近的研究表明，B淋巴細胞可以在體外直接轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉毎硗獬衫w維細胞可以在體外直接重編程為神經(jīng)細胞。這些實驗證據(jù)提出了這樣一種可能性，即各種不同類型的終末分化的動物細胞之間是可以直接轉(zhuǎn)化的。在正常生理條件下，人們一般認(rèn)為動物干細胞向終末分化細胞的分化過程是單向且不可逆的。但人們也發(fā)現(xiàn)在自然界存在少量已分化細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪活愋图毎睦?。最典型的例子包括蠑螈的斷肢再生和果蠅成蟲足原基轉(zhuǎn)決定為翅膀。這說明已分化細胞依然能被重編程，具有可塑性。人工誘導(dǎo)細胞重編程最早成功于上世紀(jì)的五十年代。John Gurdon用細胞核移植的方法誘導(dǎo)爪蟾成體細胞重編程并獲得成功，從而證明脊椎動物終末分化細胞的細胞核也能被重編程到全能狀態(tài)。2006年Siinya Yamanaga等發(fā)現(xiàn)的iPS技術(shù)，成功實現(xiàn)了成體細胞退分化為多能干細胞，從而開創(chuàng)了細胞重編程的新領(lǐng)域。隨著細胞核移植技術(shù)和iPS技術(shù)的發(fā)展，人們又開始關(guān)注不經(jīng)歷多能干細胞階段的成體細胞之間的相互轉(zhuǎn)化。早在上世紀(jì)八十年代，人們就發(fā)現(xiàn)小鼠的纖維細胞在用小分子化合物處理或表達某些外源基因時可轉(zhuǎn)分化為成肌細胞和脂肪細胞。而近年來，通過過表達特定的基因，人們在體內(nèi)和體外實現(xiàn)了親緣關(guān)系較近的細胞之間的轉(zhuǎn)化，如通過在B 細胞中過表達C/EBI^alpha和C/EBPbeta轉(zhuǎn)錄因子將B細胞重編程為巨噬細胞。最近通過在小鼠胚胎纖維細胞中過表達Ascll、Brn2和Mytl轉(zhuǎn)錄因子將其在體外重編程為神經(jīng)細胞。 雖然這項研究未能證明該神經(jīng)細胞是否可與體內(nèi)的神經(jīng)系統(tǒng)整合并行使功能，并且未能獲得特定功能的神經(jīng)細胞，但依然說明成體細胞進行跨胚層的轉(zhuǎn)化，即親緣關(guān)系較遠的細胞之間的轉(zhuǎn)化是完全可以實現(xiàn)的。關(guān)于從其他類型細胞轉(zhuǎn)分化成肝細胞的研究已有近三十年的歷史。早期人們發(fā)現(xiàn)在一些特殊的病理情況下可在胰腺組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)類似肝細胞的細胞。DavidTosh等人通過過表達C/EBI^beta，實現(xiàn)了將與肝細胞在發(fā)育上親緣關(guān)系非常接近的胰細胞在體外轉(zhuǎn)分化為肝細胞類似細胞。然而由于該實驗使用了永生化的胰細胞株AR42J-B13作為起始細胞， 該細胞株是否在傳代過程中產(chǎn)生遺傳變化并不清楚，而且對于這些細胞的體內(nèi)功能都不明確。更為重要的是，實驗中使用了永生化的細胞系，沒有證明無法了解原代培養(yǎng)的分化成體細胞是否可以在體外重編程獲得肝細胞的功能。綜上，本領(lǐng)域迫切需要進一步研究促進肝臟再生的材料及方法，以滿足臨床所需。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的制備肝實質(zhì)細胞及其制備方法。在本發(fā)明的第一方面，提供一種肝實質(zhì)細胞的分化誘導(dǎo)方法(優(yōu)選體外方法)，所述方法包括在細胞中過表達以下轉(zhuǎn)錄因子或其突變體Gata4 ；選自Hnfl α、Hnf4 α或Hnf6的一個或多個；禾口選自Foxal、Foxa2或Foxa3的一個或多個。在另一優(yōu)選例中，還在細胞中過表達選自以下的一種或多種轉(zhuǎn)錄因子或其突變體
Hlf、Hhex、Jari d2、Coup-TF 1、Lrhl、Fxr 或 Pxr。在另一優(yōu)選例中，所述細胞過表達feita4，F(xiàn)oxa3和Hnfl α。在另一優(yōu)選例中，過表達轉(zhuǎn)錄因子或其突變體的細胞來源于體細胞或胚胎細胞。在另一優(yōu)選例中，過表達轉(zhuǎn)錄因子或其突變體的細胞是成纖維細胞，上皮細胞， 血液細胞，神經(jīng)細胞，胚胎細胞，組織或器官來源的細胞。在另一優(yōu)選例中，所述的細胞是哺乳動物細胞。在另一優(yōu)選例中，所述的哺乳動物包括但不限于鼠、兔、狗、兔、猴、豬、牛、羊、馬，人等。在另一優(yōu)選例中，所述的細胞是衰老或凋亡途徑被破壞(或抑制)的細胞，也包括永生化的細胞。在另一優(yōu)選例中，所述的細胞低表達或不表達pl9Arf。在另一優(yōu)選例中，所述的肝實質(zhì)細胞具有如下一種或多種性能1)形成上皮樣細胞克隆；2)表達選自以下的一種或多種基因或蛋白Albumin，Ttr, Aat ；3)表達選自以下的一種或多種基因或蛋白CK8和CK18 ；4)表達選自以下的一種或多種基因或蛋白E-cadherin、Gjpl和Cldn2 ；5)表達選自以下的一種或多種基因或蛋白tdo2，transferrin, pah, fxr, vitronectin ；6)積累肝糖原；7)轉(zhuǎn)運乙?；兔芏戎鞍祝?)表達選自以下的一種或多種基因或蛋白糖代謝、藥物代謝、脂肪酸代謝、膽固醇代謝、膽汁酸代謝相關(guān)基因或蛋白、調(diào)控止血和纖維蛋白溶解的基因或蛋白、第I級和第 II級異源物代謝基因、分泌性蛋白基因。在另一優(yōu)選例中，在細胞中過表達所述的轉(zhuǎn)錄因子或其突變體的方法是(a)提供用于過表達轉(zhuǎn)錄因子或其突變體的細胞；(b)用表達載體將所述的轉(zhuǎn)錄因子或其突變體轉(zhuǎn)入(a)的細胞中；(c)培養(yǎng)(b)獲得的細胞，富集獲得轉(zhuǎn)入了所述的轉(zhuǎn)錄因子或其突變體的細胞，該細胞就是肝實質(zhì)細胞。在另一優(yōu)選例中，(a)中，所述的細胞是哺乳動物細胞。在另一優(yōu)選例中，(a)中，將細胞進行體外培養(yǎng)若干代，較佳地為7-9代。在另一優(yōu)選例中，所述的表達載體是病毒。更佳地，所述的病毒是慢病毒。在另一優(yōu)選例中，首先將細胞培養(yǎng)于I型膠原上，將轉(zhuǎn)錄因子或其突變體轉(zhuǎn)入細胞1-3天后，更換培養(yǎng)基為Block’ s medium;更有選為，Block’ s medium外加地塞米松、 TGF 、EGF、ITS和/或其他成分。在另一優(yōu)選例中，將轉(zhuǎn)錄因子或其突變體轉(zhuǎn)入細胞中后，在第6-20天(較佳地第 8-18天，更佳地10-16天，更佳地14天左右)富集具有上皮樣形態(tài)的細胞。更佳地，用胰蛋白酶處理(每次處理2-10分鐘，每隔1-3天處理一次)細胞以去除纖維細胞。在本發(fā)明的另一方面，提供一種肝實質(zhì)細胞，所述肝實質(zhì)細胞由所述的方法分化誘導(dǎo)產(chǎn)生。
在本發(fā)明的另一方面，提供所述的肝實質(zhì)細胞的用途，用于制備促進肝臟再生或治療(包括緩解)肝損傷的組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的肝損傷包括(但不限于)終末期肝病、肝硬化、酒精肝、 糖尿病、肥胖、急性肝衰竭、肝炎、肝纖維化、肝癌、肝臟代謝疾病或肝功能衰竭導(dǎo)致的肝損傷。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的肝實質(zhì)細胞的用途，用于作為體外模型，進行肝臟相關(guān)疾病或藥物的研究。在另一優(yōu)選例中，所述的肝臟相關(guān)疾病或藥物的研究包括研究藥物運輸、藥物代謝、肝形成、肝再生；或肝毒性測試、篩選肝細胞毒性化合物、篩選調(diào)節(jié)肝細胞功能化合物。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的肝實質(zhì)細胞的用途，用于產(chǎn)生Albumin蛋白。在本發(fā)明的另一方面，提供一種組合物，所述組合物含有有效量的所述的肝實質(zhì)細胞；以及藥學(xué)上可接受的載體。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物是藥物組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物用于促進肝臟再生；或治療(包括緩解)肝損失相關(guān)疾病。在本發(fā)明的另一方面，提供一種轉(zhuǎn)錄因子組合；包括以下轉(zhuǎn)錄因子或其突變體Gata4 ；選自Hnfl α、Hnf4 α或Hnf6的一個或多個；禾口選自Foxal、Foxa2或Foxa3的一個或多個。在另一優(yōu)選例中，所述的轉(zhuǎn)錄因子組合還包括選自以下的一種或多種轉(zhuǎn)錄因子或其突變體Hlf、Hhex、Jari d2、Coup-TF 1、Lrhl、Fxr 或 Pxr0在本發(fā)明的另一方面，提供所述的轉(zhuǎn)錄因子組合的用途，用于制備肝實質(zhì)細胞。在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于分化誘導(dǎo)肝實質(zhì)細胞的試劑盒，所述試劑盒中含有所述的轉(zhuǎn)錄因子組合。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還含有選自以下的一種或多種用于過表達轉(zhuǎn)錄因子或其突變體的細胞；轉(zhuǎn)錄因子或其突變體的表達載體(如慢病毒)；胰蛋白酶；細胞培養(yǎng)基(如Block，s medium ；I型膠原)。在本發(fā)明的另一方面，提供一種促進肝臟再生或治療(包括緩解)肝損傷的方法， 所述方法包括給予需要治療的對象有效量的所述的肝實質(zhì)細胞。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖la、iHep細胞的制備的流程示意圖。
圖lb、ET26細胞與過表達GFP的TTF細胞的形態(tài)比較。圖lc、ED6細胞中肝臟基因的表達情況。以肝細胞作為陽性對照；以過表達GFP 的TTF細胞作為陰性對照；以β-Actin作為內(nèi)參。圖Id、PAS染色表明ED6細胞可積累肝糖原。圖le、ET26細胞能將DiI標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍?Dil-ac-LDL)轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)。圖加、過表達6因子組合(6TF)與8因子組合(8TF)的TTF細胞在轉(zhuǎn)染14天后表達肝臟基因的情況；以及6因子減去1因子(6TF-1TF)后表達肝臟基因的情況。圖2b、6因子組合、8因子組合以及6因子減去1因子(6TF-1TF)誘導(dǎo)上皮樣細胞克隆數(shù)。圖2c、5因子組合(5TF)、5因子減去1因子(5TF-1TF)或5因子減去2因子 (5TF-Foxa2, Foxa3)誘導(dǎo)上皮樣細胞克隆數(shù)。圖2d、撤除三因子fetta4，Hnfl α，F(xiàn)oxa3組合(3TF)中的任意一個因子后誘導(dǎo)形成上皮細胞樣克隆的情況。圖2e、TTF過表達3因子后，第六天即有上皮樣細胞形成。圖2f_g、免疫熒光染色檢測具有上皮樣形態(tài)的細胞表達Tjpl和E-cadherin的情況。圖3a、RT_PCR分析TTF感染慢病毒(過表達3因子)之后不同時間點的基因表達情況。圖3b、免疫熒光染色檢測三因子誘導(dǎo)的iH印細胞以及對照細胞(過表達GFP的 TTF細胞)中Albumin在蛋白水平上的表達情況。圖3c、免疫熒光染色檢測三因子誘導(dǎo)的iH印細胞以及對照細胞(過表達GFP的 TTF細胞)中Hnf4a在蛋白水平上的表達情況。圖3d、基因表達譜分析各種細胞之間的遠近關(guān)系。圖3e、PAS染色表明iH印細胞中有大量的可被染成紅色的糖原顆粒。圖3f、Dil-ac-LDL吸收測試驗證iH印細胞可將ac_LDL從培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)運到胞漿里。圖3g、ELISA分析表明iifep細胞可分泌大量Albumin到培養(yǎng)基中。圖^、NTBC_off Fah^Rag2^ (F/R)小鼠移植iH印細胞或不移植iH印細胞，撤除 NTBC水后觀察后續(xù)情況的流程示意圖。圖4b、移植iH印細胞(iH印-F/R)、不移植iH印細胞(F/R)的 NTBC-offFah"l ag2+(F/R)小鼠，以及移植 pl9Arf+TTF 的 F/R 小鼠(TTF-F/R)，在不同時間點的存活情況。圖4c、移植iH印細胞(i!fep-F/R)或不移植iifep細胞(F/R)的 NTBC-offFah+Rag2+ (F/R)小鼠的體重變化。圖4d、移植iH印細胞(i!fep-F/R)或不移植iifep細胞(F/R)的 NTBC-offFahv-Rag2v-(F/R)小鼠表達 Fah 的細胞(Fah+)的情況。圖4e、PCR檢測iH印-F/R肝臟切片中pl9Arf_null和Fah野生型基因的表達。圖fe、8周后，移植了 iHep細胞的F/R小鼠與未移植細胞的F/R小鼠肝臟形態(tài)區(qū)別。圖5b、H&E染色發(fā)現(xiàn)未移植細胞的F/R小鼠肝臟中因大量細胞死亡導(dǎo)致肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，移植iHep細胞的F/R小鼠肝臟沒有明顯的細胞壞死。圖5c、移植iifep細胞后的F/R小鼠血清中酪氨酸水平比未移植細胞的F/R小鼠血清中的水平顯著下調(diào)。圖5d、移植iHep細胞后的F/R小鼠血清中酪氨酸的前體苯基丙氨酸水平比未移植細胞的F/R小鼠血清中的水平顯著下調(diào)。圖5e_g、鳥氨酸，丙氨酸和甘氨酸在野生型(WT)、iHep細胞移植或未移植小鼠中水平。圖證-j、總膽紅素(TBIL)、ALT和AST水平在移植iH印細胞的小鼠血清中相對于未移植小鼠的血清均有顯著下調(diào)。圖證、注射PLC/PRF/5細胞的N0D/SCID小鼠右側(cè)腹股溝在8周的時候形成了明顯的腫瘤，但是注射iHep細胞的左側(cè)腹股溝并沒有長出腫瘤。圖6a、在野生型的小鼠3T3纖維細胞系、胚胎纖維細胞(MEF)和TTF細胞中利用慢病毒同時過表達14個轉(zhuǎn)錄因子，檢測肝臟的標(biāo)志基因Alblumin和Tdo2的表達情況。以肝細胞作為陽性對照；以過表達GFP的細胞作為陰性對照；以β -Actin作為內(nèi)參。圖6b、分別在野生型的小鼠TTF與pl9Arf-null TTF中過表達14個轉(zhuǎn)錄因子，細胞生長狀況。圖6c、RT-PCR驗證過表達14個轉(zhuǎn)錄因子的TTF細胞表達肝臟基因Albumin、Tdo2 和Ttr的情況。圖7a、慢病毒感染21天后，挑取了 11個上皮樣克隆，測定其表達外源轉(zhuǎn)錄因子的情況。圖7b、慢病毒感染21天后，11個上皮樣克隆的肝臟基因表達譜測定。圖 7c、三因子 Gata4，Hnfl α，F(xiàn)oxa3 (3TF)和 Gata4，Hnfl α，F(xiàn)oxa2 (3TF，)誘導(dǎo)肝臟基因表達的情況。圖 7d、過表達三因子 Gata4，Hnfl α，F(xiàn)oxa3 (3TF) 14 天后誘導(dǎo) pl9Arf+MEF 細胞表達肝臟基因的情況。圖&i、TTF過表達3因子后第14天，通過流式細胞分選實驗表明50. 6%的細胞表達 E-cadherin。圖8b、RT-PCR分析5個iH印克隆的mRNA表達。以肝細胞作為陽性對照；以過表達GFP的TTF細胞作為陰性對照；以β -Actin作為內(nèi)參。圖9、定量RT-PCR分析說明許多CYP酶在苯巴比妥鈉誘導(dǎo)后的iH印細胞中表達上調(diào)。圖10a、Fah+細胞在肝臟切片中的分布情況。圖10b、連續(xù)切片染色說明iHep在F/R小鼠肝臟中增殖后重建了正常的肝臟結(jié)構(gòu)。圖10c、iHep細胞傳代17代后的染色體計數(shù)。圖11、14因子分別減橫坐標(biāo)所示1因子(14F-1F)后Albumin的表達情況；以及14 因子減R)xa家族因子后Albumin的表達情況。圖12、不同因子組合誘導(dǎo)下的上皮樣克隆數(shù)目及Albumin的表達情況，其中，標(biāo)*的均因克隆數(shù)目太多無法計數(shù)。圖13、人胚腎細胞過表達fetta4，Hnfla，F(xiàn)oxa3這3個因子后，表達肝細胞關(guān)鍵標(biāo)志基因Albumin(白蛋白)。
具體實施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛的研究，通過在細胞中過表達若干個轉(zhuǎn)錄因子，將已經(jīng)分化的體細胞在體外誘導(dǎo)成了具有功能的肝實質(zhì)細胞(iHep細胞)。所述細胞具有典型的上皮細胞形態(tài)，表達肝臟基因，并獲得了多種肝實質(zhì)細胞的功能。所述細胞可在肝臟中增殖，并重建肝臟功能。術(shù)語如本文所用，除非另外說明，所述的“細胞”或“用于過表達轉(zhuǎn)錄因子的細胞”是指多種類的細胞，只要其能夠在轉(zhuǎn)入所述的轉(zhuǎn)錄因子后形成肝實質(zhì)細胞。較佳地，所述的細胞是哺乳動物體細胞或胚胎細胞；更佳地，所述的細胞是上皮細胞、成纖維細胞、皮膚細胞、血液細胞，神經(jīng)細胞，胚胎細胞，組織或器官來源的細胞。所述的細胞可以是已經(jīng)分化或未分化的。相對于同一個體，盡管有不同的體細胞種類，但各種體細胞的基因組序列均是相同的、其主要組成部分也基本相同，因此易于理解各種體細胞均可用于本申請，只要其能夠在轉(zhuǎn)入所述的轉(zhuǎn)錄因子后形成肝實質(zhì)細胞。高等動物的動物體內(nèi)有大約300種不同的分化細胞。大部分的成體分化細胞與全能干細胞一樣，攜帶有完整的遺傳信息。造成不同分化細胞之間的主要區(qū)別是細胞的表觀遺傳修飾的不同，導(dǎo)致細胞特異基因表達的不同。成體細胞的表觀遺傳修飾是可以被修飾的，從而實現(xiàn)不同細胞間的轉(zhuǎn)化。比如成體細胞已被證明可以被重編程到全能干細胞，最近一些研究發(fā)現(xiàn)通過過表達某些基因，也可以實現(xiàn)將小鼠胚胎纖維細胞直接重編程為神經(jīng)細胞。如本文所用，所述的“肝實質(zhì)細胞”是指能形成上皮樣細胞克隆，能夠表達肝臟基因(如Albumin、Ttr、Aat、CK18、E-cadherin等)，并可在肝臟中增殖，具有重建肝臟功能。如本文所用，所述的“過表達”是指細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的含量(如表達量)超過初始細胞(未轉(zhuǎn)入該外源基因的細胞)的水平；如與初始細胞相比，其含量高20%，較佳地高 50%;更佳地高100%以上，如高200%，300% . . . 500%或更高。一種“過表達”的情形是將外源的轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因轉(zhuǎn)入細胞中且發(fā)生表達。如本文所用，所述的“低表達”是指細胞中某一基因含量(如表達量)顯著低于其正常水平(如與野生型細胞相比，其表達量低20%，較佳地低50% ；更佳地低100%以上， 如低200%，300% . . . 500%或更低)，所述的低表達還包括不表達的情況。低表達可通過基因敲除、基因沉默、蛋白抑制等本領(lǐng)域熟知的技術(shù)來實現(xiàn)。如本文所用，所述的“哺乳動物”是脊索動物門(Chordata)脊椎動物亞門 (Vertebrata)哺乳綱(Mammalia)的動物。本發(fā)明所述的哺乳動物包括人，也包括非人哺乳動物。所述的非人哺乳動物例如是小鼠、大鼠、兔、狗、兔、猿猴、豬、牛、羊、馬等等。不管是非人哺乳動物還是人，在基因組的組成、個體的發(fā)育、代謝方式、器官解剖、疾病發(fā)病機制等方面都非常接近。在進化過程中，一些關(guān)鍵的細胞功能或者調(diào)控通路在不同的物種之間是非常保守的。比如細胞增殖、凋亡的信號通路在哺乳動物中基本一致。細胞的衰老途徑也是一個非常保守的調(diào)控機制。在本發(fā)明的一些實施方式中，以鼠作為模式生物，和人類相比，它無論在基因組的組成、個體的發(fā)育、代謝方式、器官解剖、疾病發(fā)病機制等都和人類非常接近；因此，本發(fā)明列舉的一些適用于鼠的情況可以毫無疑義地適用于人等其它哺乳動物。轉(zhuǎn)錄因子及用途本發(fā)明人選定了 14種轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)這14種轉(zhuǎn)錄因子在導(dǎo)入細胞中過表達后，可以使非肝細胞形成肝實質(zhì)細胞。所述的14種轉(zhuǎn)錄因子以及它們的GenBank登錄號如表1。表1
權(quán)利要求
1.一種肝實質(zhì)細胞的分化誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述方法包括在細胞中過表達以下轉(zhuǎn)錄因子或其突變體Gata4 ；選自Hnfl α、Hnf4 α或Hnf6的一個或多個；禾口選自Foxal、Foxa2或Foxa3的一個或多個。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還在細胞中過表達選自以下的一種或多種轉(zhuǎn)錄因子或其突變體Hl f、Hhex、Jar id2、Coup-TFl、Lrhl、Fxr 或 Pxr0
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，過表達轉(zhuǎn)錄因子或其突變體的細胞來源于體細胞或胚胎細胞。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，過表達轉(zhuǎn)錄因子或其突變體的細胞是成纖維細胞，上皮細胞，血液細胞，神經(jīng)細胞，胚胎細胞，組織或器官來源的細胞。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的細胞是衰老或凋亡途徑被抑制的細胞。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的細胞低表達或不表達pl9Arf。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的肝實質(zhì)細胞具有如下一種或多種性能1)形成上皮樣細胞克?。?)表達選自以下的一種或多種基因或蛋白Albumin，Ttr，Aat；3)表達選自以下的一種或多種基因或蛋白CK8和CK18；4)表達選自以下的一種或多種基因或蛋白=E-CadheriruGjpl和Cldn2；5)表達選自以下的一種或多種基因或蛋白tdo2，transferrin,pah, fxr, vitronectin ；6)積累肝糖原；7)轉(zhuǎn)運乙酰化低密度脂蛋白；8)表達選自以下的一種或多種基因或蛋白糖代謝、藥物代謝、脂肪酸代謝、膽固醇代謝、膽汁酸代謝相關(guān)基因或蛋白、調(diào)控止血和纖維蛋白溶解的基因或蛋白、第I級和第II級異源物代謝基因、分泌性蛋白基因。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在細胞中過表達所述的轉(zhuǎn)錄因子或其突變體的方法是(a)提供用于過表達轉(zhuǎn)錄因子或其突變體的細胞；(b)用表達載體將所述的轉(zhuǎn)錄因子或其突變體轉(zhuǎn)入(a)的細胞中；(c)培養(yǎng)(b)獲得的細胞，富集獲得轉(zhuǎn)入了所述的轉(zhuǎn)錄因子或其突變體的細胞，該細胞就是肝實質(zhì)細胞。
9.一種肝實質(zhì)細胞，其特征在于，所述肝實質(zhì)細胞由權(quán)利要求1-8任一所述的方法分化誘導(dǎo)產(chǎn)生。
10.權(quán)利要求9所述的肝實質(zhì)細胞的用途，用于制備促進肝臟再生或治療肝損傷的組合物。
11.權(quán)利要求10所述的肝實質(zhì)細胞的用途，用于作為體外模型，進行肝臟相關(guān)疾病或藥物的研究。
12.如權(quán)利要求11所述的用途，其特征在于，所述的肝臟相關(guān)疾病或藥物的研究包括 研究藥物運輸、藥物代謝、肝形成、肝再生；或肝毒性測試、篩選肝細胞毒性化合物、篩選調(diào)節(jié)肝細胞功能化合物。
13.權(quán)利要求9所述的肝實質(zhì)細胞的用途，用于產(chǎn)生Albumin蛋白。
14.一種組合物，其特征在于，所述組合物含有 有效量的權(quán)利要求9所述的肝實質(zhì)細胞；以及藥學(xué)上可接受的載體。
15.一種轉(zhuǎn)錄因子組合；包括以下轉(zhuǎn)錄因子或其突變體 Gata4 ；選自Hnfl α、Hnf4 α或Hnf6的一個或多個；禾口選自Foxal、Foxa2或Foxa3的一個或多個。
16.如權(quán)利要求15所述的轉(zhuǎn)錄因子組合，其特征在于，還包括選自以下的一種或多種轉(zhuǎn)錄因子或其突變體Hlf、Hhex、Jarid2、Coup-TFULrhU Fxr 或 Pxr。
17.權(quán)利要求15或16所述的轉(zhuǎn)錄因子組合的用途，用于制備肝實質(zhì)細胞。
18.一種用于分化誘導(dǎo)肝實質(zhì)細胞的試劑盒，所述試劑盒中含有權(quán)利要求15或16所述的轉(zhuǎn)錄因子組合。
19.如權(quán)利要求18所述的試劑盒，其特征在于，還含有選自以下的一種或多種 用于過表達轉(zhuǎn)錄因子或其突變體的細胞；轉(zhuǎn)錄因子或其突變體的表達載體； 胰蛋白酶； 細胞培養(yǎng)基。
20.一種促進肝臟再生、治療肝損傷的方法，其特征在于，所述方法包括給予需要治療的對象有效量的權(quán)利要求9所述的肝實質(zhì)細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的制備肝實質(zhì)細胞的方法。本發(fā)明通過在細胞中過表達若干個轉(zhuǎn)錄因子，將已經(jīng)分化的體細胞在體外誘導(dǎo)成了具有功能的肝實質(zhì)細胞。所述細胞可在肝臟中增殖，并重建肝臟功能。
文檔編號C12N5/16GK102465115SQ201010531420
公開日2012年5月23日 申請日期2010年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月4日
發(fā)明者惠利健, 王欣, 黃鵬羽 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院