專利名稱：一種枯草芽孢桿菌及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及芽孢桿菌及其用途，具體地說是一種枯草芽孢桿菌 (Bacillussubtilis)及其用途。
背景技術(shù)：
棉籽殼是食用菌代料栽培中使用最早、最廣泛的一種天然培養(yǎng)基原料。在實(shí)際栽 培生產(chǎn)中，人們常常會加入5 30%的麩皮等含氮輔料。無論是單純的棉籽克或拌加有含 氮輔料后的棉籽殼混合料均統(tǒng)稱為棉籽殼栽培料(簡稱栽培料)。棉籽殼栽培料中含有大 量的雜菌。一般來說，麩皮等含氮輔料的含量越高或綿籽殼越陳舊，雜菌的數(shù)量亦會越多。 這些雜菌通常會通過競爭營養(yǎng)、代謝產(chǎn)物毒害等形式對栽培菌類產(chǎn)生負(fù)面影響。因此在食 用菌代料栽培中，通常要在正常菌類播種前，對棉籽殼栽培料中的雜菌進(jìn)行滅菌處理。目前 針對棉籽殼栽培料中的滅菌，最常采用的方法是常壓蒸汽滅菌。而常壓蒸汽滅菌不僅可單 純用于栽培階段料的處理，同時還可用于以棉籽殼栽培料為培養(yǎng)基的栽培種原料處理，且 其設(shè)備造價低，操作簡單、方便、滅菌量大，故深受栽培種植人員的青睞。但目前種植戶所用 的常壓蒸汽滅菌設(shè)施，通常為自行建造或組配的非標(biāo)設(shè)施。如滅菌灶是由蒸料倉、蒸汽發(fā)生 裝置(大鐵鍋)組成一體的滅菌設(shè)施，在使用時蒸汽由直接加熱鐵鍋中的水而產(chǎn)生；滅菌槽 (室)是蒸料倉、蒸汽發(fā)生裝置分別設(shè)置的滅菌設(shè)施，在使用時蒸汽由蒸汽鍋爐或加熱水桶 產(chǎn)生，蒸汽再通過管道輸入到蒸料倉。常壓滅菌的方法通常是將待滅菌的料袋(或瓶)擺 放至蒸料倉內(nèi)，關(guān)閉倉口 ；加熱或向蒸料倉里通入蒸汽，見冒大氣時開始計(jì)時，維持一段時 間停止加熱或供氣；待其稍冷卻后出鍋。由此可見，現(xiàn)有的常壓蒸汽滅菌技術(shù)無論設(shè)施還是 操作方法方面均不規(guī)范。而在蒸汽量、待滅菌的料量、滅菌時間及物料排列疏密等諸多因素 不確定的情況下，達(dá)到優(yōu)良滅菌效果是栽培者最關(guān)心的問題。要實(shí)現(xiàn)滅菌效果的評價，監(jiān)測 方法尤為重要。
目前，可用于常壓蒸汽滅菌效果監(jiān)測的技術(shù)有溫度-時間控制法、滅菌料袋直接 培養(yǎng)檢查法兩種。
溫度-時間控制法是用滅菌料溫及其持續(xù)時間的方法控制滅菌效果，由于缺乏料 溫及其持續(xù)時間與雜菌死亡之間的對應(yīng)關(guān)系，缺乏滅菌設(shè)施滅菌參數(shù)與雜菌死亡之間的對 應(yīng)關(guān)系，加上料溫監(jiān)測位點(diǎn)的局限性，以及料溫的不穩(wěn)定性，操作者并不能真正知曉滅菌的 效果，只是根據(jù)將來栽培菌類在料上的生長狀態(tài)推測滅菌效果。
滅菌料袋直接培養(yǎng)法是對滅菌料袋隨機(jī)抽樣，放在培養(yǎng)箱培養(yǎng)一定時間后，觀察 培養(yǎng)物中有無可見菌落產(chǎn)生。該方法存在的問題是，每一種植戶不可能都專門添置培養(yǎng)箱 用于滅菌檢驗(yàn)，且當(dāng)滅菌物料多、袋裝量大時，培養(yǎng)箱的容積也不能滿足檢驗(yàn)需要。而更為 致命的是，細(xì)菌在棉籽殼上不易形成肉眼可見菌落，所以即使在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)出雜菌也不 易發(fā)現(xiàn)，因此該方法很少在生產(chǎn)上得到應(yīng)用，即使應(yīng)用也有很大的局限性。
由此可見，目前棉籽殼栽培料常壓滅菌監(jiān)測手段，既缺乏有效性又缺乏實(shí)用性。若 將應(yīng)用于高壓滅菌監(jiān)測的化學(xué)指示卡檢測法和生物指示劑法兩種技術(shù)應(yīng)用于常壓滅菌會3發(fā)現(xiàn)，由于棉籽殼栽培料常壓滅菌的溫度一般均低于100°C且不穩(wěn)定，故不適合用化學(xué)指示 卡法進(jìn)行滅菌檢測；高壓滅菌指示劑中的指示菌抗常壓滅菌能力極強(qiáng)，100°C、50小時仍不 死亡，而此時在食用菌菌絲正常生長的溫度范圍(20 36°C)內(nèi)，危害其生長的菌類早已被 殺滅，再延長至其死亡時間已沒有意義，故也不能用于常壓滅菌監(jiān)測。
綜上所述，目前對棉籽殼栽培料的常壓滅菌效果監(jiān)測還沒有可靠適用的手段，針 對棉籽殼栽培料常壓滅菌溫度、料量、汽量等參數(shù)不恒定的問題，在物理、化學(xué)和生物監(jiān)測 方法中，選擇生物監(jiān)測技術(shù)最可行且最具優(yōu)勢，因?yàn)闇缇鷷r間、溫度等的作用效果就在于殺 死料中微生物，而生物監(jiān)測技術(shù)就使這種微生物的生死狀態(tài)變得直觀可見，尤其對于滅菌 溫度無法恒定一致的情況，不論持續(xù)時間多長，只要指示菌不死亡，就不能代表滅菌徹底， 而生物監(jiān)測技術(shù)的實(shí)現(xiàn)則依賴于一種具有指示栽培料滅菌效果的微生物菌株。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)及其用途，以期為 監(jiān)測機(jī)籽殼栽培料常壓滅菌效果提供一種更為有效的指示菌。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明所提供的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，其保藏名稱為為綿籽殼抗 熱菌01號，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏地址北京市朝陽 區(qū)北辰西路1號院3號，保藏編號CGMCC No. 4153，保藏日期2010年9月8日。
本發(fā)明所提供的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)棉籽殼抗熱菌01號，是 存在于棉籽殼栽培料中的一種會產(chǎn)生芽孢的革蘭氏陽性桿菌。其菌體桿狀，好氧，芽孢 橢圓形；可利用95種碳源中的如下類型i3-Methyl-D-GluCOSide(i3-甲基_D_葡萄 糖苷)，α -Methyl-D-Glucoside (α -甲基-D-葡萄糖苷)，α -D-Glucose ( α -D-葡萄 糖)，Tween 80 (吐溫 80)，Tween 40 (吐溫 40)，Turanose (松二糖)，Sucrose (蔗糖)， N-Acetyl-D-Glucosamine (N-乙酰氨基葡萄糖)，Maltotriose (麥芽三糖)，Maltose (麥 芽糖)，L-Fucose (L-巖藻糖)，L-Arabinose (L-阿拉伯糖)，Glycerol (丙三醇)， Gentiobiose (龍膽二糖)，D-Xylose (D-木糖)，D-Trehalose (D-海澡糖)，D-Ribose (D-核 糖)，D-Psicose (D-阿洛酮糖)，D-Mannose (D-甘露糖)，D-Mannitol (D-甘露醇)， D-Fructose (D-果糖)，Dextrin (糊精)，D-Cellobiose (纖維二糖)，2，3-Butanediol (2， 3-丁二醇)；脂肪酸主要組成成分 15:0iso40. 16%U5:0anteiso38. 16%。
本發(fā)明所提供的棉籽殼抗熱菌01號，其16s rDNA基因的部分序列在NCBI上 BLAST,測定結(jié)果與Bacillus subtilis模式種不同亞種菌株的相似性菌為100%,與 Bacillus amyloliquefaciens模式菌株的相似性菌為99.4%。結(jié)合前面的生理生化鑒定 結(jié)果結(jié)合分析，鑒定為芽孢桿菌屬枯草芽孢桿菌。
本發(fā)明所提供的棉籽殼抗熱菌01號，是從陳舊棉籽殼、麩皮混合成的栽培料中培 養(yǎng)、篩選獲得的。
該菌株具有在棉籽殼栽培料上生長的能力和指示棉籽殼栽培料常壓滅菌效果能 力，且與棉籽殼栽培料所栽培的食用菌營養(yǎng)需求一致，生長溫度范圍重疊，將其制成生物指 示劑可對棉籽殼栽培料的常壓滅菌質(zhì)量進(jìn)行科學(xué)、有效的監(jiān)測。
由此，本申請人完成了枯草芽孢桿菌棉籽殼抗熱菌01號用于棉籽殼栽培料常壓4蒸汽滅菌的應(yīng)用發(fā)明。
同時，本申請人提供了枯草芽孢桿菌棉籽殼抗熱菌01號的三種具體應(yīng)用方案， 即
1、棉籽殼抗熱菌01號用于制備棉籽殼栽培料常壓滅菌生物指示劑。
2、以棉籽殼抗熱菌01號為指示菌，制備成棉籽殼栽培料常壓滅菌生物指示劑，用 于測定棉籽殼栽培料常壓滅菌設(shè)施冷點(diǎn)位置。
3、以棉籽殼抗熱菌01號為指示菌，制備成棉籽殼栽培料常壓滅菌生物指示劑，用 于標(biāo)定棉籽殼栽培料常壓滅菌設(shè)施的滅菌參數(shù)。


圖1是本發(fā)明菌株中脂肪酸組成的氣相色譜圖。
以下具體實(shí)施例，用于對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不以此對本發(fā)明的權(quán)利要 求的保護(hù)范圍做不利的限定。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1分離、篩選棉籽殼抗熱菌01號
具體方法及步驟如下
1、配制栽培料按照7 3的質(zhì)量比稱取陳舊棉籽殼、麩皮，將二者混合均勻，在 35°C烘箱內(nèi)烘干，粉碎，過40目篩。
2、制取雜菌懸液按照水、栽培料體積重量比(毫升/克)為100 52的比例，用 水浸提雜菌(即將棉籽殼栽培料放入蒸餾水中，振蕩器振蕩20分鐘，四層紗布過濾并擠壓 濾渣，濾液即為含有棉籽殼栽培料雜菌的雜菌懸液)。每100毫升水，可浸提出20毫升雜菌 懸液。每次用1100毫升水，浸提572克栽培料，可制取220毫升雜菌懸液，能夠滿足下一步 驟中(即步驟3) —次制作500毫升培養(yǎng)基的需要。
3、配制內(nèi)含雜菌的細(xì)菌培養(yǎng)基(即把栽培料中雜菌分散到細(xì)菌培養(yǎng)基中)。
具體制備100毫升培養(yǎng)基方法為用60毫升蒸餾水將2克瓊脂溶化后，再加入1 克胰蛋白胨、0. 5克葡萄糖、40毫升上述步驟2制取的雜菌懸液，混合均勻，煮沸，加蒸餾水 定容至100ml。
將上述制好的含雜菌的細(xì)菌培養(yǎng)基分裝至試管中，每只裝量10毫升，棉塞封口， 即制成含雜菌的細(xì)菌培養(yǎng)基。
一次配制500毫升上述含雜菌細(xì)菌培養(yǎng)基，分裝成50支試管，供下面步驟4中一 個滅菌時長使用。為防止雜菌被水浸提后，處于水中的雜菌吸水而影響其對常壓蒸汽的抗 力，特別注意，在用水浸提雜菌時，從栽培料投入水中開始，到分裝好的含雜菌的培養(yǎng)基試 管入常壓滅菌鍋時止，在1個小時內(nèi)完成，即每一個時長需要滅菌的培養(yǎng)基試管，從預(yù)定的 入鍋時間點(diǎn)起前推1個小時，開始水浸提雜菌的操作。
4、對含雜菌的細(xì)菌培養(yǎng)基進(jìn)行不同時長的常壓蒸汽滅菌
將上述步驟3制成的含雜菌培養(yǎng)基的試管，到預(yù)定入鍋時間時放入已預(yù)熱至蒸汽 溫度為100°c的常壓滅菌鍋內(nèi)，迅速封嚴(yán)鍋蓋，加大火力，蒸汽溫度再達(dá)100°C時開始計(jì)時。 最短的滅菌時長為1小時，其它各組的滅菌時長分別為2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時。所有各時長的滅菌處理均依次在同一鍋內(nèi)進(jìn)行。
滅菌到時的含雜菌培養(yǎng)基的試管出鍋后擺放成斜面。
5、20 25°C溫度恢復(fù)培養(yǎng)
將上述已凝固成斜面的含雜菌培養(yǎng)基試管放置在20 25°C下培養(yǎng)7天。
6、觀察上述試管中細(xì)菌恢復(fù)生長情況并檢出存活菌
結(jié)果經(jīng)6小時滅菌的50支試管中有5支恢復(fù)生長出細(xì)菌，經(jīng)7小時滅菌的50支 試管中有3支恢復(fù)生長出細(xì)菌，經(jīng)8、9小時滅菌后試管中再無細(xì)菌菌落長出。將經(jīng)7小時 滅菌后的3支試管中出現(xiàn)的存活菌分別轉(zhuǎn)接到胰蛋白胨葡萄糖細(xì)菌培養(yǎng)基斜面試管上(其 編號分別為7-l、7-2、7-3)，36°C培養(yǎng)后留存。
上述胰蛋白胨葡萄糖細(xì)菌培養(yǎng)基的配方為胰蛋白胨1克，葡萄糖0. 5克，瓊脂2 克，水定容至100毫升。
7、從7-1、7-2、7_3號存活菌中篩選出最抗熱的菌株。該步驟如下
(1)培養(yǎng)7-1、7-2、7_3號存活菌的芽孢
將上述7-1、7-2、7_3號存活菌，分別接種在生芽孢細(xì)菌培養(yǎng)基試管斜面上，36°C 下培養(yǎng)48小時，20°C下培養(yǎng)72小時。
上述生芽孢細(xì)菌培養(yǎng)基配方為胰蛋白胨1克，葡萄糖0. 5克，氯化鈉0. 8克，硫酸 錳0. 03克，瓊脂2克，水定容至100毫升。培養(yǎng)基分裝在18 X 180毫米試管內(nèi)，每管分裝10 毫升，121°C下滅菌30分鐘，出鍋擺放成斜面。
(2)分別配制7-1、7-2、7_3號存活菌的芽孢溶液
配制方法為用10毫升無菌水洗脫掉試管斜面存活菌的菌苔，洗脫液倒入無菌試 管中，振蕩菌苔懸液15分鐘，在烘箱內(nèi)，在90°C時持續(xù)20分鐘，殺死菌苔懸液中的營養(yǎng)體。 靜置，棄去管底沉淀物，將上清液倒入另一個無菌試管內(nèi)，即為存活菌芽孢懸液。取1毫升 該懸液，進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，測定芽孢懸液中活孢子濃度。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果用無菌水進(jìn)行稀釋，稀 釋得到每一編號的存活菌芽孢濃度為5X IO7個/毫升的芽孢溶液，4°C冰箱存放。
在平板計(jì)數(shù)時，采用的平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基為前述的胰蛋白胨葡萄糖細(xì)菌培養(yǎng)基。
(3)對含有7-1、7-2、7_3號存活菌芽孢及培養(yǎng)基的試管同時進(jìn)行不同時長的常壓 蒸汽滅菌。每一編號的存活菌，在每一時長滅菌時，有40支供試試管。
供試試管具體制備方法為在進(jìn)入滅菌前1小時，取1毫升芽孢濃度為5X107個 /毫升的芽孢溶液放到內(nèi)裝有9毫升胰蛋白胨葡萄糖細(xì)菌培養(yǎng)基的試管中。
常壓蒸汽處理時長取值為7小時、7小時10分鐘、7小時20分鐘、7小時30分鐘、 7小時40分鐘、7小時50分鐘、8小時、8小時10分鐘、8小時20分鐘、8小時30分鐘。各 處理時長依次分別編號為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。
處理的方式同一時長的滅菌處理，7-1、7-2、7_3號存活菌同時在同一個滅菌鍋 內(nèi)進(jìn)行。一個時長的滅菌處理完成后，再用同一滅菌鍋進(jìn)行下一個時長的滅菌處理。
滅菌后培養(yǎng)檢查上述滅菌后的培養(yǎng)基試管，置36°C下培養(yǎng)，36小時后檢查7_1、 7-2,7-3號存活菌在各滅菌時長后的存活管數(shù)，結(jié)果如下表1
表1 存活菌經(jīng)不同時長滅菌處理后生長細(xì)菌的管數(shù)
權(quán)利要求
1.一株枯草芽孢桿菌菌株，其特征在于該枯草芽孢桿菌為棉籽殼抗熱菌01號，在中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏名稱為棉籽殼抗熱菌01號，保藏 編號CGMCC No. 4153，保藏日期2010年9月8日。
2.權(quán)利要求1所述棉籽殼抗熱菌01號在棉籽殼栽培料常壓蒸汽滅菌中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的棉籽殼抗熱菌01號的應(yīng)用，其特征在于所述的棉籽殼抗熱菌 01號用于制備棉籽殼栽培料常壓滅菌生物指示劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的棉籽殼抗熱菌01號的應(yīng)用，其特征在于以所述的棉籽殼抗熱 菌01號為指示菌，制備成棉籽殼栽培料常壓滅菌生物指示劑，用于測定綿籽殼栽培料常壓 滅菌設(shè)施冷點(diǎn)位置。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的棉籽殼抗熱菌01號的應(yīng)用，其特征在于以所述的棉籽殼抗熱 菌01號為指示菌，制備成棉籽殼栽培料常壓滅菌生物指示劑，用于標(biāo)定棉籽殼栽培料常壓 滅菌設(shè)施的滅菌參數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株枯草芽孢桿菌菌株，該枯草芽孢桿菌為棉籽殼抗熱菌01號，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏名稱為棉籽殼抗熱菌01號，保藏編號CGMCC No.4153，保藏日期2010年9月8日。本發(fā)明同時公開了該菌株在棉籽殼栽培料常壓蒸汽滅菌中的應(yīng)用。將該菌株制成生物指示劑可對棉籽殼栽培料的常壓滅菌質(zhì)量進(jìn)行科學(xué)、有效的監(jiān)測。
文檔編號C12Q1/22GK102041239SQ20101053094
公開日2011年5月4日 申請日期2010年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月4日
發(fā)明者王世清, 王朝江, 董慶武, 袁永昌, 高春燕 申請人:河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所