專利名稱：一種青花菜Ogu胞質(zhì)快速鑒定試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種青花菜Ogu胞質(zhì)快速鑒定試劑盒，可檢測 青花菜OgU胞質(zhì)，適用于該胞質(zhì)的快速鑒定與分子標(biāo)記輔助選擇。
背景技術(shù)：
雄性不育是植物中普遍存在的一種自然現(xiàn)象，是指由于遺傳或生理上的多種原因 造成植物雌性器官正常，而雄性器官不正常，不能產(chǎn)生花粉或花粉敗育而不能正常授粉，導(dǎo) 致自交不結(jié)實(shí)，只能異交結(jié)實(shí)。雄性不育廣泛存在于植物界中，迄今為止已很多品種或種間 雜種中發(fā)現(xiàn)了該現(xiàn)象。研究表明，雄性不育主要分為細(xì)胞核雄性不育(Genie male sterility，GMS)和 細(xì)胞質(zhì)雄性不育(簡稱CMQ兩大類。細(xì)胞核雄性不育是由核不育基因控制，不受細(xì)胞質(zhì)影 響，不存在正反交遺傳效應(yīng)。同時根據(jù)不育基因與對應(yīng)的可育基因之間的顯隱性關(guān)系，又可 分為隱性核不育(張德威等，1979 ；曹壽椿，1987 ；楊世周，1995 ；夏錫銅等，1988)和顯性核 不育(方智遠(yuǎn)等，1997)。細(xì)胞質(zhì)雄性不育(cytoplasmic male sterility，CMS)，又稱質(zhì)核 互作型雄性不育，其不育性是由核不育基因和細(xì)胞質(zhì)不育基因相互作用而產(chǎn)生的。兩種不 育類型中，核不育因后代會出現(xiàn)育性分離，在利用上存在一定難度；而細(xì)胞質(zhì)雄性不育的利 用則不存在后代育性分離，可大面積的推廣利用。雄性不育在蔬菜雜種優(yōu)勢利用上有著重要的應(yīng)用價值，利用雄性不育系作母本 配制雜交種，可以克服人工雜交或優(yōu)良自交不親和系雜交這兩種方法的缺點(diǎn)，可以擴(kuò)大雜 種優(yōu)勢的利用范圍，降低種子生產(chǎn)成本，保證雜交種的純度，已成為蔬菜作物育種的主要趨勢。目前，國內(nèi)外在十字花科蔬菜作物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和培育出Ogu CMS(蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性 不育)、Pol CMS (波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育)、Jun CMS (芥菜型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育)、陜2A CMS等多種不同來源的細(xì)胞質(zhì)不育類型。其中Ogu CMS自發(fā)現(xiàn)以來，國內(nèi)外學(xué)者對該不育材 料進(jìn)行大量的回交轉(zhuǎn)育，目前已轉(zhuǎn)育到油菜、甘藍(lán)、白菜、青花菜等十字花科作物中，因Ogu CMS對環(huán)境變化不敏感、不育性穩(wěn)定、易轉(zhuǎn)育成不同熟性不同品質(zhì)的不育系等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成 為蔬菜作物中應(yīng)用最為廣泛的不育源之一。傳統(tǒng)CMS鑒定與分類方法如恢保測驗(yàn)(tester lines)、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、蛋白質(zhì)標(biāo)記、 同工酶鑒定等存在鑒定周期長、耗時耗工和操作復(fù)雜等不利因素，且往往不能準(zhǔn)確鑒定出 不育胞質(zhì)具體類型。目前經(jīng)檢索，國內(nèi)外尚無青花菜Ogu胞質(zhì)快速鑒定試劑盒出現(xiàn)。為此， 本發(fā)明針對青花菜Ogu胞質(zhì)，設(shè)計(jì)出檢測試劑盒，可簡單、快捷、低成本和準(zhǔn)確地鑒定出青 花菜Ogu胞質(zhì)，可極大地縮短鑒定周期和應(yīng)用于Ogu胞質(zhì)的分子標(biāo)記輔助選擇，在青花菜育 種實(shí)踐中具有重要的利用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對青花菜Ogu胞質(zhì)，設(shè)計(jì)出檢測試劑盒，可簡單、快捷、低成本和準(zhǔn)確地鑒定出青花菜Ogu胞質(zhì)，可極大地縮短鑒定周期和應(yīng)用于Ogu胞質(zhì)的分子標(biāo)記輔 助選擇，在青花菜育種實(shí)踐中具有重要的利用價值。本發(fā)明的另一目的是提供一種青花菜Ogu胞質(zhì)快速鑒定試劑盒的檢測方法。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第一個目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是試劑A，包括有特異引物、PCR 緩沖液、Taq聚合酶、dNTP以及01igO-dT特異引物；試劑B，標(biāo)準(zhǔn) DL-20001adder。進(jìn)一步設(shè)置是所述的oligo-dT特異引物包括有上游引物Ogu-A和下游引物 Ogu-B，其中OgU-A 序列為 5，-TTGTCCACTTTTTGTCATAATCTCA-3，，Ogu-B 序列為 5，-TTTCTCGGTCCATTTTCCAC-3。進(jìn)一步設(shè)置是所述試劑A各組分配比為成分試劑濃度特異引物0. 4mM/個PCR 緩沖液IOmM Tris-HCl，50Mm KCl，1. 5mM MgCl2Taq 聚合酶0. 04U/μ LdNTP0.2mM。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明另一個目的的技術(shù)方案是包括以下步驟，(1)提取樣品基因組DNA ；(2)特異引物設(shè)計(jì)，該特異引物的包括有上游引物Ogu-A和下游引物Ogu-B，Ogu-A 序列為 5，-TTGTCCACTTTTTGTCATAATCTCA-3，，Ogu-B 序列為 5，-TTTCTCGGTCCATTTTCCAC-3 ；(3)吸取樣品基因組DNA與試劑A進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(4)將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)392bp特異擴(kuò)增條帶的有無，來確 定該樣品是否含有Ogu胞質(zhì)。所述的步驟(1)包括以下步驟a)取0.2g幼嫩葉片于研缽中，用液氮充分研磨成粉末，加入800 μ L CTAB裂解緩 沖液，轉(zhuǎn)移至2. OmL離心管中，輕輕搖勻，于65°C水浴30分鐘。b)取出離心管，待管中溶液降至室溫后，11200rpm離心5分鐘。c)加入等體積氯仿異戊醇04 1)，并將離心管緩慢翻轉(zhuǎn)幾次，靜置5分鐘； 16°C，11200rpm 離心 3min。d)將上清液吸入新離心管中，加入70 μ L pH 5. 2的3. OM醋酸鈉與900 μ L預(yù)冷的 無水乙醇并緩慢翻轉(zhuǎn)數(shù)次，放于-2o°c冰箱池以上。e)8°C，11200rpm,離心5分鐘，棄上清液，加入200 μ L預(yù)冷的70%乙醇清洗沉淀；f)8°C，11200rpm，離心2分鐘，棄上清液。干燥后，加100 μ L滅菌的TE緩沖液或 ddH20溶解，_20°C冰箱保存?zhèn)溆?。g) 1. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量，稀釋后用于PCR擴(kuò)增分析。進(jìn)一步設(shè)置是所述的步驟(3)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系和程序?yàn)榉磻?yīng)體系為16 μ L， 含樣品基因組 DNA 20ng，引物各 0. 4ymol 廠^dNTPs 0. 2mmol · Γ1，Mg2+L 5mmol 'T1jTaq 聚合酶 0. 64U，反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性 5min，94°C 40s,56°C 50s,72°C 60s，；35 個循環(huán)，72°C延伸10min，10°C保存。進(jìn)一步設(shè)置是所述的步驟(4)為待PCR擴(kuò)增結(jié)束后，加入1/4體積的溴酚藍(lán)，在 1. 2%瓊脂糖凝膠上電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)觀察，含有Ogu胞質(zhì)的樣品中可擴(kuò)增出長度為 392bp的特異條帶。本發(fā)明相較于傳統(tǒng)技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)快速性傳統(tǒng)田間鑒定方法鑒定周期長，費(fèi)時費(fèi)力。而采用本試劑盒從DNA提取到 獲得檢測結(jié)果，僅需幾個小時，且任一生育期均可進(jìn)行鑒定，方便快捷，極大地縮短了鑒定 周期，在育種實(shí)踐中具有重要的利用價值。準(zhǔn)確性利用本方法對我所保存的青花菜不育種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定，20余份不育資 源中均擴(kuò)增出此特征帶，測序結(jié)果表明擴(kuò)增片段與orfl38的同源為100%。下面結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施方式
對本發(fā)明做進(jìn)一步介紹。


圖1為該試劑盒在青花菜中的檢測結(jié)果圖；圖中L 為 DL-2000DNA Ladder ;2，3，10，11，12，13 為含 Ogu 胞質(zhì)的青花菜樣品；1， 4，5，6，7，8，9為不含Ogu胞質(zhì)的青花菜樣品。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例和附圖1對本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，只用于對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步 說明，不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定，該領(lǐng)域的技術(shù)工程師可根據(jù)上述發(fā)明的內(nèi)容 對本發(fā)明作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。1、特異引物的設(shè)計(jì)和合成根據(jù)Ogu CMS相關(guān)的基因orf 138 (Gene bank登錄號:Ζ18896· 1)設(shè)計(jì)引物，于華 大基因公司合成該序列。特異引物Ogu-A和Ogu-B分別位于orfl38基因的22bp_46bp和 394bp-4i;3bp，擴(kuò)增得到的特異片段長度為392bp。2、試劑盒的組裝試劑A的配制先將裝有引物(Ogu-A:5，-TTGTCCACTTTTTGTCATAATCTCA-3，和 Ogu-B :5，-TTTCT CGGTCCATTTTCCAC-3，)的離心管在離心機(jī)上離心2分鐘，然后用滅菌的ddH20溶解。按照 表1的組分配成試劑A，置于_20°C冰箱中保存。試劑A現(xiàn)用現(xiàn)配擴(kuò)增效果更好。
權(quán)利要求
1.一種青花菜OgU胞質(zhì)快速鑒定試劑盒，其特征在于包括以下試劑試劑A，包括有特異引物、PCR緩沖液、Taq聚合酶、dNTP以及01igO-dT特異引物； 試劑 B，標(biāo)準(zhǔn) DL-2000ladder。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的青花菜Ogu胞質(zhì)快速鑒定試劑盒，其特征在于所述的 oligo-dT特異引物包括有上游引物Ogu-A和下游引物Ogu-B，其中Ogu-A 序列為 5，-TTGTCCACTTTTTGTCATAATCTCA-3，， Ogu-B 序列為 5，-TTTCTCGGTCCATTTTCCAC-3。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的青花菜Ogu胞質(zhì)快速鑒定試劑盒，其特征在于所述試 劑A各組分配比為成分試劑濃度特異引物0.4mM/個PCR 緩沖液IOmM Tris-HCl, 50Mm KCl，1. 5mM MgCl2Taq 聚合酶0. 04U/ μ LdNTP0. 2mM。
4.一種青花菜Ogu胞質(zhì)快速鑒定試劑盒的檢測方法，其特征在于包括以下步驟，(1)提取樣品基因組DNA;(2)特異引物設(shè)計(jì)，該特異引物的包括有上游引物Ogu-A和下游引物Ogu-B， Ogu-A 序列為 5，-TTGTCCACTTTTTGTCATAATCTCA-3，，Ogu-B 序列為 5，-TTTCTCGGTCCATTTTCCAC-3 ；(3)吸取樣品基因組DNA與試劑A進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(4)將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)392bp特異擴(kuò)增條帶的有無，來確定該 樣品是否含有Ogu胞質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種青花菜Ogu胞質(zhì)快速鑒定試劑盒的檢測方法，其特征 在于所述的步驟(3)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系和程序?yàn)榉磻?yīng)體系為16 μ L，含樣品基因組 DNA20ng，引物各 0. 4μ mol · Λ dNTPs 0. 2mmol · Λ Mg2+L 5mmol · Λ Taq 聚合酶 0. 64U, 反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性 5min，94°C 40s,56°C 50s,72°C 60s, 35 個循環(huán)，72°C延伸 lOmin， 10°C保存。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的一種青花菜Ogu胞質(zhì)快速鑒定試劑盒的檢測方法，其特 征在于所述的步驟⑷為待PCR擴(kuò)增結(jié)束后，加入1/4體積的溴酚藍(lán)，在1. 2%瓊脂糖凝 膠上電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)觀察，含有Ogu胞質(zhì)的樣品中可擴(kuò)增出長度為392bp的特異條帶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種青花菜Ogu胞質(zhì)快速鑒定試劑盒及其檢測方法，試劑盒由試劑A和試劑B組成，其中試劑A包含PCR緩沖液、Taq聚合酶、dNTP、Oligo-dT引物，試劑B為標(biāo)準(zhǔn)DL-2000DNA Ladder。檢測方法包括樣品DNA的提??；(1)樣品基因組DNA的提?。?2)PCR擴(kuò)增反應(yīng)；(3)瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)392bp特異擴(kuò)增條帶的有無，來確定樣品是否為Ogu胞質(zhì)。采用本試劑盒從DNA提取到獲得檢測結(jié)果，僅需幾個小時，極為方便快捷，苗期就可完成篩選、鑒定，極大地縮短了鑒定周期，在青花菜育種實(shí)踐中具有重要的利用價值。
文檔編號C12Q1/68GK102071250SQ201010214369
公開日2011年5月25日 申請日期2010年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月25日
發(fā)明者劉慶, 葉珍, 唐征, 張小玲, 朱世楊, 樓玨, 羅天寬, 荊贊革, 陳海英 申請人:溫州科技職業(yè)學(xué)院