一種動物原代肝臟細胞藥物分析試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術領域，特別涉及一種動物原代肝臟細胞藥物分析試劑盒及應用試劑盒檢測藥物肝細胞毒性的方法。
【背景技術】
[0002]肝臟是機體以代謝功能為主的重要器官之一，有著去毒素、儲存糖原、參與分泌性蛋白質(zhì)的合成及生物轉化等作用，也是最主要的藥物代謝器官。病毒性肝炎在我國有著較高的發(fā)病率，常在攜帶多年后演變成肝硬化，甚至發(fā)展成肝癌，危害患者生命。
[0003]目前，國內(nèi)外開發(fā)的治療肝臟疾病的藥物種類很多，主要分為抗病毒藥、免疫調(diào)節(jié)劑及改善肝功能藥等。肝臟細胞是患病主要的靶細胞，因此，在藥物的篩選過程中，以肝臟細胞作為靶細胞，可以快速的篩選出具有治療肝臟疾病的藥物。所以，體外分離培養(yǎng)肝臟細胞，制備藥物分析試劑盒是目前研究肝臟疾病的重要途徑。而在這一過程中，體外分離培養(yǎng)肝臟細胞是關鍵。
[0004]目前，已有一些分離培養(yǎng)肝臟細胞的方法，但細胞純度及活性相對較低。常用的方法主要有:非酶消化法和酶消化法。
[0005]非酶消化法又可分為:(I)直接分離法:①機械法:將離體動物肝臟剪成小塊后利用物理手段分離肝臟細胞的方法。②螯合法:利用螯合劑灌注去除Ca2+依賴性粘附因子，通過斷裂細胞間橋粒分離肝臟細胞，單獨使用效果欠佳，故常與酶消化法結合使用。(2)組織塊培養(yǎng)法:將離體動物肝臟剪成小塊后用緩沖液或生理鹽水沖洗去除游離的血細胞，利用組織塊貼壁法，使之均勻貼壁培養(yǎng)，分離肝細胞。
[0006]酶消化法可分為:(I)胰酶消化法:胰酶是有效的消化劑，但它不僅可以消化細胞間連接，也可消化細胞本身，所以易對肝細胞膜造成破壞。(2)膠原酶消化法:利用膠原酶來破壞細胞間的連接，能特異性地水解天然膠原蛋白的三維螺旋結構，而不損傷其它蛋白質(zhì)和組織。膠原酶僅對細胞間質(zhì)有消化作用而對上皮細胞影響不大。通過膠原酶來破壞肝臟細胞間的連接，來分離的肝臟細胞活性良好。其中，肝臟細胞全程無菌操作是關鍵因素，還有消化液消化時間及灌流速度都是會決定肝臟細胞分離培養(yǎng)成功與否的重中之重，影響著后續(xù)研究進程。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種提高動物原代肝臟細胞純度及活性的體外細胞培養(yǎng)方法，并利用動物原代肝臟細胞制備肝臟藥物分析試劑盒，從而快速篩選治療肝臟疾病藥物的方法。
[0008]本發(fā)明采用的技術方案是:一種動物原代肝臟細胞藥物分析試劑盒，由原代培養(yǎng)肝臟細胞、DMEM完全培養(yǎng)基、底物緩沖液、氧化型輔酶I溶液(NAD+)和2，4- 二硝基苯肼溶液構成。
[0009]上述的一種動物原代肝臟細胞藥物分析試劑盒，所述的原代培養(yǎng)肝臟細胞的制備方法是:
[0010]I)將動物肝臟組織塊放入平皿，采用灌流法，控制蠕動栗流速為0.9-1.7mL/min，灌入D-Hanks緩沖液沖洗血細胞，然后以同樣流速灌流消化液10_20min ;
[0011]2)將沖洗后的肝臟組織轉移到新的平皿中，用細胞刷輕輕將細胞刮下，加入磷酸鹽緩沖液，重懸細胞，過200目篩網(wǎng)，300r/min離心4min，棄上清液；
[0012]3)加入4°C預冷的DMEM完全培養(yǎng)基重懸沉淀，300r/min離心4min，棄上清液，再次重懸沉淀，500r/min離心4min，棄上清，得原代培養(yǎng)肝臟細胞。
[0013]上述的一種動物原代肝臟細胞藥物分析試劑盒，所述的D-Hanks緩沖液是:取
0.08gKCl，0.012g KH2PO4,1.6g NaCl，0.07g NaHCO3,0.027g NaHPO4.12H20，0.2g D-葡萄糖，0.02g的EDTA或不加EDTA，溶于200mL蒸餾水中，115°C滅菌1min。
[0014]上述的一種動物原代肝臟細胞藥物分析試劑盒，所述的消化液是:0.08g/L IV型膠原酶水溶液或10g/L聚乙烯吡咯烷酮水溶液。
[0015]上述的一種動物原代肝臟細胞藥物分析試劑盒，所述的DMEM完全培養(yǎng)基是:于500mL的DMEM培養(yǎng)基中，加入體積百分比為20%的胎牛血清，青霉素100 μ g/mL，鏈霉素100 μ g/mL，胰島素5 μ g/mL，氫化可的松10 6mol/L，轉鐵蛋白5 μ g/mL。
[0016]上述的一種動物原代肝臟細胞藥物分析試劑盒，所述的底物緩沖液是:pH為8.8的0.3mol/L的乳酸鋰水溶液。
[0017]上述的一種動物原代肝臟細胞藥物分析試劑盒，所述的氧化型輔酶I溶液是:濃度為5mmoL/L的氧化型輔酶I水溶液。
[0018]上述的一種動物原代肝臟細胞藥物分析試劑盒，所述的2，4- 二硝基苯肼溶液是:濃度為ImmoL/L的2，4- 二硝基苯肼水溶液。
[0019]本發(fā)明的動物原代肝臟細胞藥物分析試劑盒可以在篩選治療肝臟疾病的藥物中應用。
[0020]肝細胞破損，則導致乳酸脫氫酶(LDH)釋放量增加，所以，可以通過測定乳酸脫氫酶釋放量的變化，來判斷細胞膜的完整性，即肝細胞損壞程度，從而判斷一種藥物對肝細胞的毒性。而乳酸脫氫酶可以催化乳酸脫氫產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸與2，4- 二硝基苯肼反應生成在堿性條件下呈棕紅色的丙酮酸二硝基苯腙，比色法于440nm處測定吸光度值，顏色越深代表生成的丙酮酸越多，間接反映乳酸脫氫酶活力，即其釋放量。具體方法如下:
[0021]I)將原代培養(yǎng)肝臟細胞，于DMEM完全培養(yǎng)基中，細胞貼壁24h后，換液時，
[0022]實驗組，加入含有待測藥物的DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h ；
[0023]對照組，以不加藥物的DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h ；
[0024]2)實驗組與對照組收集細胞，分別離心取上清液；
[0025]3)取實驗組與對照組離心后上清液，分別加入底物緩沖液，37°C水浴加熱5min ;
[0026]4)實驗組加入氧化型輔酶I溶液，對照組加入雙蒸水，37°C水浴加熱15min ；
[0027]5)實驗組與對照組，均加入2，4- 二硝基苯肼溶液，37°C水浴加熱15min ;
[0028]6)實驗組與對照組，均加入NaOH溶液，混勻，室溫放置5min，于440nm處測量吸光度值。
[0029]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明通過調(diào)整不同的栗流速及酶消化時間，獲得了高活性肝臟細胞。通過本發(fā)明的方法，原代分離培養(yǎng)肝臟細胞易貼壁，活性可達到90%以上，復蘇后培養(yǎng)肝臟細胞狀態(tài)良好，活性可達到80-90%，符合原代培養(yǎng)的要求。利用其制備肝臟藥物分析試劑盒，可廣泛應用于肝臟生理功能探索，以及病理學、藥理和毒理學機制的研究。
【附圖說明】
[0030]圖1是實施例2獲得的家兔原代肝臟細胞的計數(shù)及活性。
[0031]圖2是實施例2獲得的家兔原代肝臟細胞復蘇后細胞計數(shù)及活性。
[0032]圖3是豕兔原代肝臟細胞糖原染色結果。
【具體實施方式】
[0033]實施例1 一種動物原代肝臟細胞藥物分析試劑
[0034](一 )原代培養(yǎng)肝臟細胞的獲得
[0035]I)實驗動物為大鼠(雌雄不限)，180_200g，脫頸處死，經(jīng)酒精消毒后剖開腹腔，取出肝組織。
[0036]2)將肝臟組織放入平皿，由于大鼠肝臟質(zhì)地較硬，采用灌流法，控制蠕動栗流速為1.0mL/min，灌入D-Hanks緩沖液(含EDTA)沖洗血細胞直至肝臟大部分為土灰色，然后以同樣速度灌流消化液lOmin。
[0037]D-Hanks 緩沖液是:取 0.08g KCl,0.012g KH2PO4,1.6g NaCl，0.07g NaHCO3,0.027g NaHPO4.12H20，0.2g D-葡萄糖，0.02g 的 EDTA,溶于 200mL 蒸餾水中，115 °C 滅菌1min0
[0038]消化液是:0.08g/L IV型膠原酶水溶液或10g/L聚乙烯吡咯烷酮水溶液。
[0039]3)將沖洗后的完整的肝臟組織轉移到新的平皿中，用鑷子按住一頭，用細胞刷輕輕將細胞刮下，盡量保持組織膜的完整，加入冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)終止反應，重懸細胞，過200目篩網(wǎng)，300r/min離心4min，棄上清液。
[0040]4)加入4°C預冷的DMEM完全培養(yǎng)基重懸沉淀，300r/min離心4min，棄上清，再次重懸沉淀，500r/min離心4min，棄上清，得大鼠原代培養(yǎng)肝臟細胞。加入細胞凍存液，-80°C保存。
[0041]DMEM完全培養(yǎng)基是:于500mL的DMEM培養(yǎng)基中，加入體積百分比為20%的胎牛血清，青霉素100 μ g/mL，鏈霉素100 μ g/mL，胰島素5 μ g/mL，氫化可的松10 6mol/L，轉鐵蛋白5 μg/mLο
[0042]重懸好的細胞接種培養(yǎng)，以I X 15接種量種板(48孔)或10 6接種35mm細胞培養(yǎng)皿，37°C、5% 0)2和飽和濕度的條件下的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。另收集一部分加入細胞凍存液-80°C保存。
[0043]檢測結果:將獲得的動物原代肝臟細胞，加入DMEM完全培養(yǎng)基，采用臺盼藍染色對細胞進行計數(shù)。結果表明，細胞量為3 X 11Zg,細胞活性達到90 %。將凍存的肝臟細胞一周后取出，立即放入37°C水浴中，3min快速溶解后，800r/min離心5min，復蘇后細胞計數(shù)。以DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)兩天，用PBS輕輕沖洗后以0.25%胰蛋白酶消化細胞，洗吹后再次計數(shù)貼壁細胞的數(shù)目，計算復蘇后的細胞活性，可達到80%以上。
[0044]( 二 )動物原代肝臟細胞藥物分析試劑盒
[0045]組成如下:
[0046]I)原代培養(yǎng)肝臟細胞。
[0047]2) DMEM完全培養(yǎng)基:于500mL的DMEM培養(yǎng)基中，加入體積百分比為20%的胎牛血清，青霉素100 μ g/mL，鏈霉素100 μ g/mL，胰島素5 μ g/mL，氫化可的松10 6mol/L，轉鐵蛋白5 μg/mLο
[0048]3)底物緩沖液:pH為8.8的0.3mol/L的乳酸鋰水溶液。
[0049]4)氧化型輔酶I溶液:濃度為5mmoL/L的氧化型輔酶I水溶