專利名稱：控制細(xì)胞活性的新試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明描述了靶向控制哺乳動(dòng)物細(xì)胞活性的新試劑，特別是用該試劑來(lái)控制特定種類的細(xì)胞與其外界環(huán)境的相互作用。該試劑作為一種藥品用于治療各種疾病。
活細(xì)胞的基本性質(zhì)是它們對(duì)外界環(huán)境的應(yīng)答能力。細(xì)胞與其外界環(huán)境之間的界面是質(zhì)膜。質(zhì)膜由雙磷脂層組成，并有許多蛋白質(zhì)分子嵌入其中。這些組成膜的蛋白質(zhì)(IMPs)引起細(xì)胞與其外界環(huán)境的許多相互作用。
涉及IMPs的相互作用包括物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，包括營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞；調(diào)節(jié)質(zhì)膜對(duì)離子的通透性；對(duì)細(xì)胞外分子的識(shí)別和應(yīng)答；以及一個(gè)細(xì)胞與另一個(gè)細(xì)胞的粘連。免疫系統(tǒng)的特殊功能(也通過(guò)IMPs傳遞)是通過(guò)一組免疫細(xì)胞與另一組的粘連來(lái)顯示特殊的外來(lái)肽的片斷。
細(xì)胞調(diào)節(jié)其應(yīng)答和與外界環(huán)境相互作用能力的一種方法是改變質(zhì)膜中IMPs的量和種類。獲得這種改變的一種機(jī)理是IMPs的可逆性內(nèi)在化作用，它通過(guò)細(xì)胞攝粒途徑進(jìn)入可再循環(huán)膜泡中(RMVs)。在這種情況下，貯存在RMVs中的IMPs相當(dāng)于內(nèi)部貯藏或IMPs池，可通過(guò)RMVs與質(zhì)膜的細(xì)胞排粒融合快速將IMPs排出到細(xì)胞表面。調(diào)節(jié)細(xì)胞攝粒/細(xì)胞排粒循環(huán)的平衡調(diào)節(jié)可快速控制細(xì)胞表面IMPs的密度。在控制細(xì)胞活性方法的實(shí)施例中，通過(guò)骨骼肌和脂肪組織中的胰島素應(yīng)答細(xì)胞調(diào)節(jié)葡萄糖的攝取。胰島素增加特定異型(iso-form)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)物(GLUT4)的量，該物質(zhì)在這些細(xì)胞的質(zhì)膜中發(fā)現(xiàn)。在細(xì)胞表面上的高濃度GLUT4分子增加了葡萄糖的攝取。因此，通過(guò)控制質(zhì)膜中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)物的數(shù)量，可以調(diào)節(jié)對(duì)胰島素的應(yīng)答。
在應(yīng)答外界信號(hào)中改變細(xì)胞表面IMP表達(dá)的另一實(shí)例是補(bǔ)體碎片C3b和C4b受體，即1型補(bǔ)體受體CR1。當(dāng)激活人中性細(xì)胞時(shí)，質(zhì)膜的CR1表達(dá)立即增加6—10倍。
在另一實(shí)施例中，大量炎性和免疫細(xì)胞修改細(xì)胞表面粘連分子在激活時(shí)的表達(dá)。因此，激活中性細(xì)胞和單核細(xì)胞引起細(xì)胞表面粘連分子Mac—1和P150，95的調(diào)節(jié)。這些粘連分子對(duì)炎性細(xì)胞靶向移動(dòng)到炎性部位是重要的。
在又一實(shí)施例中，各種激素(胰島素，象胰島素的生長(zhǎng)因子，白細(xì)胞介素1和血小板衍生物的生長(zhǎng)因子)引起各種類型細(xì)胞中細(xì)胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表達(dá)的快速增加。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體與來(lái)自細(xì)胞外環(huán)境的difleric轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)并因此將鐵攝入細(xì)胞中。該轉(zhuǎn)鐵蛋白/轉(zhuǎn)鐵蛋白受體系統(tǒng)在鐵穿過(guò)血腦屏障進(jìn)入CNS的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)中也發(fā)揮作用，轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程是轉(zhuǎn)移細(xì)胞學(xué)(transcytosis)已知的。轉(zhuǎn)移細(xì)胞學(xué)也包括母親免疫力向生長(zhǎng)中胎兒的轉(zhuǎn)移。
在又一實(shí)施例中，已知利尿素醛固酮增加膀胱上皮細(xì)胞頂膜中Na+通道的細(xì)胞表面表達(dá)。該機(jī)理包括鹽滯留和例如在低鹽飲食狀態(tài)下發(fā)生。
在調(diào)節(jié)IMPs細(xì)胞膜表達(dá)的更進(jìn)一步的實(shí)施例中，注意到免疫系統(tǒng)的功能基于外來(lái)或非自身抗原的識(shí)別。由能識(shí)別和應(yīng)答外來(lái)肽序列的免疫系統(tǒng)細(xì)胞提供識(shí)別和免疫應(yīng)答部分。這些肽斷片由免疫系統(tǒng)的已知作為抗原引入細(xì)胞(antigen presenting cells)的其它細(xì)胞引入免疫細(xì)胞中，引入抗原細(xì)胞攝入外來(lái)抗原性蛋白，消化成肽并在細(xì)胞膜上形成的裂口中，通過(guò)IMPs的主要組織相容復(fù)合物顯示外來(lái)肽。
因而IMPs是細(xì)胞與其外界環(huán)境相互作用能力的中樞并使這些相互作用具有各利不同的性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)存在大批不同的IMPs并不意外，IMPs在細(xì)胞功能方面的中樞作用意味著它們經(jīng)常牽涉到生理病理狀態(tài)，并且是很多治療手段的靶子。
以前工藝中控制IMP活性的方法主要集中在調(diào)節(jié)曾在細(xì)胞表面表達(dá)的IMP的功能。因而以前的治療方法對(duì)特殊IMPs和特殊種類細(xì)胞的特殊功能都是特異的，殊異轉(zhuǎn)移IMPs的抑制劑已發(fā)展為治療劑。例如，神經(jīng)元5HT轉(zhuǎn)移蛋白抑制劑用作抗抑郁藥。特殊受體IMPs的拮抗劑通常用作藥劑。其實(shí)例包括抗組胺藥(對(duì)組胺受體的H1和H2亞型都是特異的)和β腎上腺素能受體阻滯劑。IMP功能的抑制劑也廣泛用作藥劑。其實(shí)例包括離子經(jīng)膜轉(zhuǎn)移抑制劑如利尿劑速尿和氨氯吡脒，后者為膀胱上皮細(xì)胞頂部Na+通道的抑制劑。已知鉀通道抑制劑發(fā)展為抗心律失常劑。通常，細(xì)胞粘連IMPs也是開(kāi)發(fā)選擇性拮抗劑的靶子。
正在尋求的另一方法是在遺傳水平，通過(guò)改變編碼IMP的適宜基因的轉(zhuǎn)錄水平，選擇性地修改特殊IMPs的表達(dá)并因此調(diào)節(jié)特異IMP蛋白的合成。
簡(jiǎn)而言之，已知IMPs在細(xì)胞對(duì)其外界環(huán)境的應(yīng)答中起關(guān)鍵作用。以前控制IMPs的方法通常包括把在細(xì)胞表面的IMPs作為靶子并修改其功能。預(yù)期控制質(zhì)膜中IMPs的密度可廣泛用于治療各利疾病。由于IMPs的具大多樣性和目前治療學(xué)上相互作用的特殊性，本發(fā)明意外地發(fā)現(xiàn)單一種類的試劑可以修改多種細(xì)胞型中IMPs的表達(dá)。該相同種類的試劑也可以修改轉(zhuǎn)移IMPs，受體IMPs，粘連IMPs，通道IMPs和引入抗原的IMPs的表達(dá)。以前，影響IMPs的試劑按功能分類，例如Ca++拮抗劑，每組成員在化學(xué)和機(jī)械方面都是非常不同的。通過(guò)對(duì)比，本發(fā)明涉及的該種類試劑在結(jié)構(gòu)上與在預(yù)計(jì)對(duì)試劑功能有影響的特定區(qū)域合理引入的取代物是同種的。本發(fā)明進(jìn)一步的方面是該試劑選擇性地以特殊型的細(xì)胞為靶子來(lái)只在該型細(xì)胞上選擇性地調(diào)節(jié)IMP表達(dá)。
本發(fā)明涉及控制細(xì)胞與其外界環(huán)境相互作用的試劑，特別地，本發(fā)明提供控制組成膜的蛋白(IMP)分子從細(xì)胞內(nèi)組成部分向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移的試劑，以便修改細(xì)胞與其外界環(huán)境的相互作用。更特別地，本發(fā)明提供一種新試劑，它可以修改可再循環(huán)的膜泡的結(jié)構(gòu)，這樣抑制了它們將IMPs轉(zhuǎn)移到細(xì)胞表面的能力。
下列術(shù)語(yǔ)含意如下組成膜的蛋白(IMP)意指嵌入或跨越生物膜脂雙層的任何蛋白質(zhì)。
可再循壞的膜泡(RMV)意指細(xì)胞胞液中存在的，與脂雙層膜接壤的細(xì)胞內(nèi)的小泡。RMVs由質(zhì)膜形成并通過(guò)稱作細(xì)胞攝粒作用的方法移入細(xì)胞內(nèi)。RMVs由細(xì)胞質(zhì)膜形成又與之融合的循環(huán)過(guò)程。移動(dòng)到質(zhì)膜并與之融合的過(guò)程稱作細(xì)胞排粒作用。RMVs在細(xì)胞中的功能是可逆性地將IMPs轉(zhuǎn)移到細(xì)胞表面和從細(xì)胞表面轉(zhuǎn)移；這方面，它們不同于神經(jīng)分泌細(xì)胞的分泌腺囊。
核內(nèi)體指那些通過(guò)細(xì)胞攝粒作用產(chǎn)生電質(zhì)膜形成的細(xì)胞內(nèi)的小泡。
重鏈指形成梭狀桿菌神經(jīng)毒素的兩個(gè)多肽鏈中的大者；它具有約100kDa的分子量并通常稱作HC。輕鏈指形成梭狀桿菌神經(jīng)毒素的兩個(gè)多肽鏈中的小者；它具有約50kDa大的分子量并通常稱作LC。天然存在的重鏈和輕鏈至少通過(guò)一個(gè)二硫鍵共價(jià)配對(duì)。
H2片斷指通過(guò)蛋白水解酶(例如胰蛋白酶或木瓜蛋白酶)劈開(kāi)而從梭狀桿菌神經(jīng)毒素的重鏈的氨基末端產(chǎn)生的片段。
H2L指通過(guò)蛋白水解酶(例如用胰蛋白酶或木瓜蛋白酶)劈開(kāi)而產(chǎn)生的梭狀桿菌神經(jīng)毒素的片段，其中輕鏈通過(guò)二硫鍵仍與H2片段配對(duì)。
本發(fā)明一方面提供一種試劑來(lái)控制引起代謝物跨越細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的IMP的水平，因而控制細(xì)胞內(nèi)代謝物的有效性。
本發(fā)明另一方面提供一種試劑來(lái)控制引起代謝物跨越細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞或離開(kāi)細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)的IMP水平，因而控制代謝物通過(guò)細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)。
本發(fā)明又一方面是提供一種試劑來(lái)控制引起離子選擇性通過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜的IMP的水平，因而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)離子的濃度。
本發(fā)明的又一方面是提供一種試劑來(lái)控制引起對(duì)發(fā)出信號(hào)分子識(shí)別的IMP的水平，因而調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)發(fā)出信號(hào)分子的應(yīng)答性。
本發(fā)明的又一方面是提供一種試劑來(lái)控制通過(guò)將發(fā)出信號(hào)的分子結(jié)合于膜上而引起信號(hào)跨越細(xì)胞膜轉(zhuǎn)導(dǎo)的IMP水平，因而調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)發(fā)出信號(hào)分子的應(yīng)答性。
本發(fā)明的又一方面是提供一種試劑來(lái)控制引起從攝入抗原產(chǎn)生的肽片段在細(xì)胞表現(xiàn)顯現(xiàn)的IMP水平。在有機(jī)體中，其結(jié)果影響有機(jī)體的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明也提供一種試劑，它對(duì)于靶細(xì)胞具有靶向特異性，因此，該試劑的作用范圍局限于所說(shuō)種類的細(xì)胞。
如前面所述，以前控制IMP活性的方法集中在調(diào)節(jié)曾經(jīng)在細(xì)胞表面表達(dá)的IMP功能。在直接對(duì)照中，本發(fā)明調(diào)節(jié)正在細(xì)胞表面表達(dá)的IMP水平。
可以看到，本發(fā)明的目的(提供一種試劑來(lái)控制細(xì)胞表面IMPs水平)有很多潛在應(yīng)用來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)其環(huán)境的應(yīng)答。本發(fā)明包括一種試劑，它發(fā)揮作用是為了影響將IMPs運(yùn)載到細(xì)胞表面的機(jī)理，如實(shí)施例，例如實(shí)施1和2中所示的。這樣一種試劑必須完成三個(gè)沒(méi)有聯(lián)系的功能，前兩個(gè)功能在本領(lǐng)域是公知的。首先，該試劑必須結(jié)合在細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)上(結(jié)合部位)。然后必須進(jìn)入細(xì)胞的胞液中。已知通過(guò)細(xì)胞攝粒作用，分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。然而，因?yàn)橐阎挥心承┘?xì)胞表面結(jié)合部位包含細(xì)胞攝入作用，所以只有這些結(jié)合部位適于作為靶子。一旦試劑通過(guò)細(xì)胞攝入作用進(jìn)入細(xì)胞，那么它必須離開(kāi)產(chǎn)生的核內(nèi)體，跨越核內(nèi)體膜進(jìn)入胞液。獲得結(jié)合試劑的特異細(xì)胞和進(jìn)入胞液的能力在文獻(xiàn)中是公知的(例如Paxten I；Willingham，MC；&Fitzgerald，Dsp，1986，cell47，641—648，Olsnes，S；Sandvig，K；Petersen Ow；&Van Dews，B，1989，Immunol.Today 10，291—295，Stram，TB；Anderson，PL；Rubin—Kelley，VE；William，DP；Kiyokawa，T；&Murphy，JR；1991，Ann NY Acad.Sci 636，233—250)。試劑的第三個(gè)功能是本發(fā)明意外地發(fā)現(xiàn)的，稱之影響RMV的能力。本試劑更意外的方面是通過(guò)影響RMV限制了RMV將IMPs轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面的能力。
因此，本發(fā)明試劑包含下列官能區(qū)B區(qū)，結(jié)合區(qū)，將試劑結(jié)合到能進(jìn)行細(xì)胞攝入作用的靶細(xì)胞結(jié)合部位，產(chǎn)生含試劑的核內(nèi)體。
T區(qū)，易位區(qū)，將試劑或部分試劑從核內(nèi)體內(nèi)跨越核內(nèi)體膜易位到細(xì)胞胞液內(nèi)。
E區(qū)，效應(yīng)器區(qū)，抑制IMPs通過(guò)RMVs轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面。
可將B區(qū)制成對(duì)靶細(xì)胞具有特異性的區(qū)。將試劑靶向到特殊利類的細(xì)胞上的能力在本領(lǐng)域是公知的。因此，通過(guò)使用本領(lǐng)域公知的很多結(jié)合細(xì)胞分子中的一種可獲得B區(qū)的功能，結(jié)合細(xì)胞分子包括(但不限定于)，抗體，單克隆抗體，抗體片斷(Fab，F(xiàn)(ab)’2，F(xiàn)v，單鏈抗體等)激素，Cytokines，生長(zhǎng)因子和植物血凝素。
T區(qū)的功能可通過(guò)能在核內(nèi)體膜內(nèi)形成適宜孔的分子獲得。有文件證明毒素分子的特定部位可形成這種孔，它包括amongst others，炭疽毒素，肉毒桿菌毒素、破傷風(fēng)毒素，白喉毒素和假單胞菌內(nèi)毒素的片斷(Hoch，DH；Romero—Mira，M；Rhrlich，BE；Finkelstein，A；Das Gupta，BR；&Simpson，LL；1985 PNAS 82 1692—1696，Olsnes，S；Stenmark，H；Moskaug，JO；McGill，S；Madshus，IH；&Sandvig，k，1990，Microbial Pathogenesis8，163—168)。一種這樣的分子為梭狀桿菌神經(jīng)毒素的重鏈，例如A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素。優(yōu)選只用能在核內(nèi)體膜內(nèi)形成小孔的毒素分子的那些部位。
E區(qū)的功能，抑制將IMPs轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面的能力在本領(lǐng)域是未知的。已發(fā)現(xiàn)某些功能局限于可形成孔的毒素分子(包括梭狀桿菌神經(jīng)毒素如肉毒桿菌或破傷風(fēng)桿菌的片段)的不同部位，當(dāng)進(jìn)入靶細(xì)胞的胞質(zhì)中時(shí)，可抑制RMVs中IMPs轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面降低細(xì)胞表面IMPs的濃度。特別發(fā)現(xiàn)破傷風(fēng)毒素和肉毒桿菌A，B，C1，D，E，F(xiàn)和G型的片段尤其適合。這種分子的一個(gè)實(shí)施例為已知稱H2L片段的梭狀桿菌神經(jīng)毒素的那部分，其中，已除去毒素重鏈的羧基端的神經(jīng)元靶向活性，剩下一半以二硫鍵連接到輕鏈上的氨基端。另一實(shí)施例為梭狀桿菌神經(jīng)毒素的輕鏈，如B型肉毒桿菌神經(jīng)毒素的輕鏈，特別是分子中具有依賴Zn++型含金屬蛋白酶活性的那些部分。
因此，本發(fā)明包含下列結(jié)構(gòu)的試劑B區(qū)……T區(qū)……E區(qū)各區(qū)通過(guò)在區(qū)與區(qū)之間含有適宜隔離區(qū)的鍵共鍵相連。
在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中，B區(qū)是可結(jié)合到進(jìn)行細(xì)胞攝粒作用的靶細(xì)胞結(jié)合部位的結(jié)合分子，T區(qū)是肉毒桿菌神經(jīng)毒素或其片斷的重鏈而E區(qū)是肉毒桿菌神經(jīng)毒素或其片斷的輕鏈。T和E區(qū)可來(lái)自相同或不同的C.肉毒桿菌血清型。
在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，B區(qū)是可結(jié)合到靶細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞攝粒作用的結(jié)合部位的結(jié)合分子，T區(qū)是破傷風(fēng)神經(jīng)毒素或其片斷的重鏈而E區(qū)是肉毒桿菌神經(jīng)毒素或其片斷的輕鏈。
在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，B區(qū)是可結(jié)合到靶細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞攝粒作用的結(jié)合部位的結(jié)合分子，T區(qū)是肉毒桿菌神經(jīng)毒素或其片斷的重鏈而E區(qū)是破傷風(fēng)神經(jīng)毒素或其片斷的輕鏈。
在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，B區(qū)是可結(jié)合到靶細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞攝粒作用的結(jié)合部位的結(jié)合分子，T區(qū)是破傷風(fēng)神經(jīng)毒素或其片斷的重鏈而E區(qū)是破傷風(fēng)神經(jīng)毒素或其片斷的輕鏈。
可以理解，本發(fā)明包含來(lái)自具有上述功能的相同或不同有機(jī)體的毒素分子或毒素分子片斷的任意結(jié)合。
當(dāng)給予有機(jī)體試劑時(shí)，靶細(xì)胞表面IMPs的濃度減小。這可引起許多需要的作用包括減少代謝物的攝入或離子進(jìn)出細(xì)胞，減少靶細(xì)胞對(duì)產(chǎn)生信號(hào)分子的應(yīng)答，或改變有機(jī)體的免疫應(yīng)答。實(shí)施例實(shí)施例1將3T3—LI成纖維細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶作用成混懸液并在300v/cm，960mF和時(shí)間常數(shù)為11—11.5毫秒下，用帶有電容擴(kuò)充器的Bio—Rad Gene脈沖發(fā)生器，在含或不含1mM肉毒桿菌神經(jīng)毒素—B(BoNT—B)下電處理(electroporatcd)，接著將電處理的細(xì)胞粘著并保留在37℃24—孔板中的單層培養(yǎng)基中72小時(shí)。洗滌細(xì)胞并在含或不含5nm1型象胰島素型生長(zhǎng)因子(IGF—1)下，在37℃恒溫培養(yǎng)5分鐘，然后在冰中放置5分鐘。從細(xì)胞中吸取上清液并用冰冷1.5nM125I—轉(zhuǎn)鐵蛋白(sp.act47Tbq/mmol)來(lái)代替。估計(jì)，在含100倍克分子過(guò)量的非放射性轉(zhuǎn)鐵蛋白下，在類似的恒溫培養(yǎng)中進(jìn)行的非特異結(jié)合。2小時(shí)后，棄去上清液，用冰冷緩沖液洗3次，用1N NaOH消化細(xì)胞層，并用LKB 1275 minigamma gamma計(jì)數(shù)器測(cè)定結(jié)合的125I—轉(zhuǎn)鐵蛋白。將IGF—1存在下的特異結(jié)合的125I—轉(zhuǎn)鐵蛋白表示為IGF—1不存在下特異結(jié)合的百分?jǐn)?shù)計(jì)算結(jié)合轉(zhuǎn)鐵蛋白的上調(diào)值(μp—regualation)。
表1顯示，與對(duì)照相比，在用BoNT—B處理的細(xì)胞中，對(duì)IGF—1產(chǎn)生應(yīng)答的結(jié)合125I—轉(zhuǎn)鐵蛋白減小。這表明，將BONT—B引入3T3—LI成纖維細(xì)胞的胞液中抑制了這些細(xì)胞中IGF—1刺激的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的上調(diào)作用。
按Western beotting法用在神經(jīng)分泌細(xì)胞的分泌囊蛋白中識(shí)別的肽序列SEQ.ID.1(QQTQAQVDEVVDIMRVNVDKVLERDQK LSELD-DRADALQAGASQFETSAAKLKRK YWW KNLK)中培養(yǎng)的多克隆抗體來(lái)分析從3T3—LI成纖維細(xì)胞消化液中提取的三硝基甲基—X—114—可溶的蛋白質(zhì)。該抗囊抗體顯示，與用BONT—B處理的未報(bào)道有神經(jīng)分泌活性的成纖維細(xì)胞樣品中有關(guān)雙鍵的反應(yīng)性減少。因此，BONT—B將修改3T3—LI成纖維細(xì)胞中囊狀(可能為RMV)結(jié)構(gòu)并同時(shí)抑制轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的上調(diào)作用。
實(shí)施例2用實(shí)施例1給出的相同的條件，在含或不含0.5mM肉毒桿菌神經(jīng)毒素—A(BONT—A)時(shí)電處理3T3—LI成纖維細(xì)胞。如實(shí)施例1所述，測(cè)定處理和未處理細(xì)胞中IGF—1刺激的結(jié)合125I—轉(zhuǎn)鐵蛋白。
表2結(jié)果顯示，BONT—A處理的3T3—LI成纖維細(xì)胞取消了對(duì)IGF—1產(chǎn)生應(yīng)全的結(jié)合125I—轉(zhuǎn)鐵蛋白的上調(diào)作用。這表明，將BON-T—A引入3T3—LI成纖維細(xì)胞的胞液中抑制了這些細(xì)胞中IGF—1刺激的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的上調(diào)作用。
實(shí)施例3用實(shí)施例1給出的相同的條件，在含或不含0.5μM BONT—A的H2L片段(H2L—A)時(shí)，電處理3T3—LI成纖維細(xì)胞。該片斷通過(guò)使用甲苯磺?；奖彼崧燃淄樘幚硪鹊鞍酌赶拗菩缘鞍姿釩肉毒桿菌A血清型神經(jīng)毒素而產(chǎn)生。通過(guò)層析法，在SephadexG—200上(Shone，CC；Hanbleton，P；&Melling，J；1985，Eur J Biochem 151，17—82)純化該H2L復(fù)合物。如實(shí)施例1所述進(jìn)行電處理并測(cè)定處理和未處理細(xì)胞中IGF—1刺激的結(jié)合125I—轉(zhuǎn)鐵蛋白。
表3結(jié)果顯示，H2L—A處理的3T3—LI成纖維細(xì)胞抑制對(duì)IGF—1產(chǎn)生應(yīng)答的結(jié)合125I—轉(zhuǎn)鐵蛋白的上調(diào)作用。這表明將肉毒桿菌神經(jīng)毒素—A的H2L—A片斷引入3T3—LI成纖維細(xì)胞的胞液中抑制這些細(xì)胞中IGF—1刺激的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的上調(diào)作用。
實(shí)施例4按述方法(Frost，SC&Lane MD，1985，J Biol chem260，2646—2652)用地塞米松，3—異丁基—1—甲基黃嘌呤和胰島素處理3T3—LI成纖維細(xì)胞，從中分化去3T3—LI脂細(xì)胞。用稀釋到含血清的Dulbecco’s改性的Eagles溶媒中的A血清型肉毒桿菌神經(jīng)毒素處理分化后7天的3T3—LI脂細(xì)胞并無(wú)菌過(guò)濾(BONT—A的最終濃度為200nM)。在含8％CO2下將毒素處理的和對(duì)照細(xì)胞在37℃恒溫培養(yǎng)45小時(shí)。然后將細(xì)胞洗滌兩次并在含8％CO2下，在不含血清的Dulbecco’s modified Eagle’s溶媒中恒溫培養(yǎng)2小時(shí)，之后，將細(xì)胞洗入Krebs Ringer磷酸鹽中并在Krehs Ringer磷酸鹽(基本攝入)或含100nM胰島素的Krebs Ringer磷酸鹽(刺激攝入)中，在37℃下恒溫培養(yǎng)15分鐘。通過(guò)加入[3H]2—脫氧葡萄糖開(kāi)始葡萄糖攝入(14.2KBq，10μM葡萄糖)。在37℃進(jìn)行10分鐘后，通過(guò)吸出葡萄糖溶液來(lái)停止反應(yīng)并用冰冷的磷酸鹽緩沖的鹽迅速洗滌。通過(guò)加入0.2N NaOH溶解細(xì)胞，并通過(guò)加入0.2M HCl中和溶液。用Wallac1410液體閃爍計(jì)數(shù)器，在最佳閃爍狀態(tài)(in optiphase Sciytillant)通過(guò)液體閃爍計(jì)數(shù)來(lái)測(cè)定[3H]2—脫氧葡萄糖的攝入。
已知如果將高濃度的神經(jīng)毒素與細(xì)胞一起恒溫培養(yǎng)較長(zhǎng)時(shí)間，那么梭狀芽胞桿菌神經(jīng)毒素能通過(guò)低親和力的受體而進(jìn)入神經(jīng)分泌細(xì)胞中(例如PC12細(xì)胞)。該過(guò)程顯示了使用不同于肌神經(jīng)接點(diǎn)處存在的高專一性和高親和性受體的受體途徑。此外，已有報(bào)道某些梭狀胞細(xì)桿菌毒素對(duì)吞噬細(xì)胞如巨噬細(xì)胞有影響，假定進(jìn)入細(xì)胞是通過(guò)這些細(xì)胞的特異吞噬活性。通常，這是公認(rèn)的，然而，梭狀芽胞桿菌神經(jīng)毒素的神經(jīng)元選擇性是選擇性結(jié)合和細(xì)胞進(jìn)入機(jī)理的結(jié)果。因此，本研究意外的發(fā)現(xiàn)是，如上所述，3T3—LI脂細(xì)胞和肉毒桿菌神經(jīng)毒素—A的恒溫培養(yǎng)明顯抑制胰島素刺激的[3H]2—脫氧葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的上調(diào)作用(表4)。已知脂細(xì)胞中胰島素上調(diào)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從細(xì)胞內(nèi)池(RMVs)向細(xì)胞表面移運(yùn)的結(jié)果。因此，該結(jié)果證明，肉毒桿菌神經(jīng)毒素—A抑制胰島素刺激的RMVs中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)裝置向脂細(xì)胞表面的移動(dòng)。
實(shí)施例5將3T3—LI脂細(xì)胞經(jīng)胰白酶作用并在含或不含肉毒桿菌B(0.32mM)下電處理細(xì)胞混懸液。在電處理中，使用960mF的電容器，產(chǎn)生300v/cm的脈沖強(qiáng)度時(shí)間常數(shù)為11—12ms。電處理后，洗滌細(xì)胞并取出與溶媒和血清一起放到6孔板中。在37℃下，在濕潤(rùn)環(huán)境中(空氣/二氧化碳；92.5％/7.5％)恒溫培養(yǎng)該細(xì)胞72小時(shí)。該過(guò)程結(jié)束后，洗滌細(xì)胞并提取到0.1N NaOH中。然后用0.1N HCl中和提取物。將膜蛋白分配到三硝基甲苯X—114中并隨后按Westernblotting法，用實(shí)施例1中所述的抗囊抗體來(lái)分析。本研究的意外發(fā)現(xiàn)通過(guò)減小抗體與肉毒桿菌神經(jīng)毒素—B處理的細(xì)胞樣品上共軛雙鍵的反應(yīng)性證明，將肉毒桿菌神經(jīng)毒素電處理到脂細(xì)胞胞液中引起囊(假設(shè)為RMV)結(jié)構(gòu)的修改。
實(shí)施例6在本實(shí)施例中，合成一種試劑來(lái)調(diào)節(jié)脂細(xì)胞的胰島素依賴型葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)裝置的細(xì)胞表面表達(dá)。
在本實(shí)施例中，試劑的結(jié)合區(qū)(B)是胰島素型生長(zhǎng)因子II，它是從所述的BRL—3A細(xì)胞的有條件的溶媒中提純的(Marquette，H；Todaro，GJ；Henderson，LE&Qroszlan，s，1981，J Biol.Chem 2562122—2125)。
通過(guò)用甲苯磺?；奖彼崧燃淄樘幚淼囊鹊鞍酌赶拗菩缘鞍姿馍窠?jīng)毒素來(lái)從C肉毒桿菌A血清型神經(jīng)毒素中制備易位區(qū)(T)。然后，通過(guò)層析法，在交聯(lián)葡聚糖(Sephaelex)G—200上(Shone，cc；Hambleton，P；&Melling，J；1985，Eur.J.Biochem.151，75—82)提純含T區(qū)的餾分。然后將該餾分的磷酸鹽/硼酸鹽緩沖液，pH 8.4加到季銨乙基—交聯(lián)葡聚糖柱上，并于4℃下與2M尿素和0.1M二硫蘇糖醇一起在柱上恒溫培養(yǎng)過(guò)夜。用含2M尿素和10mM二硫蘇糖醇的緩沖劑沖洗柱子。用含2M尿素和10mM二硫蘇糖醇的磷酸鹽/硼酸鹽緩沖劑和NaCl從0.1—0.2M的漸進(jìn)梯度洗脫T區(qū)(Poulain，B；wadsworth，JDF；Maisey，EA；Shone，CC；Melling，T；Tauc，L；&Dolly，JO，1989，Eur.J.Biochem.185，197—203)。梭狀芽胞桿菌神經(jīng)毒素以二硫鍵連接到由重鏈和輕鏈組成的雙鏈蛋白上(Simpson，LL；1986，Ann.Rev.Pharmicol.Toxicol.26，427—453)。應(yīng)該注意，用所給的方法制得的T區(qū)相當(dāng)于稱為H2的神經(jīng)毒素重鏈的餾分。
通過(guò)在還原的條件下，在2M尿素中，用兩性電解質(zhì)形成的蔗糖梯度進(jìn)行等電點(diǎn)聚焦，從C破傷風(fēng)神經(jīng)毒素中制備效應(yīng)器區(qū)(E)(Weller，U；Dauzenroth，M—E；Meyer Zu Heringdo片，D&Habermann，E，1989，Eur.J.Biochem.，182649—656)。應(yīng)該注意，按所給方法制得的E區(qū)相當(dāng)于通常稱為L(zhǎng)C的神經(jīng)毒素的輕鏈。
在還原條件下，將等摩爾比的E區(qū)和T區(qū)混合到一起并在4℃攪拌下，通過(guò)重復(fù)性透析，到不含還原劑的生理鹽水溶液中來(lái)共價(jià)結(jié)合。任何剩余的游離巰基，通過(guò)加入150mM碘乙酰胺在4℃下，在黑暗處放置30分鐘來(lái)衍化。通過(guò)大小排阻層析法，在交聯(lián)葡聚糖G—150上，用pH 7.0的磷酸鉀緩沖劑來(lái)純化E—T復(fù)合物。最后，用N—琥珀酰亞胺基3—(2—Pyridylothio)proprionate(SPDP)，將B區(qū)結(jié)合到E—T復(fù)合物上。將E—T復(fù)合物(5mg)溶解到1ml磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)中，并向其中加入溶解在0.5ml無(wú)水乙醇中的200mg SPDP?；旌衔镌谑覝胤磻?yīng)30分鐘后，通過(guò)交聯(lián)葡聚糖G25進(jìn)行凝膠過(guò)濾，從過(guò)量的SPDP中分離出2—吡啶基二硫化物聚代的肽。類似地處理B區(qū)，但用較少的SPDP(0.2ml乙醇中含20mg)。取代的B區(qū)再次從交聯(lián)葡聚糖G25柱上獲得，并通過(guò)加入最終濃度為0.05M的二硫蘇糖醇來(lái)還原。過(guò)量的還原劑通過(guò)在交聚葡聚糖G 25上凝膠過(guò)濾而除去。將等份(W/W)的取代E—T復(fù)合物和取代的及還原的B區(qū)混合劑一起并在4℃下放置18小時(shí)。通過(guò)層析法，在交聯(lián)葡聚糖G—150上用pH7.0的磷酸鉀緩沖液來(lái)純化該試劑。
上述制備的試劑用來(lái)試驗(yàn)其抑制3T3—LI脂細(xì)胞中，胰島素刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)表達(dá)增加的能力。通過(guò)所述方法用地塞米松，3—異丁基—1—甲黃嘌呤，和胰島素來(lái)處理而從3T3—LI成纖維細(xì)胞中分化出3T3—LI脂細(xì)胞(Frost，SC&Lane MD，1985，J Biol Chem 260，2646—2652)，并在分化后8—12天內(nèi)使用。在含或不含試劑下，將細(xì)胞在37℃恒溫培養(yǎng)90分鐘。然后，在每個(gè)試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，在不含血清的Dulbeao’smodified Eagle’s溶媒中，將細(xì)胞恒溫培養(yǎng)2小時(shí)，將胰島素處理的細(xì)胞暴露在由1.6×10-4M貯液液稀釋成的10-7M胰島素中10分鐘。如上所述處理后，在37℃迅速用Krebs—Ringer磷酸鹽洗滌細(xì)胞，并測(cè)定10分鐘內(nèi)，從含或不含10-7M胰島素的37℃Krebs Ringer磷酸鹽中，攝入的[3H]2—脫氧葡萄糖。通過(guò)吸出葡萄糖溶液來(lái)中止反應(yīng)并迅速用冰冷的磷酸鹽緩沖液鹽水洗。通過(guò)加入0.2M氫氧化鈉溶解細(xì)胞，并且在用Wallac1410液體閃爍計(jì)數(shù)器，在Optiphase閃爍體中閃爍計(jì)數(shù)前，通過(guò)加入0.2M鹽酸來(lái)中和溶液。
實(shí)施例7在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，從相同血清型的肉毒桿菌神經(jīng)毒素中制備E和T區(qū)并且制備已經(jīng)結(jié)合在一起的E和T區(qū)。用甲苯磺?；奖彼崧燃淄樘幚淼囊鹊鞍酌赶拗菩缘鞍姿釩肉毒桿菌的A血清型神經(jīng)毒素，通過(guò)層析法，在交聯(lián)葡聚糖G—200上來(lái)純化E—T復(fù)合物(Shone，cc；Hambleton，P；&Melling，J 1985，Eur，J.Biochem.15175—82)。
應(yīng)該注意，該片斷相當(dāng)于所說(shuō)的H2L片斷。任何剩余的游離巰基，如實(shí)施例6所述，通過(guò)加入150mM碘乙酰胺來(lái)衍化。如實(shí)施例6所述制備的結(jié)合區(qū)(B)為類胰島素生長(zhǎng)因子II，并用所述的SPDP結(jié)合到E—T復(fù)合物中。如實(shí)施例6所述，試驗(yàn)試劑對(duì)脂細(xì)胞中胰島素依賴型葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)表達(dá)的活性。
實(shí)施例8在本發(fā)明另一實(shí)施例中，用下列方法來(lái)合成用于調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞(CD35)中補(bǔ)體片斷C3b的CR1受體的細(xì)胞表面表達(dá)的試劑。從SHCL3單克隆抗體到白細(xì)胞粘連分子P150，95來(lái)制備B區(qū)。從A血清型肉毒桿菌神經(jīng)毒素制備E和T區(qū)，如實(shí)施例7所述迅速結(jié)合并如該實(shí)施例所述結(jié)合到B區(qū)。
試驗(yàn)試劑對(duì)中性粒細(xì)胞中CR1(CD35)的細(xì)胞表面表達(dá)活性的優(yōu)選方法是使用全血溶解技術(shù)。用試劑處理EDTA抗凝的正常供體的全血4小時(shí)并在37℃下，用PBS稀釋由DMSO制備的10-2M貯備液得到的10-6M的fMet—Leu—Phe來(lái)激活30分鐘。對(duì)照組細(xì)胞在PBS中恒溫培養(yǎng)。在室溫下，將全血和10ml藻紅蛋白軛合的單克隆抗體抗CD35一起恒溫培養(yǎng)30分鐘(SerotecMCA 554PE)，用BectonDickinson溶解液來(lái)溶解紅細(xì)胞，用PBS洗滌白細(xì)胞并用含2％甲醛的PBS再混懸。用裝有LysysII軟件的FACScan(Becton Dickinson)，通過(guò)流動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)分析表面結(jié)合的PE。
實(shí)施例9在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，用下列方法合成用來(lái)調(diào)節(jié)白細(xì)胞粘連分子Mca—1(CDIIb)在細(xì)胞表面表達(dá)的試劑。按標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)，用胃蛋白酶從SHCL3單克隆抗體到白細(xì)胞粘連分子P150，95來(lái)制備B區(qū)，并通過(guò)凝膠過(guò)濾來(lái)純化(Martin，F(xiàn)J；Hubbell，WL；和Papahad-jopoulos，D，1981，Biochemistry20，4229—4238)。從A血清型肉毒桿菌神經(jīng)毒素來(lái)制備E和T區(qū)，如實(shí)施例7所述，迅速結(jié)合，并如該實(shí)施例所述，結(jié)合到B區(qū)。
試驗(yàn)試劑對(duì)Mac—1(CD IIb)在中性粒細(xì)胞表面表達(dá)活性的優(yōu)選方法是使用全血溶解技術(shù)。在37℃下，用試劑處理EDTA抗凝的正常供體的全血4小時(shí)并在37℃下，用PBS稀釋由DMSO制備的10-2M貯存液得到的10-6M fMet—Leu—phe來(lái)激活30分鐘。對(duì)照組細(xì)胞與PBS恒溫培養(yǎng)。在室溫下，將全血與10ml軛合單克隆抗體抗CD IIb的fluoroscein異硫氰酸鹽一起恒溫培養(yǎng)30分鐘(SerotecMCA551F)。用Becton Dickinson溶解液來(lái)溶解紅細(xì)胞，用PBS來(lái)洗滌白細(xì)胞并用含2％甲醛的PBS再混懸。用裝有Lysys II軟件的FACScan(Becton Dickinson)，通過(guò)流動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)分析表面結(jié)合的FITC。
實(shí)施例10在本發(fā)明另一實(shí)施例中，按下列方法合成用來(lái)調(diào)節(jié)膀胱上皮頂膜Na+通道在細(xì)胞表面含量的試劑。按標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)，用胃蛋白酶，從細(xì)胞表面標(biāo)志膀胱上皮細(xì)胞的高親和力單克隆抗體來(lái)制備B區(qū)，并通過(guò)凝膠過(guò)濾來(lái)純化(MarTin，F(xiàn)J；Hubbell，WL；和PapahadjopoHlos，D，1981，Biochemistry 204229—4238)。如實(shí)施例7所述，從A血清型肉毒桿菌神經(jīng)毒素制備E和T區(qū)，迅速結(jié)合，并如該實(shí)施例所述結(jié)合到B區(qū)。
用泌尿上皮細(xì)胞來(lái)檢驗(yàn)試劑對(duì)醛固酮刺激的阿米洛利(amiloride)敏感的Na+通道增加的作用。按原來(lái)培養(yǎng)方法，從鼠的膀胱來(lái)制備的膀胱上皮細(xì)胞(Johnson，MD；Bryan，GT；Reznikoff，CA；1985，J Urol 133，1076—1081)，在含或不含試劑下，在37℃恒溫培養(yǎng)90分鐘。將醛固酮處理的細(xì)胞在醛固酮中暴露1小時(shí)。如上所述處理后，迅速洗滌細(xì)胞并測(cè)定在37℃恒溫培養(yǎng)5分鐘后攝入的阿米洛利敏感的22Na+。
實(shí)施例11在本發(fā)明另一實(shí)施例中，按下列方法合成用來(lái)調(diào)節(jié)B細(xì)胞引導(dǎo)抗原的試劑。按標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)，用胃蛋白酶從黑猩猩B細(xì)胞單克隆抗體LL12來(lái)制備B區(qū)，并通過(guò)凝膠過(guò)濾來(lái)純化(Martin，F(xiàn)J；Hubbell，WL&Papahadjopoulos，D，1981，Biochemistry，20，4229—4238)。如實(shí)施例3所述，用A血清型肉毒桿菌神經(jīng)毒素來(lái)制備E和T區(qū)。迅速結(jié)合并如該實(shí)施例所述結(jié)合到B區(qū)上。
用鼠的B淋巴瘤細(xì)胞系TA3來(lái)檢驗(yàn)試劑對(duì)引導(dǎo)抗原的作用。首先將這些細(xì)胞和試劑在37℃下恒溫培養(yǎng)90分鐘、然后加入雞卵溶菌酶(HEL)并在37℃繼續(xù)恒溫培養(yǎng)2小時(shí)。將TA3細(xì)胞固定并在用I—AK—限制的HEL 46—61的特異T細(xì)胞雜交瘤3A9培養(yǎng)前洗滌(Lorenz，RG&Allen，PM，1989，Nature 337，560)。用3A9細(xì)胞的上清液來(lái)檢驗(yàn)其支持IL—2依賴細(xì)胞系，CTLL生長(zhǎng)的能力。用上清液培養(yǎng)2天后，通過(guò)混入3H—胸苷3小時(shí)后來(lái)測(cè)定增殖的應(yīng)答。
上述實(shí)施例完全為說(shuō)明本發(fā)明。對(duì)本專業(yè)技術(shù)人員而言，很清楚，三個(gè)區(qū)的任何結(jié)合都在本發(fā)明范圍內(nèi)。在合成試劑時(shí)，通過(guò)化學(xué)結(jié)合，用本專業(yè)技術(shù)人員公知的試劑和技術(shù)，將本發(fā)明的T—E成分結(jié)合到靶向成分。因此，盡管所給的實(shí)施例只使用SPDP結(jié)合試劑，但任何其它能共價(jià)結(jié)合到試劑靶向部分的結(jié)合試劑和本專業(yè)技術(shù)人員公知的結(jié)合試劑都包含在本申請(qǐng)范圍內(nèi)。同樣，對(duì)本專業(yè)技術(shù)人員而言，很明顯，對(duì)整個(gè)試劑或試劑片斷的任一編碼都可以很容易地建立，并且當(dāng)在適宜的有機(jī)體上表達(dá)時(shí)，可用來(lái)產(chǎn)生試劑或試劑片斷。通過(guò)本專業(yè)技術(shù)人員公知的技術(shù)得到的本發(fā)明試劑的遺傳結(jié)構(gòu)也包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。
本發(fā)明所述試劑可體內(nèi)直接或以其可藥用的鹽或酯，在治療各種病理生理性疾病的方法中使用。
例如，在治療葡萄糖代謝障礙的方法中，使用一種試劑來(lái)限制某些細(xì)胞的糖攝入。一個(gè)具體例子是在通過(guò)限制脂細(xì)胞攝入葡萄糖并因此而減少在這些細(xì)胞中積累脂來(lái)治療臨床上的肥胖癥的方法中使用一種形式的試劑。
在另一實(shí)施例中，在治療高血壓的方法中使用一種試劑來(lái)調(diào)節(jié)腎細(xì)胞對(duì)離子的攝入因而控制這些器官的液體攝入。
在又一實(shí)施例中，在治療炎癥的方法中，使用一種試劑來(lái)控制靶細(xì)胞對(duì)觸發(fā)炎性應(yīng)答的外境信號(hào)的應(yīng)答。
在又一實(shí)施例中，在治療免疫障礙的方法中，使用一種試劑來(lái)控制抗原引入細(xì)胞將肽序列引導(dǎo)入免疫系統(tǒng)的效應(yīng)器細(xì)胞中。
表1在3T3—LI成纖維細(xì)胞中IGF—1對(duì)125I—轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合的上調(diào)作用處理方式IGF—1％基本結(jié)合±SD*對(duì)照－100±28(n＝3)＋258±46(n＝3)BoNT—B －100±8(n＝3)＋149±27(n＝3)*以不含IGF—1的特異結(jié)合的百分?jǐn)?shù)來(lái)表示125I—轉(zhuǎn)鐵蛋白與3T3—LI成纖維細(xì)胞的特異性結(jié)合。
表2在3T3—LI成纖維細(xì)胞中IGF—1對(duì)結(jié)合125—轉(zhuǎn)鐵蛋白的上調(diào)作用處理方式IGF—1 ％基本結(jié)合±SD*對(duì)照－ 100±28(n＝3)＋ 258±46(n＝3)BoNT—A － 100±44(n＝3)＋ 149±10(n＝3)*以不含IGF—1的特異性結(jié)合的百分?jǐn)?shù)來(lái)表示125I—轉(zhuǎn)鐵蛋白與3T3—LI成纖維細(xì)胞的特異性結(jié)合。
表3在3T3—LI成纖維細(xì)胞中IGF—1對(duì)結(jié)合125I—轉(zhuǎn)鐵蛋白的上調(diào)作用處理方式IGF—1 ％基本結(jié)合±SD*對(duì)照－ 100±28(n＝3)＋ 258±46(n＝3)H2L—A － 100±15(n＝3)＋ 134±60(n＝3)*以不含IGF—1的特異結(jié)合的百分?jǐn)?shù)來(lái)表示125I—轉(zhuǎn)鐵蛋白與3T3—LI成纖維細(xì)胞的特異性結(jié)合。
表4 3T3—LI脂細(xì)胞攝入的[3H]—2—脫氧葡萄糖基本 胰島素刺激的對(duì)照 1655±67(n＝3) 14328±264(n＝3)BoNT—A處理2306±49(n＝3) 5587±322(n＝3)該結(jié)果是三次測(cè)定的平均值±SEM并給出在10分培養(yǎng)期內(nèi)細(xì)胞單層所消耗的總dpm。
權(quán)利要求
1.一種通過(guò)控制由可再循環(huán)的膜泡將組成膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜來(lái)控制細(xì)胞與其外環(huán)境相互作用的試劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑，用以控制引起對(duì)代謝物跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的IMP的水平并因此控制細(xì)胞內(nèi)代謝物的可用性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑，用以控制引起對(duì)代謝物跨細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞或離開(kāi)細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)的IMP的水平并因此控制代謝物通過(guò)細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑，用以控制引起對(duì)離子選擇性通過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜的IMP的水平并因此調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的離子濃度。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑，用以控制引起對(duì)信號(hào)分子的識(shí)別的IMP的水平并因此調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)信號(hào)分子的應(yīng)答性。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑，用以＋控制通過(guò)將信號(hào)分子結(jié)合于膜上而引起信號(hào)跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)導(dǎo)的IMP水平并因此調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)發(fā)生信號(hào)的應(yīng)答性。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑，用以控制引起從攝入的抗原衍生的肽片斷在細(xì)胞表面的顯現(xiàn)的IMP水平。
8.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的試劑，它對(duì)靶細(xì)胞種類具有靶向特異性，因此，該試劑的作用范圍局限于所說(shuō)種類的細(xì)胞。
9.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的試劑，其中包含如下聯(lián)接在一起的三區(qū)B、T和EB區(qū)…T區(qū)…E區(qū)其中B區(qū)為結(jié)合區(qū)，它將試劑結(jié)合到細(xì)胞的結(jié)合點(diǎn)上，而該細(xì)胞可進(jìn)行細(xì)胞攝粒作用形成該內(nèi)體。T區(qū)為易位區(qū)，它將試劑(有或無(wú)結(jié)合點(diǎn))從核內(nèi)體內(nèi)跨越核內(nèi)體膜易位到細(xì)胞的胞液中。E區(qū)為效應(yīng)器區(qū)，它抑制RMVs將IMPs轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面的能力。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的試劑，其中包含如下聯(lián)接在一起的三區(qū)B、T和EB區(qū)…X…T區(qū)…X…E區(qū)其中X為間隔分子或共價(jià)鍵，但至少一個(gè)X為間隔分子。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10的試劑，其中結(jié)合區(qū)B區(qū)結(jié)合到結(jié)合點(diǎn)上，該結(jié)合點(diǎn)是特殊種類細(xì)胞的特征。
12.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的試劑，其中B區(qū)包括能進(jìn)行細(xì)胞攝粒作用以便形成核內(nèi)體的靶細(xì)胞的表面抗原的單克隆抗體。T區(qū)包括毒素分子區(qū)或區(qū)域片斷，它將試劑從產(chǎn)生的核內(nèi)體內(nèi)易位到細(xì)胞的胞液中。E區(qū)包括不同的毒素分子區(qū)或區(qū)域片斷，它與T區(qū)功能的區(qū)別在于具有Zn2+依懶型蛋白酶活性。
13.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的試劑，其中B區(qū)包括能進(jìn)行細(xì)胞攝粒作用以便形成核內(nèi)體的靶細(xì)胞的細(xì)胞表面受體的配體。T區(qū)為易位區(qū)，它將試劑(有或無(wú)結(jié)合點(diǎn))從核內(nèi)體內(nèi)跨越核內(nèi)體膜易位到細(xì)胞的胞液中。E區(qū)為效應(yīng)器區(qū)，它抑制RMVs將IMPs轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面的能力。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的試劑，它通過(guò)應(yīng)答胰島素的脂細(xì)胞來(lái)影響葡萄糖的攝入速率，其中B區(qū)為胰島素依懶型生長(zhǎng)因子II受體的配體T區(qū)為將毒素跨細(xì)胞膜易位的肉毒桿菌神經(jīng)毒素的重鏈區(qū)或區(qū)域片斷。E區(qū)為具有Zn2+依懶性嗜金屬蛋白酶活性的肉毒桿菌神經(jīng)毒素的輕鏈區(qū)或區(qū)域片斷。
15.根據(jù)權(quán)利要求9—14中任一項(xiàng)的試劑，其中T和E區(qū)是從梭狀芽胞桿菌神經(jīng)毒素得到的。
16.制備根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的試劑的方法，包括以下列方式共價(jià)聯(lián)接三區(qū)B、T和EB區(qū)…T區(qū)…E區(qū)其中B區(qū)包括能進(jìn)行細(xì)胞攝粒作用以便形成核內(nèi)體的靶細(xì)胞的細(xì)胞表面受體的配體。T區(qū)為易位區(qū)，它將試劑(有或無(wú)結(jié)合點(diǎn))從核內(nèi)體內(nèi)跨越核內(nèi)體膜易位到細(xì)胞的胞液中。E區(qū)為效應(yīng)器區(qū)，它抑制RMVs將IMPs轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面的能力。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的制備試劑的方法，包括以下列方式共價(jià)連接三區(qū)B、T和EB區(qū)…X…T區(qū)…X…E區(qū)其中X為間隔分子或共價(jià)鍵，但至少一個(gè)X為間間隔分子。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17的方法，其中結(jié)合區(qū)B區(qū)結(jié)合到結(jié)合點(diǎn)上，該結(jié)合點(diǎn)是特殊種類細(xì)胞的特征。
19.制備根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求中的試劑的方法，包括構(gòu)建編碼該試劑的基團(tuán)結(jié)構(gòu)，將該結(jié)構(gòu)與宿主生物體結(jié)合并表達(dá)該結(jié)構(gòu)從而產(chǎn)生該試劑。
20.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的試劑或其藥用鹽在治療葡萄糖代謝疾病中的應(yīng)用。
21.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的試劑或其藥用鹽在治療臨床肥胖疾病中的應(yīng)用。
24.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的試劑或其藥用鹽在治療高血壓疾病中的應(yīng)用。
23.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的試劑或其藥用鹽在治療炎性疾病中的應(yīng)用。
24.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的試劑或其藥用鹽在治療免疾系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明描述一種靶向控制哺乳動(dòng)物細(xì)胞活性的新試劑，尤其是該試劑用于控制特定細(xì)胞與其外界環(huán)境的相互作用。該試劑可用作治療各種疾病的藥物。本發(fā)明試劑含有按下列方式連在一起的B、T和E三個(gè)區(qū)區(qū)B—區(qū)T—區(qū)E，其中區(qū)B為結(jié)合區(qū)，它與進(jìn)行攝粒作用產(chǎn)生核內(nèi)體的細(xì)胞的結(jié)合部位相結(jié)合，T區(qū)為易位區(qū)，它將試劑(有或無(wú)結(jié)合點(diǎn))從核內(nèi)體跨越核內(nèi)體膜易位到細(xì)胞的胞液中，E區(qū)為效應(yīng)器區(qū)，它抑制RMVs轉(zhuǎn)運(yùn)IMPs到細(xì)胞表面的能力。
文檔編號(hào)C07K14/33GK1124929SQ9419212
公開(kāi)日1996年6月19日 申請(qǐng)日期1994年3月18日 優(yōu)先權(quán)日1993年3月19日
發(fā)明者J·R·諾斯, K·A·福斯特, C·P·昆, C·C·肖恩 申請(qǐng)人:斯佩伍德實(shí)驗(yàn)室有限公司, 微生物研究中心