鑒定細胞群體、特別是間充質(zhì)干細胞群體的多色流式細胞術(shù)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于借助于差示特異性熒光活化細胞分選（FACS)對間充質(zhì)干細胞（MSC) 和其它細胞類型的進行鑒定并進而進行分離的領(lǐng)域。即，本發(fā)明是處于各種相對特定濃度 的試劑或物質(zhì)組合物，所述試劑或物質(zhì)組合物由于試劑中的標記的細胞標志物的各種特定 濃度而令人意外地對標記的細胞提供了醫(yī)學(xué)（或生理學(xué)）效應(yīng)。本發(fā)明是用于借助于特定 的相對試劑濃度對細胞進行選擇性分離的試劑和方法。本發(fā)明人提供了一種令人意外的 手段，通過這種手段，可以使物質(zhì)組合物作為藥物區(qū)別地作用于細胞上，從而使得能夠利用 熒光活化細胞分選（FACS)在七種以上細胞表面標志物存在或不存在時對細胞進行同時鑒 定。
【背景技術(shù)】
[0002] 間充質(zhì)干細胞（MSC)由于其在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的潛力而受到巨大關(guān)注，且被用于針 對多種病癥的臨床試驗中。MSC已在患急性心肌梗死[1，2]、腦卒中[3]、多系統(tǒng)萎縮（MSA)
[4]、移植物抗宿主疾病[5]和脊髓損傷[6]的患者中顯示出治療益處的潛力。國際細胞 療法協(xié)會（ISCT)建立了一套用于鑒定MSC的最低標準[7]。這些標準是：i)對塑料的粘 附性，ii)分化為脂肪細胞、軟骨細胞和骨細胞，和iii)細胞表面分子的特定表達模式。前 兩個標準在不同條件下的細胞培養(yǎng)物中進行評估，而第三個標準可以利用多色流式細胞術(shù) (MFC)來評估。為了被鑒定為MSC，細胞群體中大于95%必須表達⑶73 (外5'-核苷酸酶）、 CD90(Thy-l)和 CD105(內(nèi)皮因子），并且對于 CDllb 或 0)14、0)34、0)45、0)19或0)79〇和 HLA-DR為陰性（彡2%陽性細胞）[7]。
[0003] 傳統(tǒng)上一直使用平行管法對MSC的表面標志物模式進行分析：多個樣品管，每管 具有兩至四種抗體的組合，所述抗體各自綴合至不同的熒光團。這具有實踐上的限制。例 如，在假設(shè)細胞群體是均質(zhì)的前提下對來自這些平行管的結(jié)果進行分析，并報告表面標志 物的百分比表達。
[0004] 迄今為止所公布的針對MSC的多色試劑組的實例忽視了所推薦的細胞標志物 的ISCT標準（Martins等，2009 ;Jones等，2006)、利用平行管而不是單管法（Tucker和 Bunnell, 2011)或者利用定制的綴合物和最常見的熒光色素（Bradford和Clarke, 2011)從 而產(chǎn)生一種不靈活的無法適用于個體研究要求的工具。在某些情形中，研究人員并沒有確 認被流式細胞術(shù)鑒定為MSC的細胞也符合另外兩條最低標準：對塑料的粘附性和三系分化 能力（Martins 等，2009)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明人出人意料地開發(fā)了一種多色流式細胞術(shù)（MFC)試劑組（panel)，其包括 ISCT推薦的在塑料粘附性細胞上的間充質(zhì)干細胞MSC標志物，所述塑料粘附性細胞已證實 能分化為脂肪細胞、軟骨細胞和骨細胞。本發(fā)明人已設(shè)計了一種核心試劑組，其不采用與三 種最常用的熒光色素綴合物（即FITC(異硫氰酸熒光素）、PE(藻紅蛋白）和APC(別藻藍 蛋白））綴合的試劑，從而使得上述三個位置能被用作可交換的占位位置（placeholder)， 并允許將所述核心試劑組與其它所關(guān)注的抗原結(jié)合使用。本發(fā)明人已經(jīng)驗證了利用來自兩 種常用組織來源（即臍帶基質(zhì)和BM抽吸物）的MSC的試劑組。本發(fā)明人還確保了所述試 劑組可以用于鑒定非均質(zhì)群體中的MSC。
[0006] 多色流式細胞術(shù)（MFC)與單色流式細胞術(shù)不同，其在檢測試驗的開發(fā)中帶來了更 高的技術(shù)難度。為了同時分析幾種表面標志物，每種表面標志物需要特定的檢測用抗體。在 流式細胞術(shù)中，最好是使用與熒光色素直接綴合的抗體，而不是使用用于檢測的一抗和用 于信號放大的二抗。因此，當同時使用多種抗體時，必須明智地選取與其綴合的熒光色素從 而使它們不會在其發(fā)射波長上重疊。簡而言之，應(yīng)該選擇在彩色光譜中盡可能相互遠離的 熒光色素。成功主要取決于三個因素：最佳滴定的抗體，準確的補償，和抗原-熒光色素平 衡。下文將更詳細地討論如何將此實現(xiàn)。
[0007] 本發(fā)明的方法相比平行管法具有幾個優(yōu)點。首先，對于在臨床設(shè)定中對患者樣品 或治療性細胞產(chǎn)品中的特定細胞類型進行準確定量而言，關(guān)鍵在于在單細胞水平鑒定細胞 表型的準確性的提高。這也會帶來提高的檢測靈敏度，使得能夠利用成熟的分析策略在混 合細胞樣品中鑒定出MSC。這在研究可能是非均質(zhì)的臨床樣品時尤為優(yōu)越。其次，單管流 式細胞術(shù)使得能從例如活組織檢查物或兒科樣本等小樣品中獲得最大化的信息，并且其還 有助于更大的研究項目，因為對每個研究對象僅需一個試管。最后，多色法有助于檢測不同 類型的MSC，并允許同時分析表型和功能性，例如細胞因子生成、凋亡和細胞周期分析（De Rosa 等，2003)。
[0008] 本發(fā)明提供了鑒定和分離/俘獲新型細胞類型的高通量細胞藥物發(fā)現(xiàn)技術(shù)以及 與高通量細胞分選/自動化細胞篩選結(jié)合的算法。本發(fā)明使得能夠通過該算法對上千種標 志物、顏色和標志物-顏色組合進行自動化和計算分析以鑒定新型細胞類型，從而鑒定候 選細胞，例如鑒定具有7種經(jīng)典MSC標志物而且對于例如⑶62呈陽性的新型細胞。利用下 文的算法可以限定FACS實驗，測試標志物、抗體和顏色的組合，以在候選細胞存在時對其 進行鑒定/俘獲。這一過程首次允許將『合理的』藥物設(shè)計方法應(yīng)用于細胞醫(yī)藥，從而使得 研究人員能夠設(shè)計新型細胞類型并對其進行經(jīng)驗測試。因此，這使研究人員在實踐中能夠： (i)構(gòu)建理論上最佳的細胞，例如表達7種經(jīng)典MSC標志物以及CXCR4和⑶62的細胞，（ii) 計算所要測試的潛在FACS試劑組，用來分離上述細胞（如果存在），然后（iii)與自動化 分選結(jié)合來從上千種組織樣品中分離/捕獲這種細胞，和（iv)通過其獨特的FACS標志物 譜來嚴格地測試并證實候選細胞的新穎性。在沒有本發(fā)明的情況下，過程（i-iv)需要數(shù)月 的『試錯』研究，其涉及到上百次實驗室實驗。利用本發(fā)明的組合物和算法的組合，使研究 人員能使細胞藥物發(fā)現(xiàn)自動化和合理化，并能夠利用計算方法（包括超計算）來計算得到 對新型細胞的更快、更準確且更高效和有效的鑒定和捕獲。
[0009] 本發(fā)明存在幾個方面。間充質(zhì)干細胞（MSC)免疫熒光標記試劑包括單克隆抗體與 MSC的綴合物，所述MSC表達⑶73 (外5' -核苷酸酶）、⑶90 (Thy-I)和⑶105 (內(nèi)皮因子） 并且對于⑶Ilb或⑶14、⑶34、⑶45、⑶19或⑶79 α和HLA-DR呈陰性[7]，已在實驗中針對 會產(chǎn)生藥物效應(yīng)的相對特定濃度對它們進行了選擇，所述藥物效應(yīng)呈現(xiàn)出特定表型，該特 定表型允許對特定的細胞類型實現(xiàn)改善的鑒定甚至樣品收集。本發(fā)明的一個方面是作為改 變檢測測試中的對象細胞的表型性表達的試劑藥（藥物），即，作為對間充質(zhì)干細胞（MSC) 進行免疫熒光標記以便通過在不同測試中選擇性地改變免疫熒光抗體標記的相應(yīng)濃度來 對所述細胞進行更好地表征的試劑，以及包含抗體的實驗室試劑，所述抗體包括但不限于 針對以下細胞類型的抗體：成纖維細胞（CD10、CD29、CD106) ;VSELS(Sca-l、CD45R、Gr-U TCRa -β、TCRy - δ、CDllb、Terll9、Oct-4 ;HSC:CD133) ;EPC(KDR、VE-f丐粘蛋白、CD31); MSC 亞型（CD181、CD184);和組織定向干細胞（tissue-committed stem cell) (CD117+、 ⑶184、c-met、AC133)。另外，另一方面是執(zhí)行這些程序的試劑盒。
[0010] 在本發(fā)明中，新型FACS并非僅用于鑒定表達特定標志物的細胞，而且還出人意料 地提供了影響細胞表型的物質(zhì)組合物，從而允許借助于改變（活性成分）的對應(yīng)濃度來對 細胞群體中的間充質(zhì)干細胞（MSC)容易地進行鑒定甚至分離，所述活性成分是單克隆抗 體與MSC的綴合物但不限于此。由此，所述試劑的活性成分允許利用熒光活化細胞分選 (FACS)來在一定濃度范圍內(nèi)對各種MSC進行同時鑒定。由此，所述試劑允許對群體中的在 表面上展示出可檢測水平的⑶73、⑶90和⑶105但不展示可檢測水平的⑶14、⑶19、⑶34 和CD45的MSC進行差示性檢測，并且分離出具有該表面標記物模式的MSC細胞。本發(fā)明還 提供了一種試劑，其用于借助于其反應(yīng)性組分的測得相對濃度來鑒定和分離細胞群體中的 特定細胞類型，所述鑒定和分離包括利用FACS來同時鑒定在所述群體中的細胞表面上是 否存在指示特定細胞類型的七種以上細胞表面標志物，并分離出具有指示性細胞表面標志 物的細胞。其中，所述試劑可以在體外、體內(nèi)和離體使用，以便在人或動物中起作用并作用 于干細胞和非干細胞，包括但不限于與介質(zhì)、賦形劑、無活性添加劑、血液、組織和其它體液 組合應(yīng)用；包括但不限于與流式細胞術(shù)結(jié)合應(yīng)用，而其應(yīng)用可以包括但不限于對來自組織、 血液、溶液和包括冷凍樣品的固體以及病理樣本的細胞的分離、檢測和輔助收集。
[0011] 本發(fā)明人在本文中提供了一種令人驚訝的手段，通過該手段，物質(zhì)組合物可以作 為藥物作用于細胞上，從而允許用戶利用熒光活化細胞分選（FACS)同時鑒定是否存在七 種以上細胞表面標志物。
[0012] 由此提出了一種表型分型的算法和試劑組，其是一種從其他細胞中鑒定、分離和 區(qū)分出間充質(zhì)干細胞（MSC)的手段，但不限于此，所述其它細胞為外周血、骨髓、脂肪、活組 織檢查樣品中的細胞，或為分離自任何其它組織的細胞或借助于轉(zhuǎn)分化而由IPS產(chǎn)生或改 造獲得的細胞。發(fā)明人提供了對MSC表型的改良的預(yù)測，這通過熒光團ISCT核心組和算法 手段來實現(xiàn)，通過該手段可更好地預(yù)測MSC表型。MSC具有在再生醫(yī)學(xué)療法領(lǐng)域中應(yīng)用的 潛力，且正被用在多種病癥的臨床試驗中。由此，國際細胞療法協(xié)會（ISCT)已建立了一套 用于鑒定MSC的最低標準，包括通過多色流式細胞術(shù)（MFC)測定的特定的細胞表面分子表 達模式。針對MSC的表面標志物表達的MFC方法在傳統(tǒng)上一直使用多個平行樣品。能夠進 行MSC單樣品多色分析具有許多優(yōu)點。在本研究中，本發(fā)明人報道了對由7熒光團MSC鑒 定用ISCT核心組和3個占位位置（其可用在用來鑒定不同MSC亞型的試劑中）組成的10 熒光團試劑組的開發(fā)。該試劑組可以用來對骨髓和臍帶基質(zhì)MSC進行表型分型，并且區(qū)分 成纖維細胞和外周血單個核細胞的混合群體中的稀有MSC事件。該工具提供了鑒定和定量 血液和骨髓中的MSC的有價值的方法，并且還能用于來自經(jīng)消化的組織的單細胞懸浮液。
[0013] 發(fā)明人出人預(yù)料地展示出，可以利用熒光活化細胞分選（FACS)來同時鑒定是否 存在七種以上的細胞表面標志物。
[0014] 本發(fā)明提供了一種鑒定并可選地分離細胞群體中的MSC的方法，其包括利用FACS 同時鑒定群體中的在表面上展示出可檢測水平的CD73、CD90和CD105但不展示可檢測水平 的⑶14、⑶19、⑶34和⑶45的細胞，并由此鑒定并可選地分離細胞群體中的間充質(zhì)干細胞 (MSC)。所述七種標志物的存在或不存在利用FACS來同時鑒定。所述七種標志物的存在或 不存在在同一時間得到鑒定。本發(fā)明的方法利用群體的一個樣品。其不涉及平行管法。
[0015] 本發(fā)明還提供了一種鑒定并可選地分離細胞群體中的特定細胞類型的方法，其包 括利用FACS同時鑒定在所述群體中的細胞的表面上是否存在指示所述特定細胞類型的七 種以上細胞表面標志物。
[0016] 本發(fā)明提供了一種用于鑒定并可選地分離細胞群體中的間充質(zhì)干細胞（MSC)的 試劑盒，其包括七種以上帶熒光標記的抗體，其中所述試劑盒中的至少一種抗體與CD73、 ⑶90、⑶105、⑶14、⑶19、⑶34和⑶45的每一種特異性結(jié)合。
[0017] 本發(fā)明還提供了一種用于鑒定并可選地分離細胞群體中的特定細胞類型的試劑 盒，其包括七種以上帶熒光標記的抗體，其中所述試劑盒中的至少一種抗體與指示所述特 定細胞類型的七種以上細胞表面標志物中的一種特異性結(jié)合。
[0018] 本發(fā)明提供了一種用于鑒定并可選地分離細胞群體中的MSC的試劑和試劑盒，所 述鑒定包括利用FACS同時鑒定群體中的在其表面展示出可檢測水平的⑶73、⑶90和⑶105 但不展示可檢測水平的⑶14、⑶19、⑶34和⑶45的細胞，并由此鑒定細胞群體中的間充質(zhì) 干細胞（MSC)。這七種標志物的存在或不存在利用FACS來同時鑒定。
[0019] 本發(fā)明還提供了一種用于鑒定并可選地分離細胞群體中的特定細胞類型的試劑， 所述鑒定包括利用FACS同時鑒定在所述群體中的細胞的表面上是否存在指示所述特定細 胞類型的七種以上細胞表面標志物。
[0020] 本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生熒光標記抗體組的方法，所述熒光標記抗體組用于利用 FACS分析來同時鑒定是否存在七種以上細胞表面標志物，所述方法包括：（a)選擇七種以 上細胞表面標志物；(b)將陽性標志物分散在不同的激光器上；（c)選擇七種以上帶熒光標 記的抗體；（d)滴定所述抗體以確保在已知所述七種以上標志物的表達（陽性和陰性）的 細胞上實現(xiàn)最佳濃度和最小的光譜重疊；（e)測試針對陽性細胞表面標志物的抗體；(f)測 試抗體核心組；(g)誘導(dǎo)或刺激細胞以表達占位標志物；(h)測試并滴定占位抗體；（i)優(yōu) 化占位條件；和（j)在不存在其它細胞類型時和在混合的群體中在細胞上對完整的組進行 測試。
[0021] 本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明的方法產(chǎn)生的熒光標記抗體組，其用于利用FACS分 析來同時鑒定是否存在七種以上細胞表面標志物。
[0022] 本發(fā)明還提供了一種鑒定并可選地分離細胞群體中的新型細胞類型的方法，其包 括利用FACS同時鑒定在所述群體中的細胞的表面上是否存在七種以上細胞表面標志物， 其中所述七種以上標志物中的至少一些指示特定的細胞類型，并且所述七種以上的標志物 中的至少一種未被所述特定細胞類型可檢測地表達。
【附圖說明】
[0023] 圖1顯示了用10色試劑組染色的U