成分分析裝置、藥效分析裝置和分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及對新藥開發(fā)有用的、對于藥物的攝取、代謝、排泄這樣的藥物動力學(xué)的整體情況的體外(in vitro)評價。
【背景技術(shù)】
[0002]在新藥開發(fā)工序中，在藥劑法上必須要進行對人體的體內(nèi)給藥、驗證效能的臨床試驗(“人體臨床試驗”)，但是人體臨床試驗、動物實驗試驗需要龐大的開發(fā)費。近年來，這些開發(fā)費成為最大的原因，新藥開發(fā)整體的成本在增加。作為其中的一個原因大多是因為，針對在開發(fā)工序前期的非臨床動物實驗中無法檢測到藥效不良、毒性的藥劑候選物，在開發(fā)工序后期的人體臨床試驗中首次發(fā)現(xiàn)藥效不良、毒性，而至此為止的開發(fā)成本、人體臨床試驗所花費的成本變得白費。
[0003]從這樣的背景出發(fā)，為了提高人體臨床試驗的通過率、試圖削減新藥開發(fā)成本，在早期就縮小能呈現(xiàn)藥效且沒有發(fā)現(xiàn)毒性的新藥候選物質(zhì)的范圍變得重要。對此，許多制藥企業(yè)期望能有一種體外(in vitro)評價系統(tǒng)，該評價系統(tǒng)在藥物研發(fā)的初期階段，不是只采用與人體細胞的特性相關(guān)性低的動物實驗來縮小藥劑候選物的范圍，而是能夠使用人體細胞來良好地預(yù)測給藥藥物在人體體內(nèi)的藥物動力學(xué)。然而，還沒有確立利用細胞來對被給藥的藥品候選化合物的攝取、代謝、膽管和血管排泄這樣的藥物動力學(xué)的整體情況進行把握、解析的方法。
[0004]藥劑為了在體內(nèi)發(fā)揮藥效，已經(jīng)被攝取到肝臟中的藥劑需要成為代謝產(chǎn)物、或者不被代謝而是作為原來的化合物(母體化合物)而排出到血管側(cè)，然后再次隨著血液流而進行再循環(huán)，到達目標臟器、器官。因此，在體外試驗系統(tǒng)中也是這樣，如果能測定在給藥后排出到血管側(cè)的藥品候選化合物的再循環(huán)部分，對于在新藥開發(fā)中最重要的指標之一的藥效進行評價，則能夠成為非常有用的藥物動力學(xué)評價方法。此外，通過探明藥物動力學(xué)整體情況(藥物動力學(xué)整體情況包括在膽管排泄后作為尿、便排泄到體外的、從細胞排泄到膽管的部分(消失部分)、細胞內(nèi)殘留部分)，則能夠求得向各組分的分配比率。
[0005]專利文獻1和專利文獻2中，公開了迄今為止向培養(yǎng)細胞給予藥劑，對從細胞的膽管排泄的部分(消失部分)進行評價的方法。該評價方法是對藥劑消失部分進行評價的方法，上述藥劑消失部分為，給藥藥劑不發(fā)揮毒性、藥效而排泄到膽管中，之后作為尿、便排泄到體外的部分。
[0006]現(xiàn)有技術(shù)文獻
[0007]專利文獻
[0008]專利文獻1:日本特開2012-65659
[0009]專利文獻2:日本特開平8-503610

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]發(fā)明要解決的問題
[0011]現(xiàn)有技術(shù)只是對于膽管排泄量、即沒有藥效的成分的量進行評價的方法，是對體外消失部分進行評價的方法。但是，為了獲取具有藥效的成分的信息，希望直接評價排泄到血管側(cè)的成分的量，然而現(xiàn)有技術(shù)中還沒有確立對于排泄到血管的成分的量進行解析的方法。進一步，不只是對于藥物動力學(xué)的一部分進行評價，而是對于給藥藥劑的血管(基部/基側(cè))側(cè)排出組分、管腔(頂部)側(cè)排出組分、細胞內(nèi)殘留組分這樣的、給藥藥劑從細胞的何處被排泄出、存積在何處，進行細分定量，從而能在體外提供藥物動力學(xué)整體情況，進行更高精度的藥效評價，但是還沒有確立這樣的評價方法。
[0012]解決問題的方法
[0013]例如為一種成分分析裝置，其特征在于，具備:調(diào)整上述多個容器內(nèi)的溫度的溫度調(diào)整部，以及測定上述多個容器內(nèi)的成分、并且對該測定的上述成分進行解析的分析部；上述多個容器為至少第1容器、第2容器；上述第1容器內(nèi)和上述第2容器分別保持第1緩沖液；上述溫度調(diào)整部進行調(diào)整以使得上述第1容器內(nèi)的溫度與上述第2容器內(nèi)的溫度成為不問溫度；
[0014]上述分析部測定從上述第1容器內(nèi)的細胞向上述第1容器內(nèi)的上述第1緩沖液排出的成分的量、以及從上述第2容器內(nèi)的細胞向上述第1容器內(nèi)的上述第1緩沖液排出的成分的量，并且對于通過上述細胞的轉(zhuǎn)運蛋白而排出的上述成分的量進行解析。
[0015]發(fā)明效果
[0016]通過應(yīng)用本發(fā)明，能夠直接地評價排泄到細胞的血管側(cè)的藥劑等成分。進一步，通過對藥品候選化合物(母體化合物和代謝產(chǎn)物)在轉(zhuǎn)運蛋白途徑和擴散途徑中的血管(基部/基側(cè))側(cè)排出組分和管腔(頂部)側(cè)排出組分、以及細胞內(nèi)殘留組分進行定量，并且判定被給藥的藥品候選化合物的總量和向各組分的分配比率，從而對被給藥的藥品候選化合物的動力學(xué)進行評價成為可能，能夠提高從龐大數(shù)量的藥品候選化合物中體外篩選出發(fā)揮藥效的藥劑候選物的篩選精度。其結(jié)果是，能夠在早期縮小藥品候選化合物的范圍，減少無用的動物實驗、無用的人體臨床試驗。對于降低對制藥企業(yè)來說成為沉重負擔的新藥開發(fā)成本做出貢獻。
【附圖說明】
[0017]圖1為培養(yǎng)板；
[0018]圖2為樣品調(diào)制流程；
[0019]圖3為工序4、5、6的定量對象和藥物分布示意圖；
[0020]圖4為各組分的定義和⑶F的結(jié)果；
[0021]圖5為⑶F的分配比率；
[0022]圖6為羅丹明123的分配比率；
[0023]圖7為自動測量裝置構(gòu)成圖；
[0024]圖8為樣品調(diào)制部的上表面圖；
[0025]圖9為樣品調(diào)制部的正面圖；
[0026]圖10(a)為自動測量裝置的運作流程圖；
[0027]圖10(b)為自動測量裝置的運作流程圖；
[0028]圖11為吸頭端和吸頭。
【具體實施方式】
[0029]實施例1
[0030]本實施例中，關(guān)于用于上述藥效評價的成分分析方法，按照圖2的工序0?6來進行說明。此外，關(guān)于工序4?6，采用圖3進行詳述。
[0031]其中，在以下的多個實施例中，基于藥效成分的評價方法進行說明，但只是用于說明本申請發(fā)明的一個例子，顯然，藥劑以外的化學(xué)物質(zhì)、進一步還有藥物代謝物的評價也能夠應(yīng)用本申請發(fā)明的成分分析方法。此外，本實施例中給出的緩沖液、溫度、時間等具體的條件只是一個例子，顯然，只要作為技術(shù)構(gòu)思而具有同樣的效果，則也可以應(yīng)用別的條件。
[0032]本實施例中，對于使用試驗區(qū)1?3中的至少3個試驗區(qū)的情況進行說明。各試驗區(qū)中，存在保持細胞的保持區(qū)域，這些保持區(qū)域可以對于各個試驗區(qū)使用不同的容器，也可以將具有多個保持區(qū)域的一個容器內(nèi)進行分取，設(shè)定各試驗區(qū)。
[0033]<工序0:肝細胞的調(diào)制和培養(yǎng)>
[0034]本工序中，首先，進行了用于驗證藥劑效果的肝細胞的調(diào)制、培養(yǎng)。以下示出一個例子。
[0035]肝細胞的調(diào)制按照原位膠原酶灌流法進行。詳細如下。將大鼠(rat) (5?6周齡)在戊巴比妥麻醉的條件下開腹，在門脈中插入導(dǎo)管注入前灌流液(不含Ca2+和Mg'含有EGTA的Hanks液)。在確認到充分進行了從肝臟的脫血之后停止灌流。將灌流液替換為膠原酶溶液，進行灌流。本實施例中使用含有0.05%膠原酶的Hanks液進行灌流，但不限于此。在確認到細胞間組織通過膠原酶而被消化之后，停止灌流。切除肝臟，在冷卻的Hanks液中切細，通過移液分散至細胞。使用等滲Percoll液，將在500G、5分鐘的離心分離中存在損傷的肝細胞除去。所得的肝細胞的生存率用臺盼藍排斥法測量，將生存率85%以上的肝細胞用于培養(yǎng)。這里，將生存率85%以上的肝細胞用于培養(yǎng)，但是顯然，并不必須限于該條件。此外，肝細胞的調(diào)制并不限于原位膠原酶灌流法。使用的肝細胞也不限于源自大鼠，也不限于大鼠的系統(tǒng)。本實施例中利用肝細胞，但不限于此。
[0036]使如前所述的利用原位膠原酶灌流法調(diào)制的肝細胞懸浮于培養(yǎng)基中，在市售的膠原包被培養(yǎng)皿中，將肝細胞以5X 105個細胞/mL的密度在培養(yǎng)基中懸浮播種。播種密度、培養(yǎng)基、培養(yǎng)板001沒有特別限制。培養(yǎng)板示于圖1。這里，示出了包含24個培養(yǎng)區(qū)域(孔，002)的24孔培養(yǎng)板，但不限于此，只要是能夠保持規(guī)定的細胞的容器，則也可以使用其他形狀的容器。播種后，使用0)2培養(yǎng)箱在5% C02、37°C的條件下開始培養(yǎng)。經(jīng)過18小時以上，之后，進行首次培養(yǎng)基交換。對于播種后第18小時以后的培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基沒有特別限制，本實施例中，使用在從培養(yǎng)基(10% FCS+)中去除了 FCS的培養(yǎng)基(以下稱為培養(yǎng)基(FCS-))中添加了基質(zhì)膠的培養(yǎng)基。之后每24小時使用培養(yǎng)基(FCS-)進行培養(yǎng)基交換。如后所述，在工序5中進行3種不同條件下的試驗(試驗區(qū)1、2、3:在工序5中詳述)，因此在該時刻，對于同條件的培養(yǎng)板準備獨立的3個板。從工序0至4和工序5中，對3種試驗區(qū)均進行同樣的試驗操作。
[0037]<工序1:肝細胞的調(diào)質(zhì)>
[0038]本工序中，將通過工序0培養(yǎng)的細胞調(diào)質(zhì)為適于藥劑評價。以下示出一個例子。
[0039]將通過工序0培養(yǎng)了 4天的細胞的培養(yǎng)上清液除去，添加400L的Hanks液作為緩沖液，在37°C培養(yǎng)10分種(圖2工序1)。緩沖液的種類和量沒有特別限定。
[0040]工序1的操作優(yōu)選重復(fù)兩次。通過這樣地將細胞能夠適應(yīng)的成分從工序0的培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基替換為緩沖液(例如Hanks液)，能夠調(diào)整用于在以下的工序中進行正確的測定、解析的基底。但是，顯然，工序1的重復(fù)次數(shù)可以根據(jù)所使用的緩沖液的種類、細胞的種類任意變更。
[0041]〈工序2:藥液給藥〉
[0042]本工序中，將進行評價的藥液給藥至細胞。以下示出一個例子。
[0043]除去緩沖液之后，將10M的⑶F(熒光試劑)200L添加到孔中，在37°C培養(yǎng)30分鐘，然后在4°C保持5分鐘(圖2工序2)。試劑的種類、濃度、量沒有特別限定。由于⑶F發(fā)出熒光，因此可以用酶標儀作為模型試劑來簡便地定量。此外，將給藥量設(shè)定為200 μ L，這是作為孔內(nèi)的細胞整體浸沒在試劑中的量而選擇的。關(guān)于CDF的濃度，只要是以往作為細胞的熒光分析而使用的濃度就可以。作為用于通過酶標儀檢測到的試劑量，也優(yōu)選應(yīng)用本濃度。培養(yǎng)的時間設(shè)定為30分鐘，這是基于預(yù)備研究的結(jié)果而采用的，該預(yù)備研究的結(jié)果是藥劑的攝取和排出基本達到平衡狀態(tài)為止的時間為30分鐘。出于防止所給藥的藥劑向細胞外漏出的目的，在30分鐘培養(yǎng)后將板溫度設(shè)為4°C。這是因為，通過使容器內(nèi)的溫度低，能引起細胞抑制藥劑向外部排出的現(xiàn)象。
[0044]通過這樣使藥劑的溫度為規(guī)定的溫度以下，藥劑留在細胞內(nèi)，能夠抑制向細胞外漏出的現(xiàn)象。本實施例中設(shè)為4°C，但只要是能夠抑制所給藥的藥劑向細胞外漏出的溫度，則不限于此。此外，只要是能夠抑制所給藥的藥劑向細胞外漏出、例如施予抑制劑那樣的方法，則不限于降低溫度的方法。無論如何，工序2中的溫度成為比工序1中設(shè)定的板溫度低的溫度。這是因為，與工序2相反，工序1中的調(diào)質(zhì)優(yōu)選使細胞內(nèi)吸收、排出藥劑的現(xiàn)象活性化的溫度(例如37°C )。
[0045]藥劑給藥的時機不限于本實施例。例如，有時可在試驗日的前一天或者幾天之前就開始進行藥劑給藥。這種情況下，在工序0的階段施予藥劑，工序1、2可省略。
[0046]<工序3:細胞洗滌>
[0047]本工序中，通過工序3洗掉細胞內(nèi)含有的藥液以外的物質(zhì)。以下對一個例子進行說明。
[0048]接著，將板保持于4 °C，直接使用冰冷的400 μ L Hanks液洗滌3次(圖2工序3)。設(shè)定為4°C的目的與前述相同。培養(yǎng)時培養(yǎng)基的量為400 μ L，出于除去殘留在孔內(nèi)壁的培養(yǎng)基成分的目的，將洗滌Hanks液的量設(shè)定為400 μ L。通常的生物化學(xué)分析中洗滌次數(shù)為3次是通例，遵循該通例。各個條件沒有限定。由此，能夠除去成為測定對象的藥液以外的物質(zhì)，進一步提尚后面的工序中藥效評價的精度。
[0049]<工序4:血管側(cè)排出組分回收>
[0050]作為評價藥效的一個指標，有效的是分析所給藥的藥劑是容易在細胞內(nèi)長時間停留、還是只能短時間停留。對此，本工序中，為了取得用于上述指標的數(shù)據(jù)，在后述的工序5評價各試驗區(qū)內(nèi)的細胞之前，使藥劑在規(guī)定時間以內(nèi)從細胞內(nèi)漏出。以下示出一個例子。[0051