以干燥狀態(tài)包被有層粘連蛋白片段的細(xì)胞培養(yǎng)器具的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)器具，詳細(xì)而言涉及以干燥狀態(tài)包被有具有整合素 α6β1 結(jié)合活性的層粘連蛋白片段或其改造體的細(xì)胞培養(yǎng)器具?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002] 人ES細(xì)胞、人iPS細(xì)胞等人多能干細(xì)胞在再生醫(yī)療中的應(yīng)用受到全世界的注目。 為了將人多能干細(xì)胞應(yīng)用于再生醫(yī)療，需要開(kāi)發(fā)出將這些干細(xì)胞安全且穩(wěn)定地進(jìn)行培養(yǎng)、 擴(kuò)增的培養(yǎng)技術(shù)。特別是在不使用飼養(yǎng)細(xì)胞、且不含有來(lái)自異種動(dòng)物的成分的（無(wú)異源體 系）條件下的穩(wěn)定培養(yǎng)法的開(kāi)發(fā)成為了迫切的課題。
[0003] 本發(fā)明人著眼于初期胚胎的多能干細(xì)胞將以層粘連蛋白α 5 β 1 γ 1 (層粘連蛋白 511)為主要成分的基底膜作為基點(diǎn)，并在世界上領(lǐng)先地報(bào)道了人層粘連蛋白511的重組蛋 白質(zhì)作為人ES細(xì)胞的無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)基質(zhì)有用（參照非專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。另外，本發(fā)明人報(bào)道 了，層粘連蛋白511對(duì)α 6 β 1整合素具有非常高的親和性、以及層粘連蛋白511的E8片段 (層粘連蛋白511Ε8)具有與全長(zhǎng)的層粘連蛋白511同等的α 6 β 1整合素結(jié)合活性（參照 非專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。另外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，以往較困難的多能干細(xì)胞的基于單一分散的傳代培養(yǎng) 能夠在層粘連蛋白511Ε8上實(shí)現(xiàn)，并報(bào)道了人層粘連蛋白511Ε8作為人多能干細(xì)胞的無(wú)飼 養(yǎng)層培養(yǎng)基質(zhì)極其有效（參照專(zhuān)利文獻(xiàn)1、非專(zhuān)利文獻(xiàn)3)。
[0004] 以人層粘連蛋白511Ε8為基質(zhì)來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需要在培養(yǎng)器的表面預(yù)先包被人 層粘連蛋白511Ε8。在要培養(yǎng)人多能干細(xì)胞時(shí)，以如下的方式進(jìn)行包被：以達(dá)到0. 25~ 2. 0 μ g/cm2的方式在培養(yǎng)器中加入人層粘連蛋白511Ε8溶液，在4°C孵育過(guò)夜、或在室溫~ 37°C孵育1~3小時(shí)。但是，包被在培養(yǎng)器表面的層粘連蛋白或其活性片段容易由于干燥 而失活（參照非專(zhuān)利文獻(xiàn)4)，實(shí)際中，本發(fā)明人確認(rèn)到，包被于培養(yǎng)器表面的人層粘連蛋白 511E8在干燥后會(huì)逐漸失去活性。為了將人層粘連蛋白511E8作為人多能干細(xì)胞的培養(yǎng)基 質(zhì)而廣泛地在再生醫(yī)療等領(lǐng)域使用，正在尋求用于以干燥狀態(tài)長(zhǎng)期穩(wěn)定地維持包被在培養(yǎng) 器表面的人層粘連蛋白511E8的活性的技術(shù)開(kāi)發(fā)。
[0005] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0006] 專(zhuān)利文獻(xiàn)
[0007] 專(zhuān)利文獻(xiàn)1 :國(guó)際公開(kāi)公報(bào)第2011/043405號(hào)
[0008] 非專(zhuān)利文獻(xiàn)
[0009] 非專(zhuān)利文獻(xiàn) I :Miyazaki T, Futaki S, Hasegawa K, Kawasaki M, Sanzen N, Hayashi Mj Kawase Ej Sekiguchi KjNakatsuji NjSuemori H. Recombinant human laminin isoforms can support the undifferentiated growth of human embryonic stem cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 375:27-35, 2008.
[0010] 非專(zhuān)利文獻(xiàn) 2 :Taniguchi Y，Ido H，Sanzen N，Hayashi M，Sato-Nishiuchi R，F(xiàn)utaki S，Sekiguchi K. The C-terminal region of laminin beta chains modulates the integrin binding affinities of laminins. J Biol Chem. 284:7820-7831, 2009.
[0011] 非專(zhuān)利文獻(xiàn) 3 :Miyazaki T，F(xiàn)utaki S，Suemori H，Taniguchi Y，Yamada Mj Kawasaki Mj Hayashi M，Kumagai H，Nakatsuji N，Sekiguchi Kj Kawase E. Laminin E8fragments support efficient adhesion and expansion of dissociated human pluripotent stem cells. Nat Commun. 3, 1236. Doi:10. 1038/ncomms2231, 2012.
[0012] 非專(zhuān)利文獻(xiàn) 4 :Doi T，Thyboll J，Kortesmaa J，Jansson K，Iivanainen A,Parvardeh M，Timpl R，Hedin Uj Swedenborg j,Tryggvason K. Recombinant human laminin-10 ( a 5 β Iγ I) · J Biol Chem，277, 12741-12748, 2002.

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 發(fā)明所要解決的課題
[0014] 本發(fā)明的課題在于，發(fā)現(xiàn)用于以干燥狀態(tài)長(zhǎng)期穩(wěn)定地維持能夠用作人干細(xì)胞的無(wú) 飼養(yǎng)層培養(yǎng)基質(zhì)的層粘連蛋白片段的活性的技術(shù)，并提供以干燥狀態(tài)包被有維持了活性的 能夠用作人干細(xì)胞的無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)基質(zhì)的層粘連蛋白片段的細(xì)胞培養(yǎng)器具。
[0015] 用于解決課題的方法
[0016] 本發(fā)明為了解決上述課題，包含以下的發(fā)明。
[0017] [1] -種細(xì)胞培養(yǎng)器具，其為在要與細(xì)胞接觸的表面上以干燥狀態(tài)包被有具有整 合素 α 6β 1結(jié)合活性的層粘連蛋白片段或其改造體的細(xì)胞培養(yǎng)器具，該細(xì)胞培養(yǎng)器具的 特征在于，該層粘連蛋白片段為選自層粘連蛋白α5β1γ1和層粘連蛋白α5β2γ1中的 至少1種的片段，該細(xì)胞培養(yǎng)器具為以下的（1)、⑵或（3)，
[0018] (1)在要與細(xì)胞接觸的表面上，以干燥狀態(tài)僅包被有具有整合素a 6 β 1結(jié)合活性 的層粘連蛋白片段或其改造體的細(xì)胞培養(yǎng)器具；
[0019] (2)在要與細(xì)胞接觸的表面上，以干燥狀態(tài)包被有具有整合素a 6 β 1結(jié)合活性的 層粘連蛋白片段或其改造體、以及不具有整合素 a 6 β 1結(jié)合活性的層粘連蛋白片段的細(xì) 胞培養(yǎng)器具；
[0020] (3)在要與細(xì)胞接觸的表面上，以干燥狀態(tài)包被有具有整合素 a 6 β 1結(jié)合活性的 層粘連蛋白片段或其改造體、以及層粘連蛋白或其片段以外的蛋白質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)器具。
[0021] [2]根據(jù)上述[1]所述的細(xì)胞培養(yǎng)器具，其特征在于，所述⑴中，以0.7 μ g/cm2 以上的濃度包被有具有整合素 a 6β 1結(jié)合活性的層粘連蛋白片段或其改造體。
[0022] [3]根據(jù)上述[1]所述的細(xì)胞培養(yǎng)器具，其特征在于，所述（2)中，包被有1. 5 μ g/ cm2以下的濃度的具有整合素 a 6 β 1結(jié)合活性的層粘連蛋白片段或其改造體、以及其3倍 以上的濃度的不具有整合素 a 6 β 1結(jié)合活性的層粘連蛋白片段。
[0023] [4]根據(jù)上述[1]所述的細(xì)胞培養(yǎng)器具，其特征在于，所述（3)中，包被有1. 5 μ g/ cm2以下的濃度的具有整合素 a 6 β 1結(jié)合活性的層粘連蛋白片段或其改造體、以及其20倍 以上的濃度的層粘連蛋白或其片段以外的蛋白質(zhì)。
[0024] [5]根據(jù)上述[1]所述的細(xì)胞培養(yǎng)器具，其特征在于，層粘連蛋白片段為層粘連蛋 白Ε8片段。
[0025] [6]根據(jù)上述[1]所述的細(xì)胞培養(yǎng)器具，其特征在于，不具有整合素a 6 β 1結(jié)合活 性的層粘連蛋白片段為層粘連蛋白α 2β1γ1的片段。
[0026] [7]根據(jù)上述[1]所述的細(xì)胞培養(yǎng)器具，其特征在于，層粘連蛋白或其片段以外的 蛋白質(zhì)為選自由明膠、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、髓鞘堿性蛋白、乳球蛋 白、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和膠原蛋白組成的組中的1種以上。
[0027] [8]根據(jù)上述[1]~[7]中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)器具，其特征在于，通過(guò)在要與 細(xì)胞接觸的表面上包被期望的全部蛋白質(zhì)后使其干燥來(lái)制造。
[0028] [9] -種制造方法，其為在要與細(xì)胞接觸的表面上以干燥狀態(tài)包被有具有整合素 α 6 β 1結(jié)合活性的層粘連蛋白片段或其改造體的細(xì)胞培養(yǎng)器具的制造方法，其特征在于， 該層粘連蛋白片段為選自層粘連蛋白α5β Iyl和層粘連蛋白α5β2γ1中的至少1種的 片段，所述制造方法包括：(A)制備包含要被包被的蛋白質(zhì)的包被溶液的步驟，（B)在細(xì)胞 培養(yǎng)器具的要與細(xì)胞接觸的表面上包被期望的全部蛋白質(zhì)的步驟，和（C)將包被后的蛋白 質(zhì)干燥的步驟。
[0029] [10] -種培養(yǎng)方法，其為哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，使用上述[1]~
[8]中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)器具。
[0030] [11]根據(jù)上述[10]所述的培養(yǎng)方法，其中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞為ES細(xì)胞、iPS細(xì)胞或 成體干細(xì)胞、或者從這些細(xì)胞分化的細(xì)胞。
[0031] [12] -種活性降低抑制劑，其以選自由明膠、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、 轉(zhuǎn)鐵蛋白、髓鞘堿性蛋白、乳球蛋白、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、膠原蛋白和層粘連蛋白 α 2 β 1 γ 1的Ε8片段組成的組中的1種以上作為有效成分，抑制具有整合素 α 6 β 1結(jié)合活 性的層粘連蛋白片段或其改造體因干燥所致的整合素 α 6β 1結(jié)合活性的降低。
[0032] [13]根據(jù)上述[9]所述的制造方法，其特征在于，要被包被的蛋白質(zhì)僅為具有整 合素 α 6 β 1結(jié)合活性的層粘連蛋白片段或其改造體，以0. 7 μ g/cm2以上的濃度包被具有 整合素 α 6 β 1結(jié)合活性的層粘連蛋白片段或其改造體。
[0033] [14]根據(jù)上述[9]所述的制造方法，其特征在于，要被包被的蛋白質(zhì)為具有整合 素 α 6 β 1結(jié)合活性的層粘連蛋白片段或其改造體、以及不具有整合素 α 6 β 1結(jié)合活性的 層粘連蛋白片段，包被1. 5 μ g/cm2以下的濃度的具有整合素 α 6β 1結(jié)合活性的層粘連蛋 白片段或其改造體、以及其3倍以上的濃度的不具有整合素 α 6 β 1結(jié)合活性的層粘連蛋白 片段。
[0034] [15]根據(jù)上述[9]所述的制造方法，其特征在于，要被包被的蛋白質(zhì)為具有整合 素 α 6 β 1結(jié)合活性的層粘連蛋白片段或其改造體、以及層粘連蛋白或其片段以外的蛋白 質(zhì)，包被1. 5 μ g/cm2以下的濃度的具有整合素 α 6β 1結(jié)合活性的層粘連蛋白片段或其改 造體、以及其20倍以上的濃度的層粘連蛋白或其片段以外的蛋白質(zhì)。
[0035] [16]根據(jù)上述[9]所述的制造方法，其特征在于，層粘連蛋白片段為層粘連蛋白 Ε8片段。
[0036] [17]根據(jù)上述[9]所述的制造方法，其特征在于，不具有整合素 α 6 β 1結(jié)合活性 的層粘連蛋白片段為層粘連蛋白α2β1γ1的片段。
[0037] [18]根據(jù)上述[9]所述的制造方法，其特征在于，層粘連蛋白或其片段以外的蛋 白質(zhì)為選自由明膠、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、髓鞘堿性蛋白、乳球蛋白、 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和膠原蛋白組成的組中的1種以上。
[0038] [19]根據(jù)上述[12]所述的活性降低抑制劑，其特征在于，具有整合素 α 6 β 1結(jié)合 活性的層粘連蛋白片段為選自層粘連蛋白α5β 1 γ 1和層粘連蛋白α5 β 2 γ 1中的至少1 種的片段。
[0039] [20]根據(jù)上述[12]或[19]所述的活性降低抑制劑，其特征在于，層粘連蛋白片段 為層粘連蛋白E8片段。
[0040] 以下，將層粘連蛋白€(50 1丫1記作"層粘連蛋白511"，將層粘連蛋白€[502丫1 記作"層粘連蛋白521"，將層粘連蛋白α2β1γ1記作"層粘連蛋白211"。其他層粘連蛋 白也同樣地簡(jiǎn)稱(chēng)。將層粘連蛋白Ε8片段記作"層粘連蛋白Ε8"，將Ε8片段僅記為"Ε8"。
[0041] 發(fā)明效果
[0042] 根據(jù)本發(fā)明，可以提供一種細(xì)胞培養(yǎng)器具及其制造方法、以及使用該細(xì)胞培養(yǎng)器 具的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)方法，所述細(xì)胞培養(yǎng)器具以干燥狀態(tài)包被有能夠作為人多能干細(xì) 胞的無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)基質(zhì)利用的具有整合素 α6β1結(jié)合活性的層粘連蛋白片段。另外，可以 提供一種活性降低抑制劑，其抑制具有整合素 α 6β 1結(jié)合活性的層粘連蛋白片段因干燥 所致的整合素 α6β1結(jié)合活性的降低。本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)器具能夠在制造后長(zhǎng)期保存，即 使在長(zhǎng)期保存后也能夠在無(wú)飼養(yǎng)層環(huán)境下良好地培養(yǎng)干細(xì)胞。
【附圖說(shuō)明】
[0043] 圖1是表示確認(rèn)人iPS細(xì)胞的增殖的人層粘連蛋白511Ε8濃度依賴(lài)性的結(jié)果的 圖。
[0044] 圖2是表示將人層粘連蛋白511E8包被于培養(yǎng)板后使其干燥、研究α 6 β 1整合素 結(jié)合活性的結(jié)果的圖。
[0045] 圖3是將人層粘連蛋白511Ε8包被于培養(yǎng)板后使其干燥、研究對(duì)人iPS細(xì)胞的粘 附、增殖的影響的結(jié)果的圖，（A)為201B7細(xì)胞的結(jié)果、（B)為T(mén)ic細(xì)胞的結(jié)果。
[0046] 圖4為示出研究人層粘連蛋白511E8包被后因干燥所致的整合素結(jié)合活性降低的 濃度依賴(lài)性的結(jié)果的圖。
[0047] 圖5為示出評(píng)價(jià)各種活性降低抑制劑候補(bǔ)物質(zhì)的效果的結(jié)果的圖。
[0048] 圖6為示出研究各種蛋白質(zhì)的活性降低抑制效果的結(jié)果的圖。
[0049] 圖7為示出將3級(jí)人層粘連蛋白511E8濃度與7級(jí)明膠濃度組合來(lái)研究活性降低 抑制效果的濃度依賴(lài)性的結(jié)果的圖，（A)為在包被后未干燥的情況下測(cè)定α 6β 1整合素結(jié) 合活性的結(jié)果，（B)為在包被后進(jìn)行干燥后測(cè)定α6β1整合素結(jié)合活性的結(jié)果。
[0050] 圖8為示出研究活性降低抑制劑的添加時(shí)期的結(jié)果的圖。
[0051] 圖9為示出為了研究活性降低抑制劑的效果的持續(xù)性而將包被后進(jìn)行了干燥的 培養(yǎng)板保存8周、并將人iPS細(xì)胞培養(yǎng)7天后的結(jié)果的圖。
[0052] 圖10為示出研究BSA的濃度依賴(lài)性活性降低抑制效果的結(jié)果的圖。
[0053] 圖11為示出研究對(duì)人層粘連蛋白511E8和全長(zhǎng)人層粘連蛋白511的活性降低抑 制效果的結(jié)果的圖。
[0054] 圖12為示出研究對(duì)人層粘連蛋白521E8的活性降低抑制效果的結(jié)果的圖。
[0055] 圖13為示出研究人層粘連蛋白211E8對(duì)人層粘連蛋白511E8的活性降低抑制效 果的結(jié)果的圖。
[0056] 圖14為示出研究對(duì)將串珠蛋白聚糖的硫酸乙酰肝素鏈結(jié)合結(jié)構(gòu)域添加到β 1鏈 Ε8片段的N末端部而得到的人層粘連蛋白511E8(Plus#3層粘連蛋白Ε8)的活性降低抑制 效果的結(jié)果的圖。
[0057] 圖15為示出研究對(duì)將串珠蛋白聚糖的硫酸乙酰肝素鏈結(jié)合結(jié)構(gòu)域添加到α 5鏈 E8片段的C末端部而得到的人層粘連蛋白511E8 (Plus#5層粘連蛋白E8)的活性降低抑制 效果的結(jié)果的圖。
[0058] 圖16為示出在存在或不存在活性降低抑制劑的條件下包被將串珠蛋白聚糖的 硫酸乙酰肝素鏈結(jié)合結(jié)構(gòu)域添加到α 5鏈E8片段的C末端部而得到的人層粘連蛋白 511Ε8 (Plus#5層粘連蛋白Ε8)后并進(jìn)行干燥而得的培養(yǎng)板上培養(yǎng)人iPS細(xì)胞1周后的結(jié)果 的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0059] 〔細(xì)胞培養(yǎng)器具〕
[0060] 本發(fā)明提供在要與細(xì)胞接觸的表面上以干燥狀態(tài)包被有具有整合素 α 6 β 1結(jié)合 活性的層粘連蛋白片段或其改造體的細(xì)胞培養(yǎng)