專利名稱：：擬穴青蟹功能基因來源微衛(wèi)星標記的快速檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于擬穴青蟹DNA分子遺傳標記檢測領(lǐng)域，特別是涉及一種擬穴青蟹功能基因來源微衛(wèi)星標記的快速檢測方法。
背景技術(shù)：
：微衛(wèi)星DNA(MicrosatelliteDNA)幾乎存在于所有真核生物基因組中，由1_6個核苷酸組成的簡單序列重復(fù)(SimpleSequenceR印eats，SSR)，是近十幾年發(fā)展起來的一種新型分子標記技術(shù)。微衛(wèi)星具有數(shù)量多、隨機分布、多態(tài)性高、重復(fù)性強、呈共顯性遺傳及操作簡單等優(yōu)點，被廣泛地應(yīng)用于群體遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源保護與管理、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及QTL定位等領(lǐng)域中。國內(nèi)外學(xué)者已在大多數(shù)的重要水產(chǎn)養(yǎng)殖動物中開發(fā)了微衛(wèi)星標記。如GUO等開發(fā)了大黃魚的6個多態(tài)微衛(wèi)星標記；李紹戊等開發(fā)了團頭魴的19個微衛(wèi)星標記；馬洪雨等報道了圓斑星鰈的40個多態(tài)微衛(wèi)星標記和條斑星鰈的31個多態(tài)微衛(wèi)星標記；Wang等開發(fā)了太平洋牡蠣的17個EST來源的多態(tài)微衛(wèi)星標記；ELFSTR0M等開發(fā)了扇貝的16個微衛(wèi)星標記；Yap等篩選到梭子蟹的8個多態(tài)微衛(wèi)星標記；An等篩選了中華絨螯蟹的9個微衛(wèi)星標記。這些多態(tài)微衛(wèi)星標記已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用到群體遺傳結(jié)構(gòu)分析、親緣關(guān)系鑒定、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等研究中。功能基因來源的微衛(wèi)星標記屬于I型標記，很有可能與一些經(jīng)濟性狀相關(guān)聯(lián)，對于遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及分子輔助育種具有重要的意義。擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)屬節(jié)肢動物門(Arthropoda)、甲殼綱(Crustacea)、十足目(Dec即oda)、梭子蟹科(Port皿idae)、青蟹屬(Scylla)，主要分布于太平洋、印度洋的熱帶、亞熱帶和溫帶沿岸，在我國主要分布于東南沿海各省，以福建、廣東和海南最多，是我國重要的養(yǎng)殖蟹類之一。為了鑒定和保護在我國廣泛分布的青蟹資源，馬凌波等對我國東南沿海的青蟹的線粒體進行了研究，結(jié)果證實在我國廣泛分布的青蟹為擬穴青蟹，而不是先前認為的鋸緣青蟹。目前，可利用的擬穴青蟹微衛(wèi)星標記數(shù)量非常少，且無I型(與功能基因相關(guān)的標記)微衛(wèi)星標記的報道，嚴重限制了相關(guān)遺傳學(xué)研究的發(fā)展。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種擬穴青蟹功能基因來源微衛(wèi)星標記的快速檢測方法，該方法具有快速、準確、靈敏、安全、擴增條帶清晰等優(yōu)點，能夠直觀地檢測出擬穴青蟹不同個體的基因型，從而快速獲得擬穴青蟹在功能基因微衛(wèi)星位點遺傳變異的多態(tài)性圖譜，且提供的5個功能基因的微衛(wèi)星標記可應(yīng)用于擬穴青蟹遺傳變異分析、種質(zhì)資源保護與管理及遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等領(lǐng)域。本發(fā)明的一種擬穴青蟹功能基因來源微衛(wèi)星標記的快速檢測方法，包括(1)擬穴青蟹基因組DNA的提取剪取擬穴青蟹少量肌肉組織100-150mg，置于500y1組織提取液的中剪碎，加入終濃度為20mg/ml的蛋白酶K和終濃度為100yg/ml的RNaseA，55。C消化2-3個小時；用酚氯仿異戊醇按體積比25:24:i配成的混合液抽提兩次；然后用2倍體積的無水乙醇沉淀DNA，經(jīng)70%乙醇洗滌和自然干燥后，溶解于TE緩沖液中；最后將DNA濃度稀釋為100ng/iU，并保存在-2(TC備用;(2)從GeneBank數(shù)據(jù)庫中下載擬穴青蟹的功能基因序列，利用生物學(xué)軟件SSRHUNTER1.3查找微衛(wèi)星核心重復(fù)序列，查找標準為2_5個堿基重復(fù)單元、重復(fù)次數(shù)^4次，從而獲得含有微衛(wèi)星重復(fù)的基因序列；(3)利用生物學(xué)軟件PrimerPremier5.0在核心重復(fù)序列的兩側(cè)設(shè)計特異性引物，應(yīng)符合以下參數(shù)a.引物長度在18-25bp之間；b.GC含量在40-60%之間；c.退火溫度在48-60。C之間；d.PCR產(chǎn)物的預(yù)期長度在130-300bp之間；<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>(4)擬穴青蟹不同地理群體或群體不同個體的基因組DNA的PCR擴增PCR擴增反應(yīng)體系為25iU，包括基因組DNA模板liU、終濃度均為0.4iimol/L的上下游引物、終濃度為1.5mmol/LM"、終濃度為0.2mmol/LdNTP、0.75UTagDNA聚合酶、1XPCRbuffer,最后補充滅菌雙蒸水至總體積為25yl;反應(yīng)程序為94。C預(yù)變性5分鐘，94t:變性30秒、特異性的退火溫度退火50秒、72t:延伸50秒，30個循環(huán)；最后于72。C延伸7分鐘；(5)PCR產(chǎn)物的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，根據(jù)擴增產(chǎn)物的不同遷移距離確定每個個體的基因型，從而獲得擬穴青蟹遺傳變異的多態(tài)性圖譜。所述步驟(1)中的組織提取液具體組分為10mmol/LTris-CI，pH8.0;100mmol/LEDTA，pH8.0;100mmol/LNaCl;0.5%SDS。本發(fā)明設(shè)計的擬穴青蟹5個功能基因的多態(tài)性微衛(wèi)星標記應(yīng)用于擬穴青蟹遺傳變異分析、種質(zhì)資源保護與管理及遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建。有益效果本發(fā)明的檢測方法具有快速、準確、靈敏、安全、擴增條帶清晰等優(yōu)點，能夠直觀地檢測出擬穴青蟹不同個體的基因型，從而快速獲得擬穴青蟹在功能基因微衛(wèi)星位點遺傳變異的多態(tài)性圖譜，且提供的5個功能基因的微衛(wèi)星標記可應(yīng)用于擬穴青蟹遺傳變異分析、種質(zhì)資源保護與管理及遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等領(lǐng)域。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。1、擬穴青蟹基因組DNA的提取剪取擬穴青蟹少量肌肉組織(約100-150mg)，置于500y1組織提取液(10mmol/LTris-Cl，pH8.0;100mmol/LEDTA，pH8.0;100,1/LNaCl;0.5%SDS)的中剪碎，加入蛋白酶K(終濃度為20mg/ml)和RNaseA(終濃度為100yg/ml)，充分混勻，55。C消化2-3個小時至澄清；用酚氯仿異戊醇混合液(體積比為25:24:i)抽提兩次；然后用2倍體積的無水乙醇沉淀DNA，經(jīng)70%乙醇洗滌和自然干燥后，溶解于50iilTE緩沖液(10mmo1/LTris-HCl，pH8.0;10,1/LEDTA，pH8.0)中；最后將DNA濃度稀釋為100ng/iil，并保存在-2(TC備用；2、擬穴青蟹功能基因序列查找及微衛(wèi)星引物設(shè)計從GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索并下載擬穴青蟹功能基因序列，利用生物學(xué)軟件SSRHUNTER1.3對每個基因序列查找微衛(wèi)星核心重復(fù)，查找標準為2_5個堿基重復(fù)單元、重復(fù)次數(shù)^4次。利用生物學(xué)軟件PrimerPremier5.0在核心重復(fù)序列的兩側(cè)設(shè)計特異性引物，引物應(yīng)符合以下參數(shù):(1)引物長度在18-25bp之間;(2)GC含量在40-60%之間;(3)退火溫度在48-6(TC之間；(4)PCR產(chǎn)物的預(yù)期長度在130_300bp之間；引物信息詳見表1。3、PCR擴增利用上述微衛(wèi)星引物對擬穴青蟹群體進行PCR擴增，其反應(yīng)體系為25ii1，包括基因組DNA模板1ii1、終濃度均為0.4iimol/L上下游引物、終濃度為1.5mmol/LMg"、終濃度為0.2mmol/LdNTP、TagDNA聚合酶0.75U、1XPCRbuffer,最后補充滅菌雙蒸水至總體積為25iU。PCR反應(yīng)程序為94t:預(yù)變性5分鐘，94t:變性30秒、引物特異的退火溫度(表1)退火50秒、72t:延伸50秒，30個循環(huán)；最后于72t:延伸7分鐘，4。C保存?zhèn)溆谩?、PCR產(chǎn)物的電泳檢測向PCR產(chǎn)物中加入約1/2體積的變性劑(98.0%甲酰胺，10mmol/LEDTA，O.25%溴酚藍，O.25%二甲苯氰)，于951:變性5分鐘，快速冷卻；然后上樣約3iU于6%的變性聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳。分子量標準為pBR322/MspI，電泳液為1XTBE，恒壓35-40V/cm，電泳約1-1.5小時。電泳完成后進行染色和顯色，其操作過程為首先用70%乙醇固定10分鐘，之后用蒸餾水洗5分鐘；然后用1.5%。硝酸銀染色10分鐘，之后再用蒸餾水洗8秒鐘；最后用顯色液(2XNa0H:4。；甲醛二v/v)顯色至帶型清晰，再用蒸餾水將凝膠沖洗干凈，便獲得了擬穴青蟹在遺傳變異的多態(tài)性圖譜。最終，檢測到5個擴增條帶清晰、雜合度高的多態(tài)性微衛(wèi)星位點(表1)。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權(quán)利要求一種擬穴青蟹功能基因來源微衛(wèi)星標記的快速檢測方法，包括(1)擬穴青蟹基因組DNA的提??；(2)根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫中擬穴青蟹的功能基因序列，獲得含有微衛(wèi)星重復(fù)的基因序列；(3)微衛(wèi)星特異引物的設(shè)計，應(yīng)符合以下參數(shù)a.引物長度在18-25bp之間；b.GC含量在40-60％之間；c.退火溫度在48-60℃之間；d.PCR產(chǎn)物的預(yù)期長度在130-300bp之間；Scpa-AMP-SSRFCTTTACCAACGGCTTCTTCARCAGTAGCTTCCATGCAATTCTT退火溫度為55℃，核心重復(fù)序列為(ATT)9N6(ATT)4；Scpa-CB-SSRFCAGTGCAAGGCAAGTCAGGATACRAGTTCTGGAAGCATGCAATACTGAC退火溫度為57℃，核心重復(fù)序列為(TG)17；Scpa-ALF-SSRFTGGGCGTCCATTTCTCATTARTCGGAACTGAATTTAAAAATTAGAG退火溫度為53℃，核心重復(fù)序列為(AC)20；Scpa-SP-SSRFTTCAAGCAAGGACTCCAATTRGTTGCCTGAATCACAAATACC退火溫度為52℃，核心重復(fù)序列為(CT)54；Scpa-PDI-SSRFAAATAGGAGAACGAATAGCCCRGAAAACATTCATTCATAACCCT退火溫度為51℃，核心重復(fù)序列為(GAGT)4G(AGCA)4；(4)擬穴青蟹不同地理群體或群體不同個體的基因組DNA的PCR擴增；(5)PCR產(chǎn)物的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，從而獲得擬穴青蟹遺傳變異的多態(tài)性圖譜。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種擬穴青蟹功能基因來源微衛(wèi)星標記的快速檢測方法，其特征在于所述步驟(1)中的擬穴青蟹基因組DNA提取具體操作如下剪取擬穴青蟹少量肌肉組織100-150mg，置于500iil組織提取液的中剪碎，加入終濃度為20mg/ml的蛋白酶K和終濃度為100iig/ml的RNaseA，55。C消化2_3個小時；用酚、氯仿、異戊醇按體積比`25:24:1配成的混合液抽提兩次；然后用2倍體積的無水乙醇沉淀DNA，經(jīng)70X乙醇洗滌和自然干燥后，溶解于TE緩沖液中；最后將DNA濃度稀釋為100ng/y1，并保存在_20°C備用。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種擬穴青蟹功能基因來源微衛(wèi)星標記的快速檢測方法，其特征在于所述的組織提取液具體組分為1Ommol/LTris-Cl，pH8.0;100mmol/LEDTA，pH8.0;100,1/LNaCl;0.5%SDS。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種擬穴青蟹功能基因來源微衛(wèi)星標記的快速檢測方法，其特征在于所述步驟(4)中的PCR擴增反應(yīng)體系為25iU，包括基因組DNA模板liU、終濃度均為0.4iimol/L的上下游引物、終濃度為1.5mmol/LMg"、終濃度為0.2mmol/LdNTP、`0.75UTagDNA聚合酶、1XPCRbuffer,最后補充滅菌雙蒸水至總體積為25yl;反應(yīng)程序為94t:預(yù)變性5分鐘，94t:變性30秒、特異性的退火溫度退火50秒、72。C延伸50秒，30個循環(huán)；最后于72t:延伸7分鐘。全文摘要本發(fā)明涉及一種擬穴青蟹功能基因來源微衛(wèi)星標記的快速檢測方法，包括(1)擬穴青蟹基因組DNA的提?。?2)根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫中擬穴青蟹的功能基因序列，獲得含有微衛(wèi)星重復(fù)的基因序列；(3)微衛(wèi)星標記引物的設(shè)計；(4)擬穴青蟹不同地理群體或群體不同個體的基因組DNA的PCR擴增；(5)PCR產(chǎn)物的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。本發(fā)明的檢測方法具有快速、準確、靈敏等優(yōu)點，能夠直觀地檢測出擬穴青蟹不同個體的基因型，從而快速獲得擬穴青蟹在功能基因微衛(wèi)星位點遺傳變異的多態(tài)性圖譜，該微衛(wèi)星標記可應(yīng)用于擬穴青蟹遺傳變異分析、種質(zhì)資源保護與管理及遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等領(lǐng)域。文檔編號C12Q1/68GK101787395SQ20101013406公開日2010年7月28日申請日期2010年3月26日優(yōu)先權(quán)日2010年3月26日發(fā)明者馬凌波,馬春艷,馬洪雨申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所