一種巨魾魚微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于動(dòng)物微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]巨魅7arri?77i Sykes)屬于鲇形目，姚科，魅屬。中國(guó)分布在云南省的元江、瀾滄江、怒江；近年來，隨著環(huán)境的變迀、經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、魚類捕撈強(qiáng)度逐步加大，使得魚類的種類、數(shù)目都急劇減少，導(dǎo)致種群內(nèi)親緣關(guān)系接近的個(gè)體交配的幾率大大增加，遺傳多樣性明顯下降，因此利用微衛(wèi)星分子標(biāo)記技術(shù)來對(duì)巨魅魚的群體遺傳結(jié)構(gòu)、不同群體的遺傳變異進(jìn)行標(biāo)記，以對(duì)此魚類的種質(zhì)資源進(jìn)行保護(hù)，為以后的人工養(yǎng)殖及繁殖提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)就顯得日益迫切。但是目前巨魅魚類的微衛(wèi)星標(biāo)記尚未見報(bào)道。
[0003]微衛(wèi)星是指由l_6bp核苷酸為重復(fù)單元組成的短串連重復(fù)(Short tandemrepeats)或簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat, SSR)，又稱為微衛(wèi)星DNA。微衛(wèi)星分子標(biāo)記符合孟德爾遺傳規(guī)律，是分析物種遺傳多樣性的重要方法，微衛(wèi)星分子標(biāo)記具有多態(tài)性豐富、分布廣、重復(fù)性好、呈共顯性遺傳等特點(diǎn)，已成為第二代分子標(biāo)記的代表。而開發(fā)出物種特有的微衛(wèi)星標(biāo)記是進(jìn)行微衛(wèi)星標(biāo)記的前提條件。開發(fā)微衛(wèi)星引物的方法有經(jīng)典的構(gòu)建與篩選基因組文庫的方法、微衛(wèi)星富集法、省略篩庫法和數(shù)據(jù)庫搜索法等四種，這些方法都存在不同的缺陷，比如經(jīng)典的構(gòu)建與篩選基因組文庫的方法中存在程序復(fù)雜，如果測(cè)序片段大則測(cè)序困難，而小片段的又存在成功率低；微衛(wèi)星富集法仍然需要構(gòu)建文庫，操作繁瑣，成本較高；省略篩庫法開發(fā)出的引物特異性低；數(shù)據(jù)庫搜索法由于許多物種至今還沒有公開的DNA序列，限制了這種方法的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種花費(fèi)時(shí)間短、費(fèi)用較低、精度高、覆蓋范圍廣從而效率較高的巨魅魚微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)的方法。
[0005]本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。
[0006]巨魅魚微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)的方法，方法步驟如下:
(1)剪取巨魅活魚的肌肉或者肝臟等組織各5克混合，放于干冰寄測(cè)序公司或者-80°c冰箱保存；
(2)進(jìn)行總RNA提取，步驟如下:
1)取0.1g混合組織在液氮中充分研磨，移入ImL Trizol中，混勻后室溫下靜置5min，使核蛋白復(fù)合物完全解離；
2)加入0.2mL氯仿，劇烈搖動(dòng)或用旋禍震蕩器混勾，4°C下12000rpm離心15min ；
3)吸取上清液；
4)在吸取的上清液中，每ImLTrizol加入500 μ I的異丙醇，充分混勾后，于室溫放置1min ；
5)在40CT12000rpm離心lOmin，倒掉上清液; 6)收集RNA沉淀，用75%的乙醇洗滌兩次，重復(fù)上述步驟5)的離心過程；
7)用一次性吸頭吸盡殘存的乙醇，將打開管蓋的離心管置放于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，使殘余的乙醇揮發(fā)掉，不要讓RNA干透；
8)加入適量RNase-Free的超純水，將RNA沉淀充分溶解；
(3)用核算測(cè)定儀進(jìn)行RNA純度檢測(cè)，以260/280比值來鑒定其質(zhì)量；
(4)利用TakaraM-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA的合成，步驟如下:
1)取測(cè)定濃度的RNA溶液，取含有Iμ gRNA的溶液，加入I μ I的濃度為25 μ M的隨機(jī)引物，加RNase-Free的水補(bǔ)充體積到6 μ I ;
2)混合均勻后，將混合液置于70°C加熱1min;
3)取出樣品，放置在冰上2min，冷卻；
4)依次加入2 μ I 的 5XM-MLV buffer,0.5 μ I 的濃度為 1mM 的 dNTP、0.25 μ I 的濃度為40U/ μ I的RNase抑制劑、200U的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，加水補(bǔ)齊到10 μ 1，混勻；
5)將混勻的液體置于30°C加熱10min，42°C加熱lh，70°C加熱15min；
(5)送測(cè)序公司的測(cè)序儀進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序；
(6)序列整理，得到DNA序列表；
(7)利用軟件找出微衛(wèi)星序列，在核心序列兩側(cè)設(shè)計(jì)引物并合成；
(8)利用溫度梯度PCR進(jìn)行引物退火溫度的優(yōu)化:根據(jù)引物合成公司的引物合成時(shí)的溫度±5°C進(jìn)行退火溫度的篩選，擴(kuò)增出引物設(shè)計(jì)時(shí)的目的片段的大??；
(9)利用4條巨魅提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺膠電泳，利用凝膠成像分析儀進(jìn)行條帶分析，有多條帶的為多態(tài)性微衛(wèi)星引物；
本發(fā)明所述巨魅魚微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)的方法的應(yīng)用，可利用篩選出來的多態(tài)性微衛(wèi)星引物對(duì)待分析的魚的DNA順序進(jìn)行PCR擴(kuò)增、進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺膠電泳、凝膠成像分析儀進(jìn)行條帶分析、進(jìn)行條帶多態(tài)性評(píng)估，得到巨魅的遺傳結(jié)構(gòu)，對(duì)巨魅的遺傳多樣性進(jìn)行評(píng)估。
[0007]本發(fā)明利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法，對(duì)巨魅魚微衛(wèi)星標(biāo)記花費(fèi)的時(shí)間通常只需3-5天，不僅花費(fèi)時(shí)間短，且費(fèi)用較低，能量高，精度高，結(jié)果穩(wěn)定性好，覆蓋范圍廣，效率高。
【附圖說明】
[0008]圖1為微衛(wèi)星引物在巨魅魚中的擴(kuò)增電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0009]巨魅魚微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)的方法，方法步驟如下:
(1)剪取巨魅活魚的肌肉或者肝臟等組織各5克混合，放于干冰寄測(cè)序公司或者-80°c冰箱保存；
(2)進(jìn)行總RNA提取，具體步驟如下:
1)取0.1g步驟(I)的混合組織，在液氮中充分研磨，移入ImL Trizol中，混勻后室溫下靜置5min，使核蛋白復(fù)合物完全解離。樣品體積不超過所用Trizol體積的10% ；
2)加入0.2mL氯仿，劇烈搖動(dòng)或用旋禍震蕩器混勾，4°C下12000rpm離心15min ；
3)吸取上清液，重復(fù)吸取一次或多次； 4)在吸取的上清液中，每ImLTrizol加入500 μ I的異丙醇，充分混勾后，于室溫放置1min ；
5)于40CT 12000rpm離心lOmin，小心倒掉上清液；
6)收集RNA沉淀，用75%的乙醇洗滌兩次，重復(fù)一次上述步驟5)的離心過程；
7)用一次性使用的吸頭吸盡殘存的乙醇，將打開管蓋的離心管放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上幾分鐘，使殘余的乙醇揮發(fā)掉，不要讓RNA干透；
8)加入適量RNase-Free的超純水，將RNA沉淀充分溶解；
(3)用核算測(cè)定儀進(jìn)行RNA純度檢測(cè)，以260/280比值來鑒定其質(zhì)量；
(4)利用TakaraM-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA的合成，步驟如下:
I)取測(cè)定濃度的RNA溶液，取含有I μ gRNA的溶液，加入I μ I的濃度為25 μ M的隨機(jī)引物，加RNase-Free的水補(bǔ)充體積到6 μ ；
2)混合均勻后，將混合液置于70°C加熱1min;
3)取出樣品，放置在冰上2min，冷卻；
4)依次加入2 μ I 的 5 XM-MLV buffer, 0.5 μ I 的 dNTPlOmM 的 dNTP、0.25 μ I 的濃度為40U/ μ I的RNase抑制劑、，200U的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，加水補(bǔ)齊到10 μ 1，混勻；
5)將上述混勻的液體置于30°C加熱10min，42°C加熱lh，70°C加熱15min。；
(5)送測(cè)序公司的測(cè)序儀進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序；
(6)進(jìn)行DNA序列整理，序列表如下:
〈110〉紅河學(xué)院
〈120〉獲得的DNA序列表
<160>1
<210>1
<211>2089
<212>DNA
〈213〉yarrelli)
<220>misc_feature
<400>1
GCGGGTTTAGTTCTCAGGGTCCGTCGGTAGTTTTAAAGACGTTTAGTTAGGAAAAGTTTT 60TATTTTATTTTATTTTATTTTATTTTATTTTTCTGCAAGCATGGCTCAGGCTCGAGTCAC 120TGATTACTTTGCACAGTCTAAGAGAGCGGGTGTTGAGCGGACTTTGCGATCCAAATCGCA 180GAAATCGAGCGCTGAGGTCCGAGTGGTGTCCACGACCAGGCCTGAGAGGAGCAGCCGCTC 240CACAAACAAACCGCTCCGGGCGGTGCGGGAGGACAGCGAGCGGCTCCGGGCGGTGCAGGA 300GGAGTTCCTCAGGGTGATCGACGAGGCTGTATCCGCTCCTGATCATGCAGAAAGCGGGAC 360AGAGACACGGGGAGTGGAAAAACCCGCTCCGCCAGAGAGTCCCCGAACCCCGAAGAGGAC 420ATCGACTGAGGCGGAGTTTGATGTGTCCTCGGCTGTGGTTAGCTCCACCACGG