卵形鯧鲹家系親子鑒定的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及魚(yú)類育種和分子標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用微衛(wèi)星分子標(biāo)記鑒 定卵形鯧鰺混養(yǎng)家系子代親本的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 卵形娼錄隸屬隹盧形目（Perciformes)，錄科（Carangidae)，娼錄亞科 (Trachinotinae)，娼鰺屬（Trachinotus)，俗稱金娼，黃臘娼等，是一種中上層暖水性魚(yú)類， 廣泛分布于熱帶、亞熱帶海域，具有生長(zhǎng)速度快，肉嫩味美，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等特點(diǎn)，現(xiàn)已成為我 國(guó)南方沿海池塘和網(wǎng)箱養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟(jì)品種。
[0003] 近些年來(lái)，卵形鯧鰺市場(chǎng)需求量大幅上升，已經(jīng)成為南方海水養(yǎng)殖魚(yú)類的最大宗 種類，目前我國(guó)金娼商品魚(yú)年產(chǎn)量20萬(wàn)噸以上，僅廣東湛江魚(yú)類交易市場(chǎng)每天就有500噸 冰鮮卵形鯧鰺交易量。這樣大的市場(chǎng)對(duì)卵形鯧鰺苗種的需求量也是非常巨大的。卵形鯧鰺 是暖水性海水魚(yú)類，卵形鯧鰺受溫度條件影響?zhàn)B殖區(qū)域主要集中在海南、廣東、福建等地。 而海南地處亞熱帶、熱帶地區(qū)，海水溫度相對(duì)較高，適宜卵形鯧鰺的孵化與育苗。目前，三省 區(qū)所有卵形鯧鰺養(yǎng)殖苗種均來(lái)自于海南地區(qū)。由于卵形鯧鰺普遍存在近親繁殖的現(xiàn)象，導(dǎo) 致苗種種質(zhì)退化，生長(zhǎng)緩慢，病害爆發(fā)等問(wèn)題日益凸顯。傳統(tǒng)苗種繁殖產(chǎn)業(yè)所采用的野種 家養(yǎng)模式面臨著巨大的挑戰(zhàn)，對(duì)于卵形鯧鰺進(jìn)行良種選育便成為水產(chǎn)養(yǎng)殖研宄者迫在眉睫 的任務(wù)。
[0004] 家系選育是魚(yú)類育種的重要基礎(chǔ)手段，是根據(jù)某個(gè)或某幾個(gè)性狀明顯優(yōu)于其親 屬、生產(chǎn)性能顯著高于其親屬的混有不同類型的原始群里選出一些優(yōu)良個(gè)體留種，建立幾 個(gè)或若干個(gè)家系并繁殖后代，逐代與原始群體及對(duì)照品種相比較，選留那些符合原定選擇 指標(biāo)的優(yōu)良系統(tǒng)，進(jìn)而進(jìn)行品系性能測(cè)定。在魚(yú)類育種中，家系選育尤為重要，幾乎所有育 成種類均需要經(jīng)過(guò)家系選育這一步驟。目前魚(yú)類人工家系的建立通常采用1 (雌）對(duì)1 (雄） 交配生產(chǎn)子代。這樣的方式建立的家系數(shù)量較少，而且單獨(dú)管理每個(gè)家系受環(huán)境影響較大， 對(duì)家系選擇不利；而對(duì)混合家系進(jìn)行個(gè)體的物理標(biāo)記，在較多家系的情況下非常困難。目前 對(duì)于卵形鯧鰺繁殖成熟度及雌雄性別的判斷比較困難，也并不適用1對(duì)1的生產(chǎn)方式。因 此對(duì)于卵形鯧鰺家系的建立和家系的鑒定一直是難以解決的問(wèn)題，在很大程度上阻礙的 卵形鯧鰺育種工作。
[0005] 微衛(wèi)星DNA(Microsatellites DNA)是廣泛分布于真核生物基因組中的一種中度 重復(fù)序列。微衛(wèi)星標(biāo)記以其多態(tài)性豐富，共顯性遺傳的優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于群體遺傳結(jié)構(gòu)分 析，性狀分析，種質(zhì)鑒定，家系鑒定，遺傳作圖等領(lǐng)域。親本的微衛(wèi)星遺傳信息可以通過(guò)繁 殖傳遞給子代，微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)通過(guò)檢測(cè)不同親子個(gè)體的微衛(wèi)星差異區(qū)分個(gè)體所屬家系。 目前尚未見(jiàn)將微衛(wèi)星標(biāo)記用于卵形鯧鰺家系鑒定的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供了一種利用微衛(wèi)星標(biāo)記鑒定卵形鯧鰺家系的方法，為卵形鯧 鰺育種提供親子鑒定的分子標(biāo)記工具。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：提供一種卵形鯧鰺家系親子鑒定的方 法，該方法包括如下步驟：
[0008] 1)選擇卵形鯧鰺體型較大，生長(zhǎng)速度較快的個(gè)體87尾作為親本，將親本混合進(jìn)行 人工繁殖；待魚(yú)苗長(zhǎng)到10公分時(shí)隨機(jī)選取1萬(wàn)尾轉(zhuǎn)入網(wǎng)箱養(yǎng)殖，作為用于親子鑒定的家系 群體；
[0009] 2)選取步驟1)的卵形鯧鰺繁殖親本的鰭條組織，提取基因組DNA，以DNA為模板， 選用51對(duì)微衛(wèi)星引物進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增；
[0010] 3)步驟2)所述的巢式PCR擴(kuò)增方法指PCR體系內(nèi)包含3個(gè)引物：位點(diǎn)特異性正向 引物，其5'末端加M13序列（5' -CAGTCGGGCGTCATCA-3'）；位點(diǎn)特異性反向引物；FAM、PET、 VIC、NED四種熒光標(biāo)記的M13通用引物；PCR反應(yīng)體系20ul :50ng DNA，2ul dNTP(2. 5mM)， 2ullOXBuffer mixture，1U rTaq，0. 4ul 的含加通用引物M13 的正向引物（lOmM)，0? 5ul 反 向引物，0. lul的熒光標(biāo)記通用引物，ddH20補(bǔ)足；
[0011] 4)卵形鯧鰺親本在51個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物經(jīng)ABI3730型基因分析儀，根據(jù)熒 光標(biāo)記進(jìn)行基因型分析，使用Genemapper3. 7軟件模擬分析，篩選出適合鑒定卵形娼鰺混 養(yǎng)家系的有效微衛(wèi)星位點(diǎn) 11 個(gè)：ZD13、ZD15、TBG008、ZD02、ZD03、ZD04、ZD11、ZD12、ZD01、 ZD10、TBG016 ;
[0012] 5)將卵形鯧鰺1萬(wàn)條子代混養(yǎng)7月齡，隨機(jī)選取2000尾個(gè)體，在每條魚(yú)的背部肌 肉植入電子標(biāo)記并剪取每個(gè)個(gè)體鰭條組織，提取個(gè)體基因組DNA，選取步驟4)中的11個(gè)有 效微衛(wèi)星位點(diǎn)，分析子代的基因型；
[0013] 6)根據(jù)親本和子代在11個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的基因型，采用PAPA 2. 0軟件對(duì)不同子代 進(jìn)行區(qū)分，鑒定子代個(gè)體的父母本。
[0014] 其中步驟4)所述的11對(duì)有效微衛(wèi)星引物的核苷酸序列如下所示。
[0015] 表1卵形鯧鰺親子鑒定微衛(wèi)星引物
[0016]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種卵形鯧鰺家系親子鑒定的方法，該方法包括如下步驟： 1) 選擇卵形鯧鰺體型較大，生長(zhǎng)速度較快的個(gè)體87尾作為親本，將親本混合進(jìn)行人 工繁殖；待魚(yú)苗長(zhǎng)到10公分時(shí)隨機(jī)選取1萬(wàn)尾轉(zhuǎn)入網(wǎng)箱養(yǎng)殖，作為用于親子鑒定的家系群 體； 2) 選取步驟1)的卵形鯧鰺繁殖親本的鰭條組織，提取基因組DNA，以DNA為模板，選用 51對(duì)微衛(wèi)星引物進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增； 3) 步驟2)所述的巢式PCR擴(kuò)增方法指PCR體系內(nèi)包含3個(gè)引物：位點(diǎn)特異性正向引 物，其5'末端加M13序列（5' -CAGTCGGGCGTCATCA-3'）；位點(diǎn)特異性反向引物；FAM、PET、 VIC、NED四種熒光標(biāo)記的M13通用引物；PCR反應(yīng)體系20ul:50ngDNA，2uldNTP(2. 5mM)， 2ullOXBuffermixture，IUrTaq，0. 4ul的含加通用引物M13 的正向引物（IOmM)，0? 5ul反 向引物，0.Iul的熒光標(biāo)記通用引物，CldH2O補(bǔ)足； 4) 卵形鯧鰺親本在51個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物經(jīng)ABI3730型基因分析儀，根據(jù)熒光標(biāo) 記進(jìn)行基因型分析，使用Genemapper3. 7軟件模擬分析，篩選出適合鑒定卵形娼鰺混養(yǎng)家 系的有效微衛(wèi)星位點(diǎn) 11 個(gè)：ZD13、ZD15、TBG008、ZD02、ZD03、ZD04、ZD11、ZD12、ZD01、ZD10、 TBGO16 ； 5) 將卵形鯧鰺1萬(wàn)條子代混養(yǎng)7月齡，隨機(jī)選取2000尾個(gè)體，在每條魚(yú)的背部肌肉植 入電子標(biāo)記并剪取每個(gè)個(gè)體鰭條組織，提取個(gè)體基因組DNA，選取步驟4)中的11個(gè)有效微 衛(wèi)星位點(diǎn)，分析子代的基因型； 6) 根據(jù)親本和子代在11個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的基因型，采用PAPA2. 0軟件對(duì)不同子代進(jìn)行 區(qū)分，鑒定子代個(gè)體的父母本。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種卵形鯧鲹家系親子鑒定的方法，針對(duì)采用多親本制備混合家系的實(shí)例，篩選出11對(duì)遺傳多樣性高、擴(kuò)增效率穩(wěn)定的微衛(wèi)星引物。結(jié)合毛細(xì)管電泳測(cè)序及軟件分析，達(dá)到檢測(cè)卵形鯧鲹家系個(gè)體親子關(guān)系的目的。通過(guò)本發(fā)明的方法，卵形鯧鲹親子鑒定準(zhǔn)確率能夠達(dá)到90％以上。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開(kāi)號(hào)】CN104694660
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510128615
【發(fā)明人】駱劍, 陳國(guó)華, 張國(guó)慶, 吳光燦, 王珺
【申請(qǐng)人】海南大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年6月10日
【申請(qǐng)日】2015年3月24日