專利名稱：蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽突變體及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術領域，涉及蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽突變體及其衍生物、 類似物及其制備方法，確切地說就是構建一系列蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽鎮(zhèn)痛活性得到提高 以及分子內半胱氨酸進行改造的突變體蛋白的表達載體。具體地說，本發(fā)明涉及蝎鎮(zhèn)痛抗 腫瘤纈精甘肽鎮(zhèn)痛活性保守性半胱氨酸以及鎮(zhèn)痛活性得到提高的突變體蛋白的制備方法 及其作為鎮(zhèn)痛藥物在治療領域中的應用。
背景技術：
蝎作為傳統(tǒng)中藥已有2000多年的藥用歷史，又稱全蟲，全蝎，在“詩經”、“本草綱 目”等醫(yī)學著作中對其藥用性即進行了系統(tǒng)描述，是我國的傳統(tǒng)名貴中藥，具有祛風鎮(zhèn)驚， 通絡止痛等功能。用于偏、正頭痛，神經痛，軀身銳痛等，具有較大的開發(fā)價值。近年來人們 已經發(fā)現(xiàn)了多種具有抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗癲癇等藥理作用的蝎毒單組分多肽。天然蝎毒 產量極低，因此，采用基因工程方法，用簡單的原核或真核生物表達宿主生產具有藥用價值 的活性蝎毒多肽的方法顯得尤為重要。東亞鉗蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽(BmKAGAP)是劉巖峰等自東亞鉗蝎中首次分離純 化得到并用基因工程的方法獲得其編碼基因序列，實現(xiàn)了在大腸桿菌中的高效可溶性表 達。在體內小鼠醋酸扭體模型實驗中，該多肽體現(xiàn)出較對照藥嗎啡強的鎮(zhèn)痛效果(Liu YF， Ma RL,Wang SL，Duan ZY,Zhang JH，Wu LJ，Wu CF. Expression of an antitumor—analgesic peptide from the venom of Chinese scorpionButhus martensii Karsch in Escherichia coli.Protein Expression and Purification. 2003。疼痛是人類共有而又有較大個體差異性的一種不愉快的主觀感覺，它在軀體受到 威脅時提供警報信號，是生命不可缺少的一種保護機制。而在現(xiàn)有研究基礎上，使BmKAGAP 鎮(zhèn)痛活性得到提高以及對半胱氨酸進行改造的突變體蛋白的重組表達載體的構建及尋找 高效可溶性表達產物的獲得方法還有待于進一步研究。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是構建BmKAGAP突變體表達載體，突變體蛋白的表達與純化及 初步體內生物活性研究。本發(fā)明即致力于BmKAGAP鎮(zhèn)痛活性得到提高以及對半胱氨酸進行改造的突變體 蛋白的重組表達載體的構建及高效可溶性表達產物的獲得方法，本發(fā)明所述的BmKAGAP系 列突變體或相應的類似物的獲得方法常規(guī)、簡單、產量高，對研究開發(fā)蝎鎮(zhèn)痛肽類藥物具有 重要的指導意義和實用價值，為工業(yè)化生產奠定了基礎。經過初步體內活性實驗驗證后為 該系列蛋白廣泛應用于臨床疼痛相關疾病的治療提供基礎，將會大大提高患者的生存質 量，因此其應用前景將是非常廣闊的。本發(fā)明的另一個目的是提供生產如上限定的突變體蛋白質的方法，該方法包括(1)提供 BmKAGAP 的 D8K，D8R，C 端-(K 或 R)，C 端-(K 或 R) - (K 或 R)，C 端-(K 或R) - (K或R) - (K或R)，C末端減少一個或二個Gly，D8 (K或R)和C末端增加一個或二個或 三個堿性氨基酸，D8 (K或R)和C末端減少一個或二個Gly及其四對二硫鍵的突變體所編 碼DNA的重組表達載體；(2)用步驟(1)的重組載體轉化適當的宿主細胞；(3)在適合于表達 BmKAGAP 的 D8K，D8R，C 端-(K 或 R)，C 端-(K 或 R) - (K 或 R)，C 端-(K或R) - (K或R) - (K或R)，C末端減少一個或二個Gly，D8 (K或R)和C末端增加一個 或二個或三個堿性氨基酸，D8(K或R)和C末端減少一個或二個Gly及其四對二硫鍵的突 變體的條件下培養(yǎng)步驟(2)的被轉化的宿主細胞；(4)收獲并純化所得到的蛋白質。
本發(fā)明的再一個目的是提供含有如上限定的蛋白質及一種或多種醫(yī)藥上可接受 的載體或賦形劑的藥物組合物。本發(fā)明的再一個目的是提供如上限定的蛋白質在生產鎮(zhèn)痛藥物中的應用。本發(fā)明提供了一種上述載體轉化的宿主細胞。本發(fā)明提供的突變體蛋白均是從大腸桿菌宿主細胞中分離純化得到的?？墒褂?鹽析沉淀、超濾、離子交換層析、疏水作用層析和凝膠過濾等方法從細胞的溶胞產物及培養(yǎng) 液中分離并純化所需的蛋白質表達產物。在產物的分離和純化過程中，可使用十二烷基磺 酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)或蛋白免疫印跡法 (WESTERN)檢測產物的存在及相應分子大小。本發(fā)明還提供了上述突變體蛋白在生物制藥領域的應用，具體地說包括鎮(zhèn)痛生物 活性。本發(fā)明首次構建相應突變體蛋白質的原核細胞表達載體，轉化大腸桿菌宿主細胞 后實現(xiàn)蛋白的高效可溶性表達。本發(fā)明首次進行該系列突變體蛋白的小鼠體內鎮(zhèn)痛生物學活性實驗。本發(fā)明進一步涉及含有上述蛋白和至少一種醫(yī)藥上可接受的惰性載體或賦形劑 的藥物組合物。可按照制藥工業(yè)領域已知的基本原則和方法制備適于胃腸道外途徑給藥 的藥物組合物(如參見 Remington’ s Pharmaceutical Science, 15th. ，Mack Publishing Company，1980)?？赏ㄟ^各種給藥途徑，特別是靜脈內、肌肉內、關節(jié)內、腹腔內、鼻內、皮內、 皮下等胃腸道外途徑投用本發(fā)明的藥物組合物?？墒褂帽景l(fā)明的蛋白或含有該蛋白質的藥物組合物作為治療劑，用于治療特定類 型人體的各種疼痛相關疾病。本發(fā)明的藥物組合物的治療有效劑量一般應根據疾病的性 質、嚴重程度及對藥物的敏感適應性，以及給藥途徑等諸多因素由臨床醫(yī)生按照個體化原 則來確定。在本發(fā)明中，術語“宿主細胞”包括原核細胞和真核細胞，常用的原核宿主細胞的 例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物 細胞等。應用本發(fā)明所得到的蝎毒鎮(zhèn)痛活性肽表達量高，易于純化獲得目標蛋白，部分突 變體體內鎮(zhèn)痛活性得到較好的改善。


以蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽D8K突變體(簡寫為D8K)為例進行說明圖1 顯示用于表達D8K的原核細胞重組表達質粒pSYPU/BmKAGAP (D8K)的示意 圖。圖2 顯示菌落PCR方法鑒定含重組質粒的細菌菌落。1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，鑒定含重組質粒的細菌菌落。其中泳道 1為陽性對照，泳道2為陰性對照，泳道3為含有插入目的片段的重組質粒的細菌菌落，泳道 M為核酸分子量標志物DL2000。圖3 顯示D8K突變體的金屬離子螯合層析色譜圖。圖中箭頭所指位置為目標蛋 白所在洗脫峰。圖4 顯示D8K突變體的15% SDS-PAGE圖譜。其中泳道1為純化后D8K蛋白條 帶，泳道M為低分子量蛋白質標志物。
具體實施例方式下面的實施例可以使本專業(yè)技術人員更全面地理解本發(fā)明，而不是以任何方式限 制本發(fā)明特批權利要求的范圍。表1.用于構建BmKAGAP部分突變體引物a a斜體GGATCC代表3 ‘末端BamHI限制性酶切位點。表2.用于構建改造BmKAGAP 二硫鍵部分突變體引物a a斜體GGATCC代表3 ‘末端BamHI限制性酶切位點。實施例1 蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽D8K突變體及其衍生物、類似物的獲得1.質粒 pSYPU/BmKAGAP_D8K 的構建本實施例列舉描述用于表達本發(fā)明D8K蛋白的重組質粒pSYPU/BmKAGAP-D8K的構 建策略和基本方法。根據BmKAGAP氨基酸序列中Asp8設計相應寡核苷酸引物P1和引物P2，以構建好 的pSYPU/BmKAGAP質粒為模板，分別以P1和P7，P2和P6為引物進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠 電泳檢測產物并進行核酸片段的凝膠回收，再以所得回收產物為模板，以P6和P7為引物進 行第三輪PCR擴增，回收相應產物。經過限制性核酸內切酶Ncol和BamHI雙酶切后與同樣 進行雙酶切的質粒pSYPU在T4 DNA ligase的作用下進行連接，熱轉化大腸桿菌感受態(tài)細 胞DH5 a，經過菌落PCR和限制性核酸內切酶酶切驗證篩選獲得陽性轉化子后提交生物技 術服務公司進行DNA序列測定。結果表明，通過基因工程的方法成功構建重組質粒pSYPU/ BmKAGAP-D8K。2.突變體蛋白的分離純化經測序確認后按常規(guī)方法發(fā)酵表達并分離大腸桿菌宿主細胞的表達產物。首先將 陽性重組質粒熱轉化大腸桿菌BL21 ( X DE3)，然后從該LB固體平板上挑取單菌落后接種至 3ml LB (含卡那抗生素，50 u g/ml)，于37°C，200r/min振蕩過夜培養(yǎng)。按照1 %接種量將過 夜培養(yǎng)物接種至400ml含相應抗生素的新鮮LB培養(yǎng)基的三角瓶中，于37°C，200r/min振蕩 培養(yǎng)至0D600為0. 6-0. 8，加入終濃度為0. 166mmol/L的誘導物異丙基0 D-硫代半乳糖苷 (IPTG)，培養(yǎng)4h。結束發(fā)酵，3000g、4°C離心20min,收集菌體。用40ml裂解緩沖液(0. 1M PBS，0. 15M NaCl，50mM咪唑)重懸菌體，進行超聲破碎，超聲結束后于12，000g、4°C離心 20min，得上清液，所得沉淀按照上述步驟重復破碎一次，合并兩次上清液，直接上樣于0. 1M PBS(pH 8.0)預先平衡好的金屬離子螯合層析柱，經過兩個不同階段的pH緩沖液分別充分 洗滌5個柱床體積后，使用0. 5M咪唑(pH 9. 0)進行洗脫并收獲該洗脫液。所得產物經過15% SDS-PAGE驗證其純度。由柱層析色譜圖和SDS-PAGE圖譜說明，重組蛋白質獲得高效 表達，達到電泳純度。蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽D8K突變體及其及其衍生物、類似物的模式包括 BmKAGAP-D8K, M-BmKAGAP_D8K，MHHHHHHM-BmKAGAP-D8K, MHHHHHH-BmKAGAP_D8K。實施例2 蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽D8R突變體及其衍生物、類似物的獲得本實施例獲得蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽D8R突變體及其衍生物、類似物的策略和基 本方法，類同實施例1的策略和基本方法。蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽D8R突變體及其衍生物、類似物的模式包括 BmKAGAP-D8R, M-BmKAGAP_D8R，MHHHHHHM-BmKAGAP-D8R, MHHHHHH-BmKAGAP_D8R。實施例3 蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽C端-K-K突變體BmKAGAP-K-K及其衍生物、 類似物的獲得本實施例列舉描述用于表達本發(fā)明rBmKAGAP-K-K蛋白的重組質粒pSYPU/ BmKAGAP-K-K的構建策略和基本方法。其中根據AGAP成熟肽C末端的氨基酸序列設計相應 寡核苷酸引物P3，以構建好的pSYPU/BmKAGAP質粒為模板進行PCR擴增，相應的引物為P3 和P6?；具^程同實施例1。蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽C端-K-K突變體BmKAGAP-K-K及其衍生物、類似物的模 式包括BmKAGAP-K-K，M-BrnKAGAP-K-K。實施例4 蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽C端_(K或R)突變體及其衍生物、類似物的獲 得本實施例獲得蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽C端-(K或R)突變體及其衍生物、類似物的 策略和基本方法，類同實施例3的策略和基本方法。此模式包括BmKAGAP-K，M-BmKAGAP-K， BmKAGAP-R, M-BmKAGAP-R。實施例5 蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽C端_(K或R)_(K或R)突變體及其衍生物、類 似物的獲得本實施例獲得蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽C端-(K或R) - (K或R)突變體及其衍生物、 類似物的策略和基本方法，類同實施例3的策略和基本方法。此模式的突變體及其衍生 物、類似物包括BmKAGAP-K-K，BmKAGAP-K-R, BmKAGAP-R-K, BmKAGAP-R-R, M-BmKAGAP-K-K， M-BmKAGAP-K-R, M-BmKAGAP-R-K 和 M-BmKAGAP-R-R。實施例6 蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽C端-(K或R) - (K或R) - (K或R)突變體及其衍 生物、類似物的獲得本實施例獲得蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽C端-(K或R) - (K或R) - (K或R)突變體及 其衍生物、類似物的策略和基本方法，類同實施例3的策略和基本方法。此模式的突變體及 其衍生物、類似物包括BmKAGAP-K-K-K，BmKAGAP-K-K-R，BmKAGAP-K-R-K, BmKAGAP-K-R-R, BmKAGAP-R-K-K, BmKAGAP-R-K-R, BmKAGAP-R-R-R, BmKAGAP-R-R-K, M-BmKAGAP-K-K-K， M-BmKAGAP-K-K-R, M-BmKAGAP-K-R-K, M-BmKAGAP-K-R-R, M-BmKAGAP-R-K-K, M-BmKAGAP-R-K-R, M-BmKAGAP-R-R-R 和 M-BmKAGAP-R-R-K。實施例7 蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽C端(-G)突變體BmKAGAP- (_G)及其衍生物、 類似物的獲得本實施例列舉描述用于表達本發(fā)明rBmKAGAP (_G)蛋白的重組質粒pSYPU/BmKAGAP (-G)的構建策略和基本方法。其中根據AGAP成熟肽C末端的氨基酸序列設計寡核 苷酸引物P4，以構建好的pSYPU/BmKAGAP質粒為模板，相應的引物為P4和P6。基本過程同 實施例1。此模式的突變體及其衍生物、類似物包括=BmKAGAP- (-G)和M-BmKAGAP- (-G)。實施例8 蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽C端(-2G)突變體BmKAGAP- (-2G)及其衍生 物、類似物的獲得本實施例列舉描述 用于表達本發(fā)明rBmKAGAP (-2G)蛋白的重組質粒pSYPU/ BmKAGAP (-2G)的構建策略和基本方法。其中根據AGAP成熟肽C末端的氨基酸序列設計寡 核苷酸引物P5，相應的引物為P5和P6。基本過程同實施例1。此模式的突變體及其衍生物、類似物包括=BmKAGAP- (-2G)和M-BmKAGAP- (-2G)。實施例9 蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽-D8 (K或R)-C末端加一個堿性氨基酸殘基(K或 R)突變體及其衍生物、類似物的獲得本實施例獲得蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽-D8 (K或R) -C末端加一個堿性氨基酸殘基 (K或R)突變體及其衍生物、類似物是結合實施例1、2以及實施例4的策略和基本方法。也 就是在蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽-D8 (K或R)突變體的基礎上，在其C末端加一個堿性氨基酸 殘基(K或R)。此模式的突變體及其衍生物、類似物包括BmKAGAP(D8R)-K，M-BmKAGAP(D8R)-K， BmKAGAP(D8R)-R， M-BmKAGAP(D8R)-R, BmKAGAP(D8K)-R, M-BmKAGAP(D8K)-R, BmKAGAP(D8K)-K, M-BmKAGAP(D8K)-K。實施例10 蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽-D8 (K或R) -C末端加二個堿性氨基酸殘基(K 或R) - (K或R)突變體及其衍生物、類似物的獲得本實施例獲得蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽-D8 (K或R) -C末端加二個堿性氨基酸殘基 (K或R)-(K或R)突變體及其衍生物、類似物是結合實施例9和4的策略和基本方法。也就 是在蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽-D8 (K或R) -C末端加一個堿性氨基酸殘基(K或R)突變體的 基礎上，在其C末端再加一個堿性氨基酸殘基(K或R)。此模式的突變體及其衍生物、類似物包括=BmKAGAP (D8R) -K- (K或R)， M-BmKAGAP (D8R)-K-(K 或 R)，BmKAGAP (D8R)-R-(K 或 R)，M-BmKAGAP(D8R)-R-(K 或 R)， BmKAGAP(D8K)-R-(K 或 R)，M-BmKAGAP(D8K)-R-(K 或 R)，BmKAGAP(D8K)-K-(K 或 R)， M-BmKAGAP(D8K)-K-(K 或 R)。實施例11 蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽-D8 (K或R)-C末端加三個堿性氨基酸殘基(K 或R) - (K或R) - (K或R)突變體及其衍生物、類似物的獲得本實施例獲得蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽-D8 (K或R) -C末端加三個堿性氨基酸殘基 (K或R)-(K或R)突變體及其衍生物、類似物是結合實施例10和4的策略和基本方法。也 就是在蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽-D8 (K或R) -C末端加二個堿性氨基酸殘基(K或R) - (K或R) 突變體的基礎上，在其C末端再加一個堿性氨基酸殘基(K或R)。此模式的突變體及其衍生物、類似物包括=BmKAGAP (D8R) -K- (K或R) - (K 或 R)，M-BmKAGAP (D8R)-K-(K 或 R) - (K 或 R)，BmKAGAP (D8R)-R-(K 或 R) - (K 或 R) , M-BmKAGAP (D8R)-R-(K 或 R) - (K 或 R)，BmKAGAP (D8K) -R- (K 或 R) - (K 或 R)， M-BmKAGAP(D8K)-R-(K 或 R)- (K 或 R)，BmKAGAP(D8K)-K-(K 或 R)- (K 或 R)，M-BmKAGAP (D8K) -K_ (K 或 R) - (K 或 R)。實施例12 蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽-D8 (K或R) _C端(_G)突變體及其衍生物、類 似物的獲得本實施例獲得蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽_D8(K或R)_C端(-G)突變體及其衍生物、 類似物是結合實施例1、2和7的策略和基本方法。也就是在蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽-D8 (K 或R)突變體及其衍生物、類似物的基礎上，在其C末端去掉一個G殘基。此模式的突變體及其衍生物、類似物包括BmKAGAP(D8R)-(-G)， M-BmKAGAP(D8R)-(-G)，BmKAGAP(D8K)-(-G)，M-BmKAGAP(D8K)-(_G)。實施例13 蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽-D8 (K或R) _C端(-2G)突變體及其衍生物、類 似物的獲得本實施例獲得蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽-D8 (K或R) _C端(-2G)突變體及其衍生物、 類似物是結合實施例1、2和8的策略和基本方法。也就是在蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽-D8 (K 或R)-C端(-G)突變體及其衍生物、類似物的基礎上，在其C末端再去掉一個G殘基。此模式的突變體及其衍生物、類似物包括BmKAGAP(D8R)-(-2G)， M-BmKAGAP(D8R)-(-2G)，BmKAGAP(D8K)-(-2G)，M-BmKAGAP(D8K)-(-2G)。實施例14 蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽C末端的兩個G被去除后加一個堿性氨基酸殘 基突變體及其衍生物、類似物的獲得本實施例獲得蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽C末端的兩個G被去除后加一個堿性氨基酸 殘基突變體及其衍生物、類似物是結合實施例8和9的策略和基本方法。此模式的突變體及其衍生物、類似物包括BmKAGAP-(-2G)_R， M-BmKAGAP-(-2G) -R, BmKAGAP-(-2G) -K, M-BmKAGAP-(-2G)_K。實施例15 蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽C末端的兩個G被去除后加二個堿性氨基酸殘 基突變體及其衍生物、類似物的獲得本實施例獲得蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽C末端的兩個G被去除后加二個堿性氨基酸 殘基突變體及其衍生物、類似物是結合實施例8、9和14的策略和基本方法。 此模式的突變體及其衍生物、類似物包括BmKAGAP- (_2G) -R- (R或K)， M-BmKAGAP- (-2G) -R- (R 或 K)，BmKAGAP- (-2G) -K_ (R 或 K)，M-BmKAGAP- (-2G) -K_ (R 或 K)。實施例16 蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽C末端的兩個G被去除后加三個堿性氨基酸殘 基突變體及其衍生物、類似物的獲得本實施例獲得蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽C末端的兩個G被去除后加二個堿性氨基酸 殘基突變體及其衍生物、類似物是結合實施例8、9、14和15的策略和基本方法。此模式的突變體及其衍生物、類似物包括BmKAGAP- (_2G) -R- (R或K) - (R 或 K)，M-BmKAGAP-(_2G)-R-(R 或 K)-(R 或 K)，BmKAGAP-(_2G)_K_(R 或 K)-(R 或 K)， M-BmKAGAP-(-2G)-K_(R 或 K)-(R 或 K)。實施例17 蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽D8 (K或R)和C末端增加一個或二個或三個堿 性氨基酸殘基突變體及其衍生物、類似物的獲得本實施例獲得蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽C末端的兩個G被去除后加二個堿性氨基酸 殘基突變體及其衍生物、類似物是結合實施例13、14、15和16的策略和基本方法。此模式的突變體及其衍生物、類似物包括BmKAGAP-D8 (K或R)-(_2G)-(R或K)，
12M-BmKAGAP-D8 (K 或 R) - (_2G) - (R 或 K)，BmKAGAP_D8 (K 或 R) - (_2G) - (R 或 K) - (R 或 K)， M-BmKAGAP-D8 (K 或 R) - (-2G) - (R 或 K) - (R 或 K)，BmKAGAP_D8 (K 或 R) - (-2G) - (R 或 K) - (R 或 K) - (R 或 K)，M-BmKAGAP-D8 (K 或 R) - (_2G) - (R 或 K) - (R 或 K) - (R 或 K)。實施例18 蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽_ (C12S)突變體BmKAGAP- (C12S)的獲得本實施例列舉描述用于表達本發(fā)明BmKAGAP_(C12S)突變體蛋白的重組質粒 pSYPU/BmKAGAP-(C12S)的構建策略和基本方法。根據BmKAGAP氨基酸序列中Cys12設計相應寡核苷酸引物P8和引物P9，以構建好 的pSYPU/BmKAGAP質粒為模板，分別以P7和P8，P6和P9為引物進行PCR擴增。基本過程 同實施例1。實施例 19 :BmKAGAP- (C16S) .BmKAGAP- (C22S) .BmKAGAP- (C26S) .BmKAGAP- (C36S)、 BmKAGAP- (C46S)和 BmKAGAP-(C48S)突變體的獲得本實施例列舉描述用于表達本發(fā)明BmKAGAP- (C16S)、BmKAGAP- (C22S)、 BmKAGAP- (C26S)、BmKAGAP-(C36S)、BmKAGAP-(C46S)和 BmKAGAP-(C48S)突變體蛋白的重組 質粒的構建策略和基本方法。根據BmKAGAP 氨基酸序列中 Cys16，Cys22, Cys26, Cys36, Cys46, Cys48 設計相應寡核苷 酸引物 P10, Pll, P12, P13, P14, P15, P16, P17, P18, P19, P20, P21。基本過程同實施例 18。實施例20 :BmKAGAP-(C63S)突變體的獲得本實施例列舉描述用于表達本發(fā)明BmKAGAP- (C63S)突變體蛋白的重組質粒 pSYPU/BmKAGAP (C63S)的構建策略和基本方法。根據BmKAGAP氨基酸序列中Cys63設計相應寡核苷酸引物P22，以構建好的pSYPU/ BmKAGAP質粒為模板，以P6和P22為引物進行PCR擴增?；具^程同實施例18。實施例21 :BmKAGAP-(C12S，C63S)、BmKAGAP-(C16S，C36S)、BmKAGAP-(C22S， C46S)、BmKAGAP-(C26S，C48S)突變體的獲得本實施例列舉描述用于表達本發(fā)明BmKAGAP-(C12S, C63S)、BmKAGAP-(C16S, C36S)、BmKAGAP-(C22S，C46S)、BmKAGAP-(C26S，C48S)突變體蛋白的重組質粒的構建策略和
基本方法。分別以構建好的pSYPU/BmKAGAP-(C12S)、pSYPU/BmKAGAP-(C16S)、pSYPU/ BmKAGAP-(C22S)、pSYPU/BmKAGAP-(C26S)質粒為模板，以相應的另一部分欲引入突變點系 列弓I物進行PCR擴增?；具^程同實施例1。實施例22 突變體蛋白體內鎮(zhèn)痛活性一小鼠醋酸扭體法本實施例通過小鼠體內鎮(zhèn)痛模型旨在驗證特定位點氨基酸改造后蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤 纈精甘肽突變體的鎮(zhèn)痛活性。蛋白濃度采用Lowry方法進行測定。小鼠醋酸扭體法鎮(zhèn)痛模型將冰醋酸作為化學刺激物注入昆明種小鼠腹腔內，繼 而引起深部的、大面積而較持久的疼痛刺激，致使小鼠產生“扭體”反應(腹部內凹、軀干與 后腿伸張、臀部高起)。18-22g昆明種小鼠，雌雄各半，隨機分組，每組8只，腹腔注射突變體蛋白樣品， 20min后按0. 2ml/20g腹腔注射0.6% (v/v)醋酸引起內臟痛，5min后記錄小鼠lOmin內的 扭體次數。以嗎啡為陽性對照，生理鹽水為空白對照，按照下述公式計算各個給藥組的扭體 反應抑制率。
觸I奩空白組扭體次數-給藥組扭體次數inno/ 抑制率--^ ,-x 100%
空白組扭體次數鎮(zhèn)痛生物活性實驗結果表明生理鹽水空白組實驗動物扭體次數(Mean士SEM) 為43. 70士2.99 ；陽性對照組(嗎啡，3. 51iimol/kg)實驗動物扭體次數(Mean士SEM)為 29. 37士 1.85，扭體抑制率為32. 79% ；蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽組(0. 14umol/kg)的實驗 動物扭體抑制率為54. 81 % ；蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽D8K、D8R、C端-(K或R)、C端-(K或 R) - (K或R)、C端-(K或R) - (K或R) - (K或R)、C末端減少一個或二個G的突變體及其衍生 物、類似物(0. 14umol/kg)實驗動物扭體抑制率在67. 0% -81. 7% ；蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘 肽D8 (K或R)和C末端增加一個或二個或三個堿性氨基酸、D8 (K或R)和C末端減少一個 或二個G、C末端去除二個G加一個或二個或三個堿性氨基酸、D8 (K或R)和C末端去除二 個G加一個或二個或三個堿性氨基酸的突變體及其衍生物、類似物(0. 14umol/kg)實驗動 物扭體抑制率92. 3% -100%;蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽第12位、第16位、第22位、第26位、 第36位、第46位、第48位和第63位Cys的突變體實驗動物扭體抑制率見表3。表3.蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽半胱氨酸突變后小鼠醋酸扭體鎮(zhèn)痛實驗結果
權利要求
蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽突變體及其衍生物、類似物，其特征在于蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽第8位D和蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽C末端至少一個被改變。
2.根據權利要求1所述的蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽突變體及其衍生物、類似物，其特征 在于所述的蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽第8位D改變指第8位D被K或R取代，獲得蝎鎮(zhèn)痛抗 腫瘤纈精甘肽D8K突變體及其衍生物、類似物或蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘D8R突變體及其衍生 物、類似物VRDGYIAKDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGG VRDGYIARDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGG MVRDGYIA(K 或 R)DKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGG MHHHHHHMVRDGYIA (K 或 R) DKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRV PGKCNGGMHHHHHHVRDGYIA (K 或 R) DKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVP GKCNGG。
3.根據權利要求1所述的蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽突變體及其衍生物、類似物，其特征 在于所述的蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽C末端改變包括蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽C末端增加堿 性氨基酸殘基或減少G或減少兩個G后加堿性氨基酸殘基。
4.根據權利要求3所述的蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽突變體及其衍生物、類似物，其特征 在于所述增加的堿性氨基酸殘基為一個或二個或三個，所述減少的G為一個或二個，所述 減少兩個G后加的堿性氨基酸殘為一個或二個或三個。
5.根據權利要求3所述的蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽突變體及其衍生物、類似物，其特征 在于所述蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽C末端增加堿性氨基酸殘基，獲得蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘 肽C端-(K或R)突變體及其衍生物、類似物或蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽C端-(K或R) - (K或 R)突變體及其衍生物、類似物或蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽C端-(K或R) - (K或R) - (K或R)突 變體及其衍生物、類似物VRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGG(K 或 R) VRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGG(K 或 R) (K 或 R)VRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGG(K 或 R) (K 或 R) (K 或 R)MVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNA CffCYKLPDKVPIRVPGKCNGG(K 或 R) MHHHHHHMVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQW AGVYGNACffCYKLPDKVPIRVPGKCNGG(K 或 R)MHHHHHHVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGG (K 或 R)MVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGG(K 或 R) (K 或 R)MHHHHHHMVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNG G(K 或 R) (K 或 R)MHHHHHHVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGG (K 或 R) (K 或 R)MVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGG(K 或 R) (K 或 R) (K 或 R)MHHHHHHMVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNG G(K 或 R) (K 或 R) (K 或 R)MHHHHHHVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGG (K 或 R) (K 或 R) (K 或 R)。
6.根據權利要求3所述的蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽突變體及其衍生物、類似物，其特征 在于所述蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽C末端減少G，獲得蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽C端-(-G) 突變體及其衍生物、類似物或蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽C端-(-2G)突變體及其衍生物、類似 物VRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNMVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGMVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNMHHHHHHMVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGMHHHHHHMVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNMHHHHHHVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGMHHHHHHVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNo
7.根據權利要求1所述的蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽突變體及其衍生物、類似物，其特征 在于蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽C末端的兩個G被去除后加一個或二個或三個堿性氨基酸殘 基突變體及其衍生物、類似物VRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCN(K 或 R) MVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCN(K 或 R) VRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCN(K 或 R) (K或R)MVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCN(K 或 R) (K 或 R)VRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCN(K 或 R) (K 或R) (K或R)MVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCN(K 或 R) (K 或 R) (K 或 R)。
8.根據權利要求1所述的蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽突變體及其衍生物、類似物，其特征 在于蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽D8 (K或R)和C末端增加一個或二個或三個堿性氨基酸殘基 突變體及其衍生物、類似物VRDGYIA (K 或 R)DKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGG( K或R)MVRDGYIA (K 或 R) DKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPI RVPGKCNGG(K 或 R)VRDGYIA (K 或 R) DKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQffAGVYGNACffCYKLPDKVPIRVPGKCNGG ( K 或 R) (K 或 R)MVRDGYIA (K 或 R) DKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQffAGVYGNACffCYKLPDKVP I RVPGKCNGG (K 或 R) (K 或 R)VRDGYIA (K 或 R) DKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQffAGVYGNACffCYKLPDKVP I RVPGKCNGG ( K 或 R) (K 或 R) (K 或 R)MVRDGYIA (K 或 R) DKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQffAGVYGNACffCYKLPDKVP I RVPGKCNGG (K 或 R) (K 或 R) (K 或 R)。
9.根據權利要求1所述的蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽突變體及其衍生物、類似物，其特征 在于蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽D8 (K或R)和C末端減少一個或二個G突變體及其衍生物、類 似物VRDGYIA (K 或 R)DKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQffAGVYGNACffCYKLPDKVPIRVPGKCNG MVRDGYIA(K 或 R)DKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQffAGVYGNACffCYKLPDKVPIRVPGKCNGVRDGYIA(K 或 R)DKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQffAGVYGNACffCYKLPDKVPIRVPGKCNMVRDGYIA(K 或 R)DKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQffAGVYGNACffCYKLPDKVPIRVPGKCN
10.根據權利要求1所述的蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽突變體及其衍生物、類似物，其特征 在于蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽D8 (K或R)和C末端的兩個G被去除后加一個或二個或三個 堿性氨基酸殘基突變體及其衍生物、類似物VRDGYIA(K 或 R)DKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQffAGVYGNACffCYKLPDKVPIRVPGKCN(K或R)MVRDGYIA (K 或 R)DKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQffAGVYGNACffCYKLPDKVPIRVPGKCN(K 或R)VRDGYIA(K 或 R)DKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCN(K 或R) (K或R)MVRDGYIA (K 或 R)DKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQffAGVYGNACffCYKLPDKVPIRVPGKCN(K 或R) (K或R)VRDGYIA(K 或 R)DKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQffAGVYGNACffCYKLPDKVPIRVPGKCN(K 或 R) (K 或 R) (K 或 R)MVRDGYIA (K 或 R)DKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQffAGVYGNACffCYKLPDKVPIRVPGKCN(K 或 R) (K 或 R) (K 或 R)。
11.根據權利要求1所述的蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽及其衍生物、類似物中其特征在于 所述蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽的第12位、第16位、第22位、第26位、第36位、第46位、第48 位和第63位Cys形成二硫鍵，或蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽衍生物、類似物的8個Cys形成二 硫鍵。
12.根據權利要求1所述的蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽突變體及其衍生物、類似物，其特征 在于所述蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽突變體及其衍生物、類似物的8個Cys形成二硫鍵。
13.根據權利要求1-12中任何一項所述的蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽突變體及其衍生物、 類似物，其特征在于可利用基因工程技術和化學合成技術制備獲得。
14.一種藥物組合物，其特征在于含有如權利要求1-12中的任何一項限定的蛋白質 及一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑。
15.權利要求1-12中的任何一項所述的蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽突變體及其衍生物、類 似物及其所限定的突變體蛋白質在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術領域，涉及蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽突變體及其衍生物、類似物及其制備方法，具體涉及通過基因工程的方法對蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽進行定向改造。本發(fā)明利用DNA重組技術構建了一系列蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽突變體蛋白的載體，實現(xiàn)高效可溶性表達并經純化收獲突變體蛋白后驗證其體內生物活性，實驗結果表明突變體蛋白的體內鎮(zhèn)痛活性得到提高。
文檔編號C12N15/12GK101875691SQ20101010745
公開日2010年11月3日 申請日期2010年2月9日 優(yōu)先權日2010年2月9日
發(fā)明者劉巖峰, 吳春福, 崔勇, 張景海, 郭桂麗, 馬瑞 申請人:沈陽藥科大學