一種依替巴肽的液相合成方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種液相合成多肽藥物依替巴肽的方法，屬于多肽的合成【技術(shù)領(lǐng)域】。所述技術(shù)方案如下：（1）合成肽段Mpa(R1)-Lys(R2)-Gly-OH；（2）合成肽段H-Asp(R3)-Trp-Pro-Cys(R4)-NH2；（3）將肽段Mpa(R1)-Lys(R2)-Gly-OH和肽段H-Asp(R3)-Trp-Pro-Cys(R4)-NH2縮合得到線性肽Mpa(R1)-Lys(R2)-Gly--Asp(R3)-Trp-Pro-Cys(R4)-NH2；（4）將線性肽Mpa(R1)-Lys(R2)-Gly--Asp(R3)-Trp-Pro-Cys(R4)-NH2環(huán)化形成分子內(nèi)二硫鍵，得到側(cè)鏈保護(hù)的環(huán)肽；（5）脫除環(huán)肽的側(cè)鏈保護(hù)基；（6）將環(huán)肽Lys的側(cè)鏈氨基轉(zhuǎn)化為胍基，得到依替巴肽。本發(fā)明液相合成依替巴肽的方法，避免使用Fmoc-Har-OH這一特殊氨基酸衍生物為起始原料，建立了將環(huán)肽氨基轉(zhuǎn)化為胍基的條件及方法，原料試劑均價(jià)廉易得，能有效降低產(chǎn)品成本，顯著提高生產(chǎn)效益。
【專利說明】一種依替巴肽的液相合成方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種依替巴肽的液相合成方法，屬于生物化學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]依替巴肽由美國(guó)COR Therapeutic公司研發(fā)，1998年在美國(guó)上市，用于急性冠脈綜合癥的治療。通過抑制凝血因子I，與血小板糖蛋白II b/III a受體結(jié)合，從而抑制血小板聚集。在臨床應(yīng)用中，對(duì)不穩(wěn)定型心絞痛、急性心肌梗死、冠狀動(dòng)脈介入等心血管疾病的治療均顯示了良好療效。目前，心血管疾病逐年增加已成為現(xiàn)代社會(huì)對(duì)人類健康威脅嚴(yán)重的常見病之一，依替巴肽做為多肽類心血管系統(tǒng)藥物，具有藥效高、毒副作用低等優(yōu)點(diǎn)，得到臨床的廣泛應(yīng)用，且需求量逐年增加。
[0003]當(dāng)前依替巴肽的合成方法主要以固相合成法為主，專利CN200，910，104，99公開了一種依替巴肽的固相合成方法，該合成方法以Sieber樹脂為固相合成樹脂，采用Fmoc/tBu逐一偶聯(lián)合成側(cè)鏈全保護(hù)線性肽，在進(jìn)行多肽偶聯(lián)，將依替巴肽粗品從固相樹脂上切除，再分離純化得到依替巴肽純品。雖然此法可以有效合成依替巴肽，但原料昂貴，且線性肽合成副產(chǎn)物多，原料利用率較低。
[0004]現(xiàn)有的液相合成法也有報(bào)道，專利CN200，910，101，674公開了一種新的依替巴肽的全液相合成方法，專利CN200，910，156，804提供了一種依替巴肽的合成液相制備工藝，但是這些液相合成方法中依替巴肽的收率較低，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。
[0005]在目前已知的合成方法中，依替巴肽固相合成做為實(shí)驗(yàn)室研究是一種理想的方法，此法高效、迅速，但固相合成法原料利用率低，使用的試劑及溶劑昂貴且不易處理，常用的乙二硫醇、DMF等溶劑毒性大不適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。此外該法采用價(jià)格昂貴的高精氨酸為起始原料，其在有機(jī)溶劑中溶解性差，導(dǎo)致副產(chǎn)物增加，降低了合成效率。此外，在現(xiàn)有的液相合成法中，因收率低只能小規(guī)模生產(chǎn)，僅局限在IL左右的反應(yīng)釜內(nèi)進(jìn)行。這些都導(dǎo)致因依替巴肽售價(jià)高而增加患者的負(fù)擔(dān)，因此，目前亟需一種新的可以規(guī)模化生產(chǎn)的合成方法來降低依替巴肽的成本，降低依替巴肽的售價(jià)，減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種能大規(guī)模制備依替巴肽的液相合成方法。
[0007]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下:一種依替巴肽的液相合成方法，包括以下六個(gè)階段(I)合成肽段Fmoc-Trp-Pro-Cys(Trt)-NH2 ； (2)合成肽段 H-Asp (R3) -Trp-Pro-Cys (R4) -NH2 ；(3)將肽段 Mpa (R1) -Lys (R2) -Gly-OH 和肽段 H-Asp(R3)-Trp-Pro-Cys(R4)-NH2 縮合得到線性肽 Mpa (R1)-Lys (R2)-Gly—Asp (R3) -Trp-Pro-Cys (R4) -NH2 ； ( 4 )將線性肽 Mpa (R1)-Lys (R2)-Gly—Asp (R3) -Trp-Pro-Cys (R4) -NH2環(huán)化形成分子內(nèi)二硫鍵,得到側(cè)鏈保護(hù)的環(huán)肽；(5)脫除環(huán)肽的側(cè)鏈保護(hù)基；(6)將環(huán)肽Lys的側(cè)鏈氨基轉(zhuǎn)化為胍基，得到依替巴肽。具體步驟如下:
[0008]I)合成妝段 Fmoc-Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2[0009]將H-Cys (Trt) -NH2與Fmoc-Pro-OH進(jìn)行偶合反應(yīng)，然后再依次進(jìn)行洗滌、干燥、減壓蒸餾、加乙醚重結(jié)晶后得到二肽Fmoc-PiO-Cys (Trt) -NH2 ;然后脫除所述Fmoc-Pro-Cys (Trt) -NH2 中的 Fmoc 保護(hù)基，得到 H-Pro-Cys (Trt) -NH2 ;再將得到的所述H-Pro-Cys (Trt)-NH2與Fmoc-Trp-OH進(jìn)行偶合反應(yīng),然后再依次進(jìn)行洗漆、干燥、減壓蒸懼、加乙醚重結(jié)晶后得到三肽Fmoc-Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2 ；
[0010]2 )合成肽段 H-Asp (R3) -Trp-Pro-Cys (R4) -NH2
[0011]將Fmoc-Trp-Pro-Cys(Trt)-NH2 中的 Fmoc 保護(hù)基脫除，得到H-Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2 ;然后將所述 H-Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2 與 Fmoc-Asp (OtBu) -OH 進(jìn)行偶合反應(yīng)，然后再依次進(jìn)行洗滌、干燥、減壓蒸餾、加乙醚重結(jié)晶后得到四肽FmOC-Asp(0tBu) -Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2 ;再將所述 Fmoc-Asp (OtBu) -Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2 中的 Fmoc保護(hù)基脫除，得到四肽 H-Asp (OtBu) -Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2 ；
[0012]3)合成線性肽 Mpa (R1) -Lys (R2) -Gly一Asp (R3) -Trp-Pro-Cys (R4) -NH2
[0013]首先制備三肽Mpa (Trt)-Lys (Boc)-Gly-OH:
[0014]將H-Gly-OMe與Cbz-Lys (Boc) -OH進(jìn)行偶合反應(yīng)，然后再依次進(jìn)行洗滌、干燥、減壓蒸餾、加乙醚重結(jié)晶后得到二肽Cbz-Lys (Boc) -Gly-OMe ;然后將所述Cbz-Lys (Boc) -Gly-OMe 中的 Cbz 保護(hù)基脫除，得到 H-Lys(Boc)-Gly-OMe ;再將所述H-Lys (Boc) -Gly-OMe與Mpa (Trt) -OH進(jìn)行偶合反應(yīng)，然后再依次進(jìn)行洗滌、干燥、減壓蒸懼、加乙醚重結(jié)晶后得到三肽Mpa (Trt) -Lys (Boc) -Gly-OMe ;再將所述三肽Mpa (Trt) -Lys (Boc) -Gly-OMe用NaOH溶液水解，然后再依次用水和乙醚浸洗，得到三肽Mpa(Trt)-Lys(Boc)-Gly-OH,其中所述水和乙醚質(zhì)量比為3:1 ；
[0015]其次將四肽H-Asp (OtBu)-Trp-Pro-Cys (Trt)-NH2 與三肽Mpa (Trt) -Lys (Boc) -Gly-OH進(jìn)行偶合反應(yīng),然后再依次進(jìn)行洗漆、干燥、減壓蒸懼、加乙醚重結(jié)晶后得到線性七肽 Mpa (Trt) -Lys (Boc) -Gly-Asp (OtBu) -Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2 ；
[0016]4)合成側(cè)鏈保護(hù)的環(huán)肽


Mpa-Lys(Boc)-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys-NH2
[0017]將線性七肽環(huán)化得到環(huán)肽
【權(quán)利要求】
1.一種依替巴肽的液相合成方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)將H-Cys(Trt) -NH2與Fmoc-Pro-OH進(jìn)行偶合反應(yīng)，然后再依次進(jìn)行洗滌、干燥、減壓蒸餾、加乙醚重結(jié)晶后得到二肽Fmoc-PiO-Cys (Trt) -NH2 ;然后脫除所述Fmoc-Pro-Cys (Trt) -NH2 中的 Fmoc 保護(hù)基，得到 H-Pro-Cys (Trt) -NH2 ;再將得到的所述H-Pro-Cys (Trt)-NH2與Fmoc-Trp-OH進(jìn)行偶合反應(yīng),然后再依次進(jìn)行洗漆、干燥、減壓蒸懼、加乙醚重結(jié)晶后得到三肽Fmoc-Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2 ； 2)將步驟I)中得到的Fmoc-Trp-Pro-Cys(Trt) -NH2中的Fmoc保護(hù)基脫除，得到H-Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2 ;然后將所述 H-Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2 與 Fmoc-Asp (OtBu) -OH 進(jìn)行偶合反應(yīng)，然后再依次進(jìn)行洗滌、干燥、減壓蒸餾、加乙醚重結(jié)晶后得到四肽FmOC-Asp(0tBu) -Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2 ;再將所述 Fmoc-Asp (OtBu) -Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2 中的 Fmoc保護(hù)基脫除，得到四肽 H-Asp (OtBu) -Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2,備用； 3)將H-Gly-OMe與Cbz-Lys(Boc) -OH進(jìn)行偶合反應(yīng)，然后再依次進(jìn)行洗滌、干燥、減壓蒸餾、加乙醚重結(jié)晶后得到二肽Cbz-Lys (Boc) -Gly-OMe ;然后將所述Cbz-Lys (Boc) -Gly-OMe 中的 Cbz 保護(hù)基脫除，得到 H-Lys(Boc)-Gly-OMe ;再將所述H-Lys (Boc) -Gly-OMe與Mpa (Trt) -OH進(jìn)行偶合反應(yīng)，然后再依次進(jìn)行洗滌、干燥、減壓蒸懼、加乙醚重結(jié)晶后得到三肽Mpa (Trt) -Lys (Boc) -Gly-OMe ;再將所述三肽Mpa (Trt) -Lys (Boc) -Gly-OMe用NaOH溶液水解，然后再依次用水和乙醚浸洗，得到三肽Mpa(Trt)-Lys(Boc)-Gly-OH,其中所述水和乙醚質(zhì)量比為3:1 ； 4)將步驟2)中得到的四肽H-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys (Trt)-NH2與步驟3)中得到的三肽Mpa(Trt)-Lys(Boc)-Gly-OH進(jìn)行偶合反應(yīng),然后再依次進(jìn)行洗漆、干燥、減壓蒸懼、加乙醚重結(jié)晶后得到線性七肽 Mpa (Trt) -Lys (Boc) -Gly-Asp (OtBu) -Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2 ；
5)將步驟4)得到的線性七肽 Mpa(Trt) -Lys (Boc) -Gly-Asp (OtBu) -Trp-Pro-Cys (Trt)-NH2環(huán)化得到環(huán)肽
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的依替巴肽的液相合成方法，其特征在于，在步驟I)中，所述H-Cys(Trt)-NH2與Fmoc-Pro-OH進(jìn)行偶合反應(yīng)的工藝條件為:在偶和試劑為DIC、DCC中的一種或兩種混合物與HOCt、HOBt, HOAt中的一種或兩種混合物的混合溶液，溶劑為DCM，反應(yīng)溫度為O-35°C的條件下反應(yīng)，其中，所述H-Cys (Trt)-NH2、Fmoc-Pro-OH及偶和試劑的摩爾數(shù)之比為1:1: 1.2 ; 所述脫除Fm0c-Pr0-Cys(Trt)-NH2中的Fmoc保護(hù)基的工藝條件為:在試劑為Et2NH和DCM,反應(yīng)溫度為O-35°C的條件下，反應(yīng)6小時(shí)； 所述H-Pro-Cys (Trt) -NH2與Fmoc-Trp-OH進(jìn)行偶合反應(yīng)的工藝條件為:在偶和試劑為DIC和HOCt，溶劑為DCM，反應(yīng)溫度為O-35 °C的條件下反應(yīng)，其中，所述H-Pro-Cys (Trt) -NH2, Fmoc-Trp-OH 及偶和試劑的摩爾數(shù)之比為 1:1: 1.2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的依替巴肽的液相合成方法，其特征在于，在步驟2)中，所述脫除Fmoc-Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2中的Fmoc保護(hù)基的工藝條件為:在試劑為Et2NH和DCM，反應(yīng)溫度為O-35°C的條件下，反應(yīng)6小時(shí)； 所述H-Trp-Pro-Cys (Trt)-NH2與Fmoc-Asp (OtBu)-OH進(jìn)行偶合反應(yīng)的工藝條件為:在偶和試劑為DIC和HOCt ，溶劑為DCM，反應(yīng)溫度為O-35°C的條件下反應(yīng)，其中，所述H-Pro-Cys (Trt) -NH2> Fmoc-Asp (OtBu) -OH 及偶和試劑的摩爾數(shù)之比為 1:1:1.2 ； 所述脫除Fmoc-Asp (OtBu) -Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2中的Fmoc保護(hù)基的工藝條件為:在試劑為Et2NH和DCM，反應(yīng)溫度為O-35°C的條件下，反應(yīng)6小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的依替巴肽的液相合成方法，其特征在于，在步驟3)中，所述H-Gly-OMe與Cbz-Lys (Boc)-OH進(jìn)行偶合反應(yīng)的工藝條件為:在偶和試劑為DIC、DCC中的一種或兩種混合物與HOCt、HOBt, HOAt中的一種或兩種混合物的混合溶液，溶劑為DCM，反應(yīng)溫度為O-35°C的條件下反應(yīng)，其中，所述H-Gly-OMe、Cbz-Lys (Boc)-OH及偶和試劑的摩爾數(shù)之比為1:1: 1.2 ; 所述脫除Cbz-Lys(B0c)-Gly-OMe中的Cbz保護(hù)基的具體步驟為:以Pd-C為催化劑，MeOH為溶劑，反應(yīng)溫度為0-35°C的條件下，通入H2進(jìn)行催化氫化反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間12小時(shí)；其中，所述Pd-C催化劑的重量為所述Cbz-Lys (Boc) -Gly-OMe的10_20%，所述Pd-C催化劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% ； 所述H-Lys (Boc) -Gly-OMe與Mpa (Trt) -OH進(jìn)行偶合反應(yīng)的工藝條件為:在偶和試劑為DIC和HOCt，溶劑為DCM，反應(yīng)溫度為O-35 °C的條件下反應(yīng)，其中，所述H-Lys(Boc)-Gly-OMe、Mpa(Trt)-OH 及偶和試劑的摩爾數(shù)之比為 1:1:1.2 ； 所述三肽Mpa (Trt)-Lys (Boc)-Gly-OMe用NaOH溶液水解的工藝條件為:溶劑為Imol/L的NaOH溶液，反應(yīng)溫度為O-35°C ;反應(yīng)時(shí)間為1.5小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的依替巴肽的液相合成方法，其特征在于，在步驟4)中，所述H-Asp (OtBu) -Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2 與 Mpa (Trt) -Lys (Boc) -Gly-OH 進(jìn)行偶合反應(yīng)的工藝條件為:在偶和試劑為DIC、DCC中的一種或兩種混合物與HOCt、HOBt, HOAt中的一種或兩種混合物的混合溶液，溶劑為DCM，反應(yīng)溫度為O-35°C的條件下，反應(yīng)時(shí)間4小時(shí)；其中，所述 H-Asp (OtBu) -Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2、Mpa (Trt) -Lys (Boc) -Gly-OH 及偶和試劑的摩爾數(shù)之比為1:1: 1.2。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的依替巴肽的液相合成方法，其特征在于，在步驟5)中，所述環(huán)化的具體步驟為:將所述 Mpa (Trt)-Lys (Boc)-Gly-Asp (OtBu)-Trp-Pro-Cys (Trt)-NH2 與 I2的DCM溶液，在溶劑為DCM，反應(yīng)溫度為O-35°C的條件下進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間4小時(shí)，得到反應(yīng)液，反應(yīng)液分別用Na2S2O3溶液和飽和NaCl溶液萃取,再用無水Na2SO4干燥，然后加乙 醚析出粗產(chǎn)物，再用DCM和MeOH重結(jié)晶，得到環(huán)肽
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的依替巴肽的液相合成方法，其特征在于，在步驟6)中，將所述
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的依替巴肽的液相合成方法，其特征在于，在步驟7)中，將環(huán)七 肽鹽酸鹽
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的依替巴肽的液相合成方法，其特征在于，所述三氧化硫脲的制作步驟為:將濃硫酸、雙氧水及二氧化硫脲進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)溫度為4°C，反應(yīng)時(shí)間為12小時(shí)，水沉淀出所述三氧化硫脲；其中，所述濃硫酸、雙氧水及二氧化硫脲的摩爾比為0.05:1:0.8。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)所述的依替巴肽的液相合成方法，其特征在于，在步驟I)至步驟4)中，所述洗滌步驟均為用NaHCO3溶液、鹽酸溶液及飽和NaCl溶液依次進(jìn)行洗滌；所述干燥劑均為無水Na2SO4干燥劑；所述減壓溫度均為30-40°C。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)所述依替巴肽的合成方法，其特征在于，所述步驟I)至步驟4)中，脫除所述Fmoc-保護(hù)基所用的試劑為含(1-95)%哌啶的DCM溶液或/和含(1-95)%乙二胺的DCM溶液；脫除Cbz-保護(hù)基的條件為:金屬Pd催化下通入H2或脫除Cbz-保護(hù)基的試劑采用HBr/醋酸的混合溶劑，其中HBr與醋酸的體積比范圍為:(1:4) - (1:2)。
【文檔編號(hào)】C07K1/02GK103450346SQ201310390106
【公開日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2013年8月30日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月14日
【發(fā)明者】高秀偉, 高秀巖, 任孝敏, 王樸 申請(qǐng)人:煙臺(tái)海安多肽藥物研發(fā)技術(shù)有限公司