專利名稱：抗癌止痛肽vkvr及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及抗癌止痛肽VKVR及其制備方法與應(yīng)用，具體地說，本發(fā)明涉及抗癌止痛肽VKVR及其衍生物、類似物、活性片段的結(jié)構(gòu)以及其制備方法和作為鎮(zhèn)痛和抗癌藥物在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蝎作為中醫(yī)珍貴藥材又稱全蟲、全蝎，始載于《開寶本草》、《本草綱目》等醫(yī)藥學(xué)名著，距今已有2000多年的藥用歷史，具有熄風鎮(zhèn)痙、攻毒散結(jié)、痛絡(luò)止痛之功效。臨床用于治療偏頭痛、面神經(jīng)癱瘓、風濕痹痛及癌痛等癥，療效確切。蝎主要活性成分是尾腺分泌的毒素，其中蘊涵大量具有藥學(xué)價值的活性組分，是一個富含有多種功能肽的天然活性肽庫。目前，從蝎或蝎毒中分離純化并結(jié)構(gòu)解析具有鎮(zhèn)痛和抗腫瘤活性的成分還不是很多，但也有相關(guān)的發(fā)明專利，如“蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽”。本發(fā)明就是從全蝎或蝎尾或蝎毒中，分離純化篩選獲得一種具有鎮(zhèn)痛和抗腫瘤活性的新型結(jié)構(gòu)多肽。同時，利用基因工程技術(shù)或化學(xué)合成技術(shù)解決該活性肽的獲得方法。此夕卜，利用基因工程技術(shù)獲得仍具有鎮(zhèn)痛和抗腫瘤活性的該活性肽的衍生物或類似物或活性片段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對蝎抗癌止痛肽VKVR，利用蛋白提取、分離、純化技術(shù)，從蝎毒或蝎尾或全蝎中篩選、分離、純化獲得?？拱┲雇措腣KVR獲得方法簡單易行，可與任何載體混合制備醫(yī)學(xué)上可接受的劑型。本發(fā)明的目的可以通過以下措施來達到
利用全蝎或蝎尾或蝎毒中抗癌止痛肽VKVR的分子量、等電點、分子表面的疏水性與其它蛋白質(zhì)、多肽、酶的差異，單獨或綜合借助這些差異，通過超濾；膠過濾、離子交換、疏水、反相層析方法，從全蝎或蝎尾或蝎毒中獲得抗癌止痛肽VKVR(VKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIR
VPGRCNG)。根據(jù)該活性肽的結(jié)構(gòu)，利用化學(xué)合成方法獲得該活性肽或該活性肽的部分片段或該活性肽的衍生物、類似物。根據(jù)該活性肽的結(jié)構(gòu)，利用化學(xué)合成方法或生物技術(shù)獲得該活性肽或該活性肽的部分片段或該活性肽的衍生物、類似物的基因，通過重組DNA技術(shù)即基因工程方法，克隆至基因工程表達載體中，經(jīng)表達、純化獲得抗癌止痛肽VKVR或該活性肽的部分片段或該活性肽的衍生物、類似物。本發(fā)明所述的抗癌止痛肽VKVR或該活性肽的部分片段或該活性肽的衍生物、類似物不僅可作為治療各種疼痛和腫瘤疾病的藥物，也可作為研究工具，用于鎮(zhèn)痛、抗腫瘤的新化合物的篩選。本發(fā)明的技術(shù)方案包括⑴原料(蝎毒或蝎尾或全蝎)首先進行勻漿(以蝎尾或全蝎為原料)，利用蒸餾水或酸性溶液或堿性溶液溶解抽提，離心除去不溶雜質(zhì)得到抽提液； (2)該抽提液可以通過疏水層析柱、離子交換層析柱、凝膠過濾層析柱的不同組合以及經(jīng)超濾去除鹽、雜蛋白和濃縮得到抗癌止痛肽VKVR ; (3)經(jīng)反向?qū)游鲋玫礁呒兌鹊目拱┲雇措腣KVR。比如，蝎毒經(jīng)酸性溶液溶解，離心除去不溶雜質(zhì)得到抽提液；抽提液經(jīng)疏水層析柱分離得到抗癌止痛活性組分；得到活性組分經(jīng)超濾以去除鹽和雜蛋白，同時進行濃縮，通過離子交換層析柱分離得到活性組分；經(jīng)疏水層析柱進一步分離得到活性組分；經(jīng)超濾以去除鹽和濃縮，通過離子交換層析柱純化得到活性組分；經(jīng)凝膠過濾層析柱進一步純化得到活性組分；經(jīng)反向?qū)游鲋玫礁呒兌鹊目拱┲雇措腣KVR。本發(fā)明目的之二是針對抗癌止痛肽VKVR的生物活性，利用基因工程技術(shù)獲得抗癌止痛肽VKVR及其部分片段或衍生物或類似物，通過獲得表達產(chǎn)物的生物活性，以獲得可以進一步開發(fā)抗癌、鎮(zhèn)痛類藥物的抗癌止痛肽VKVR及其部分片段或衍生物或類似物，本發(fā)明所述的的獲得方法常規(guī)、簡單、產(chǎn)量高，不僅具有重要的指導(dǎo)意義和實用價值，也為工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明目的之三是提供多種抗癌止痛肽VKVR及其部分片段或衍生物或類似物的制備方法，它包括利用基因工程技術(shù)進行表達或通過化學(xué)合成獲得。基因工程技術(shù)包括
⑴將抗癌止痛肽VKVR及其部分片段或衍生物或類似物編碼DNA重組至表達載體； ⑵用步驟⑴的重組表達載體轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗骷毎?原核或真核細胞)；
⑶在適合的誘導(dǎo)表達條件下，培養(yǎng)步驟⑵的被轉(zhuǎn)化的宿主細胞；
⑷收獲并純化所得到的蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供上述抗癌止痛肽VKVR及其部分片段或衍生物或類似物的表達產(chǎn)物分離純化方法?？墒褂名}析沉淀、超濾、離子交換層析、疏水作用層析和凝膠過濾等方法從細胞的溶胞產(chǎn)物及培養(yǎng)液中分離并純化所需的表達產(chǎn)物。在表達產(chǎn)物的分離和純化過程中，可使用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)或蛋白免疫印跡法(WESTERN)檢測表達產(chǎn)物的存在及相應(yīng)分子大小。本發(fā)明首次進行上述抗癌止痛肽VKVR及其部分片段或衍生物或類似物的生物活性實驗。本發(fā)明還提供了上述抗癌止痛肽VKVR及其部分片段或衍生物或類似物在生物制藥領(lǐng)域的應(yīng)用，具體地說包括鎮(zhèn)痛和抗癌生物活性。本發(fā)明的再一個目的是提供含有如上限定的蛋白質(zhì)及一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑的藥物組合物。可按照制藥工業(yè)領(lǐng)域已知的基本原則和方法制備適于胃腸道外途徑給藥的藥物組合物(如參見Remington’ s Pharmaceutical Science, 15th.,Mack Publishing Company, 1980)?？赏ㄟ^各種給藥途徑,特別是靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、腹腔內(nèi)、鼻內(nèi)、皮內(nèi)、皮下等胃腸道外途徑投用本發(fā)明的藥物組合物。本發(fā)明的再一個目的是提供如上限定的蛋白質(zhì)在生產(chǎn)鎮(zhèn)痛、抗癌藥物中的應(yīng)用?？墒褂帽景l(fā)明的蛋白或含有該蛋白質(zhì)的藥物組合物作為治療劑，用于治療特定類型人體的各種疼痛相關(guān)疾病。本發(fā)明的藥物組合物的治療有效劑量一般應(yīng)根據(jù)疾病的性質(zhì)、嚴重程度及對藥物的敏感適應(yīng)性，以及給藥途徑等諸多因素由臨床醫(yī)生按照個體化原則來確定。在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細胞”包括原核細胞和真核細胞，常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞等。本發(fā)明所述的抗癌止痛肽VKVR或該活性肽的部分片段或該活性肽的衍生物、類似物的獲得方法常規(guī)、簡單、產(chǎn)量高，對研制開發(fā)鎮(zhèn)痛、抗腫瘤肽類藥物具有重要的指導(dǎo)意義和實用價值，為工業(yè)化生產(chǎn)和實用化奠定了基礎(chǔ)。
具體實施例方式下面的實施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明特批權(quán)利要求的范圍。實施例I :
從蝎毒獲得抗癌止痛肽VKVR
獲得抗癌止痛肽VKVR的提取、分離、純化體系基本條件的特征1.操作溫度在O0C -450C ；2.溶液的酸堿度在pH2-pH12。上述條件既不破壞提取、分離、純化所采用介質(zhì)的理化性質(zhì)，又不影響抗癌止痛肽VKVR的活性。(I)抗癌止痛肽VKVR活性成分的抽提
A.蝎毒溶于蒸懼水后，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，取上清液用0. OlM鹽酸或磷酸溶液調(diào)pH為2，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，取上清液用堿性溶液調(diào)pH為12，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，上清液為含有抗癌止痛肽VKVR活性成分的抽提液。B.蝎毒溶于pH為2的緩沖溶液或酸性溶液，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，取上清液用堿性溶液調(diào)PH為12，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，上清液為含有抗癌止痛肽VKVR活性成分的抽提液。C.蝎毒溶于pH為12的緩沖溶液或堿性溶液，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，取上清液用酸性溶液調(diào)PH為2，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，上清液為含有抗癌止痛肽VKVR活性成分的抽提液。上述提取液的酸堿度從pH2_pH12，均不影響含有抗癌止痛肽VKVR的生物活性，且從原料中能夠提取活性成分。(2 )抗癌止痛肽VKVR的疏水層析分離
取上述含有抗癌止痛肽VKVR活性成分的抽提液，用鹽酸水溶液或磷酸水溶液或酸性溶液或堿性溶液調(diào)pH至中性條件范圍下，加中性鹽至2M濃度，上樣于預(yù)先用2M中性鹽-緩沖液溶液平衡的疏水層析柱，分別用2. 0M、I. 5M、I. 0M、0. 5M中性鹽-緩沖液洗脫，最后用緩沖液洗脫，將含有抗癌止痛肽VKVR的洗脫液合并。疏水層析分離的特征1.疏水層析介質(zhì)選擇苯基-疏水層析添料或正辛烷-疏水層析添料-或己烷-疏水層析添料-或丁烷-疏水層析添料；2.中性鹽選擇(HN3)2SO4或Na2SO4或NaCl ；3.緩沖液的pH選擇在pH2_pH12，此條件既不影響抗癌止痛肽VKVR的生物活性，又不影響活性成分的分離；4.緩沖液的濃度選擇在ImM-lOOmM，此條件既不影響抗癌止痛肽VKVR的生物活性，又不影響活性成分的分離。(3 )超濾處理抗癌止痛肽VKVR活性成分溶液
利用超濾處理的目的是除去抗癌止痛肽VKVR活性成分溶液中的鹽或雜蛋白或更換緩沖液，此外，對抗癌止痛肽VKVR活性成分溶液進行濃縮。選擇能夠使抗癌止痛肽VKVR透過的超濾膜進行超濾處理，此時收集超濾透過液，而雜蛋白被截留實現(xiàn)分離的目的。選擇能夠截留抗癌止痛肽VKVR的超濾膜進行超濾處理，此時收集超濾濃縮液(抗癌止痛肽VKVR被截留)，而鹽、緩沖液的緩沖對、能透過超濾膜的雜蛋白、水被透過，實現(xiàn)去除鹽、雜蛋白或更換、緩沖液或濃縮的目的。超濾處理的特征1.透過抗癌止痛肽VKVR的超濾膜選擇是分子量為IOkDa或20kDa或30kDa或40kDa或50kDa的超濾膜，優(yōu)選30kDa的超濾膜，大于或小于30kDa的超濾膜，其收率或超濾效率均受影響；2.截留抗癌止痛肽VKVR的超濾膜選擇是分子量為IkDa或2kDa或3kDa或5kDa的超濾膜，優(yōu)選IkDa的超濾膜，大于或小于IkDa的超濾膜，其收率或超濾效率均受影響；3.超濾處理的溫度選擇在(TC _45°C，此條件既不破壞超濾膜的理化性質(zhì)，又不影響抗癌止痛肽VKVR的活性。(4)抗癌止痛肽VKVR的離子交換層析分離
方法(3)超濾處理的抗癌止痛肽VKVR活性成分溶液，進一步用本實驗的緩沖液進行除鹽、緩沖液更換和濃縮。待處理好的樣品液上樣于預(yù)先用緩沖液平衡好的離子交換層析柱，先用緩沖液充分洗滌去除不吸附的雜蛋白，分別用0. 05M、0. 1M、0. 15M、0. 2M、0. 25M、0. 3M、 0.4M、0. 5M鹽溶液進行階段洗脫，將含有抗癌止痛肽VKVR的洗脫液合并。離子交換層析分離的特征1.層析介質(zhì)選擇陽離子交換層析添料，如CM-離子交換層析添料或SP-離子交換層析添料或S-離子交換層析添料等陽離子交換層析添料，此時緩沖液酸堿度選擇在pH2_pH7 ；2.層析介質(zhì)選擇陰離子交換層析添料，如Q-離子交換層析添料或DEAE-離子交換層析添料或QAE-離子交換層析添料等離子交換層析添料，此時緩沖液酸堿度選擇在pH7-pH12 ；3.緩沖液的濃度選擇在lmM-50mM，此條件既不影響抗癌止痛肽VKVR的生物活性，又不影響活性成分的分離；4.階段洗脫的鹽溶液選擇是要求濃度(0. 05M、0. 1M、0. 15M、0. 2M、0. 25M、0. 3M、0. 4M、0. 5M)的緩沖液或在 IOmM 緩沖液中加中性鹽到需要的濃度(0. 05M、0. 1M、0. 15M、0. 2M、0. 25M、0. 3M、0. 4M、0. 5M)；5.中性鹽選擇(HN3)2SO4或 Na2SO4 或 NaCl 或 KCl，優(yōu)選 NaCl。(5)抗癌止痛肽VKVR的疏水層析進一步分離
得到的抗癌止痛肽VKVR活性成分按照方法(2)的基本框架進一步分離?？拱┲雇措腣KVR活性成分溶液加中性鹽至2M濃度，上樣于預(yù)先用2M中性鹽-緩沖液溶液平衡的疏水層析柱，進行中性鹽濃度梯度(2. OM 0. 0M)洗脫，合并收集含有抗癌止痛肽VKVR活性成分的洗脫峰，進行超濾去鹽和濃縮處理。疏水層析分離的特征1.疏水層析介質(zhì)選擇苯基-疏水層析添料或正辛烷-疏水層析添料-或己烷-疏水層析添料-或丁烷-疏水層析添料；2.中性鹽選擇(HN3)2SO4或Na2SO4或NaCl ；3.緩沖液的pH選擇在pH2_pH12 ；4.緩沖液的濃度選擇在ImM-lOOmM。(6)抗癌止痛肽VKVR的離子交換層析進一步分離
得到的抗癌止痛肽VKVR活性成分按照方法(4)的基本框架進一步分離。待處理好的樣品液上樣于預(yù)先用緩沖液平衡好的離子交換層析柱，先用緩沖液充分洗滌去除不吸附的雜蛋白，進行鹽濃度梯度(0. OM I. OM)洗脫，合并收集含有抗癌止痛肽VKVR的洗脫峰。離子交換層析分離的特征1.層析介質(zhì)選擇陽離子交換層析添料，如CM-離子交換層析添料或SP-離子交換層析添料或S-離子交換層析添料等陽離子交換層析添料，此時緩沖液酸堿度選擇在pH2-pH7 ；2.層析介質(zhì)選擇陰離子交換層析添料,如Q-離子交換層析添料或DEAE-離子交換層析添料或QAE-離子交換層析添料等離子交換層析添料，此時緩沖液酸堿度選擇在pH7-pH12 ;3.緩沖液的濃度選擇在lmM-50mM;4.鹽梯度洗脫的鹽溶液選擇是要求濃度(I. OM)的緩沖液或在IOmM緩沖液中加中性鹽到需要的濃度(I. 0M) ；5.中性鹽選擇(HN3) 2S04 或 Na2SO4 或 NaCl 或 KCl，優(yōu)選 NaCl。(7 )抗癌止痛肽VKVR的凝膠層析純化
含有抗癌止痛肽VKVR的溶液進行超濾濃縮，樣品液上樣于預(yù)先用洗脫液平衡好的凝膠過濾層析柱并進行純化，收集含有抗癌止痛肽VKVR的洗脫峰。凝膠層析分離的特征1 層析介質(zhì)可以選擇Sephacryl S-100 HR或SephacrylS_200 HR 或 Sephadex G-50 或 Sephadex G-75 或 Sephadex G-100 或 Sephadex G-150或 Superose 12 prep grade 或 Superose 6 prep grade 或 Superdex 30 prep grade 或Superdex 75 prep grade 或Superose 12 HR或Superose 6 HR或 Superdex Peptide HR或Superdex75 HR或Superdex Peptide PE等凝膠層析添料； 2.洗脫液的pH選擇在pH2_pH12 ；3.洗脫液的濃度選擇在離子濃度大于0.15M及以上。(8)抗癌止痛肽VKVR的反相層析高純度純化
活性組分，上樣于預(yù)先用0. 1%三氟醋酸-20%乙腈水溶液平衡好的反相層析柱，如SOURCE 15RPC、30RPC層析添料，先用0. 1%三氟醋酸-20%乙腈水溶液充分洗滌，而后進行乙腈濃度梯度(20%至95%)洗脫，合并收集洗脫峰面積最大的洗脫峰組分-抗癌止痛肽VKVR0從蝎毒獲得的抗癌止痛肽VKVR的結(jié)構(gòu)特征 VKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGRCNG。實施例2
從蝎尾獲得抗癌止痛肽VKVR 本實施例的策略、基本方法和基本過程同實施例I。(I)抗癌止痛肽VKVR活性成分的抽提
A.蝎尾加蒸餾水后進行勻漿，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，上清液用0. OlM鹽酸或磷酸溶液或酸性溶液調(diào)PH為2，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，取上清液用堿性溶液調(diào)pH為12，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，上清液是從蝎尾獲得含有抗癌止痛肽VKVR活性成分的抽提液。B.蝎尾加pH為2的緩沖溶液或酸性溶液后進行勻漿，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，取上清液用堿性溶液調(diào)PH為12，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，上清液是從蝎尾獲得含有抗癌止痛肽VKVR活性成分的抽提液。C.蝎尾加pH為12的緩沖溶液或堿性溶液后進行勻漿，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，取上清液用酸性溶液調(diào)PH為2，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，上清液是從蝎尾獲得含有抗癌止痛肽VKVR活性成分的抽提液。上述提取液的酸堿度從pH2_pH12，均不影響抗癌止痛肽VKVR的生物活性，且從原料中能夠提取活性成分。(2)抗癌止痛肽VKVR的分離純化以及高純度純化
取上述含有抗癌止痛肽VKVR成分的抽提液，同實施例I中的(2) — (8)的策略、基本方法和基本過程分離純化抗癌止痛肽VKVR。從蝎尾獲得的抗癌止痛肽VKVR的結(jié)構(gòu)特征 VKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGRCNG。實施例3 從全蝎獲得抗癌止痛肽VKVR 本實施例的策略、基本方法和基本過程同實施例2。(I)抗癌止痛肽VKVR活性成分的抽提
A.全蝎加蒸餾水后進行勻漿，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，取上清液用0. OlM鹽酸或磷酸溶液或酸性溶液調(diào)PH為2，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，取上清液用堿性溶液調(diào)pH為12，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，上清液為從全蝎獲得含有抗癌止痛肽VKVR成分的抽提液。B.全蝎加pH為2的緩沖溶液或酸性溶液后進行勻漿，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，取上清液用堿性溶液調(diào)PH為12，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，上清液為從全蝎獲得含有抗癌止痛肽VKVR成分的抽提液。C.全蝎加pH為12的緩沖溶液或堿性溶液后進行勻漿，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，取上清液用酸性溶液調(diào)PH為2，15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，上清液為從全蝎獲得含有 抗癌止痛肽VKVR成分的抽提液。上述提取液的酸堿度從pH2_pH12，均不影響抗癌止痛肽VKVR的生物活性，且從原料中能夠提取活性成分。取上述含有抗癌止痛肽VKVR成分的抽提液，同實施例I中(2)- (8)的策略、基本方法和基本過程分離純化抗癌止痛肽VKVR。從全蝎獲得的抗癌止痛肽VKVR的結(jié)構(gòu)特征 VKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGRCNG。實施例4
抗癌止痛肽VKVR的獲得
本實施例的策略、基本方法和基本過程同實施例I。蝎毒或蝎尾或全蝎中的抗癌止痛肽VKVR活性成分抽提的策略、基本方法和基本過程同實施例I、實施例2和實施例3?？拱┲雇措腣KVR的分離純化的策略、基本方法和基本過程同實施例I。獲得的抗癌止痛肽VKVR成分抽提液可以通過疏水層析柱、離子交換層析柱、凝膠過濾層析柱的不同組合以及經(jīng)超濾去除鹽、雜蛋白和濃縮得到鎮(zhèn)痛活性肽-SYPU1，經(jīng)反相層析柱得到高純度的抗癌止痛肽VKVR。這種組合的特征1.抗癌止痛肽VKVR活性成分抽提液經(jīng)過離子交換層析分離-疏水層析分離-離子交換層析進一步分離-疏水層析進一步分離-凝膠層析純化-反向?qū)游觯?.抗癌止痛肽VKVR活性成分抽提液經(jīng)過凝膠層析純化-離子交換層析分離-疏水層析分離-離子交換層析進一步分離-疏水層析進一步分離-反向?qū)游觯?.抗癌止痛肽VKVR活性成分抽提液經(jīng)過凝膠層析純化-疏水層析分離-離子交換層析分離-疏水層析進一步分離-離子交換層析進一步分離-反向?qū)游觯?.按照上述的分離純化體系，不論如何組合不同層析順序，均能分離純化獲得抗癌止痛肽VKVR。獲得的抗癌止痛肽VKVR的結(jié)構(gòu)特征 VKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGRCNG。實施例5
抗癌止痛肽VKVR及其衍生物、類似物、活性片段的獲得 I.抗癌止痛肽VKVR基因的構(gòu)建本實施例列舉描述用于表達本發(fā)明抗癌止痛肽VKVR及其衍生物、類似物、活性片段基因的構(gòu)建策略和基本方法。根據(jù)抗癌止痛肽VKVR的N末端和C末端氨基酸序列，分別設(shè)計相應(yīng)寡核苷酸引物，同時在上述兩個寡核苷酸引物的5'端，分別加上限制性核酸內(nèi)切酶I和BamHl水解位點序列；以蝎cDNA為模板進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物并進行核酸片段的凝膠回收；經(jīng)過限制性核酸內(nèi)切酶I和BernH I雙酶切后與同樣進行雙酶切的質(zhì)粒在T4 DNA Iigase的作用下進行重組連接，熱轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH 5 a，經(jīng)過菌落PCR和限制性核酸內(nèi)切酶酶切驗證篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化子后提交生物技術(shù)服務(wù)公司進行DNA序列測定。結(jié)果表明，通過上述基因工程的方法構(gòu)建抗癌止痛肽VKVR基因。2.抗癌止痛肽VKVR及其衍生物、類似物、活性片段的獲得
利用基因過程技術(shù)，將抗癌止痛肽VKVR基因重組至大腸桿菌表達質(zhì)粒中，提取質(zhì)粒進行測序。
該重組表達質(zhì)粒編碼表達產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征為VKDGYI VDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGRCNG。將陽性重組質(zhì)粒熱轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 ( A DE3)，然后從該LB固體平板上挑取單菌落后接種至3 ml LB (含卡那抗生素,50 Mg/ml),于37 °C, 200 r/min振蕩過夜培養(yǎng)。按照1%接種量將過夜培養(yǎng)物接種至400 ml含相應(yīng)抗生素的新鮮LB培養(yǎng)基的三角瓶中，于37 V，200 r/min振蕩培養(yǎng)至0D600為0. 6-0. 8，加入終濃度為0. 166 mmol/L的誘導(dǎo)物異丙基0-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，培養(yǎng)4 h。結(jié)束發(fā)酵，3000 g、4 °C離心20 min，收集菌體。用40 ml裂解緩沖液(0. I M PBS, 0. 15 M NaCl, 50 mM咪唑)重懸菌體，進行超聲破碎，超聲結(jié)束后于12，000g、4 °C離心20 min，得上清液，所得沉淀按照上述步驟重復(fù)破碎一次，合并兩次上清液，直接上樣于0.1 M PBS (pH 8. 0)預(yù)先平衡好的金屬離子螯合層析柱，經(jīng)過兩個不同階段的PH緩沖液分別充分洗滌5個柱床體積后，使用0. 5 M咪唑(pH 9. 0)進行洗脫并收獲該洗脫液。所得產(chǎn)物經(jīng)過15% SDS-PAGE驗證其純度。由柱層析色譜圖和SDS-PAGE圖譜說明，重組蛋白質(zhì)獲得高效表達，達到電泳純度。上述獲得的表達產(chǎn)物，利用化學(xué)法在M處斷裂肽鏈，從而獲得抗癌止痛肽VKVR，結(jié)構(gòu)特征為VKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGRCNG。同上原則獲得抗癌止痛肽VKVR衍生物、類似物、活性片段的表達產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)特征為
MVKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGRCNG。VKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGRCNGG。MVKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGRCNGG。(SGGGG)n VKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGRCNG。(n可以是I或2或3或4或5)。(SGGGG)n VKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGRCNGG。(n可以是I或2或3或4或5)。M (SGGGG)n VKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGRCNG。(n可以是I或2或3或4或5)。M (SGGGG)n VKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGRCNGG。(n可以是I或2或3或4或5)。3.抗癌止痛肽VKVR在酵母中的表達及其純化
將編碼抗癌止痛肽VKVR基因的序列用下列寡核苷酸引物進行擴增，獲得插入片斷。PCR反應(yīng)所使用的5'寡核苷酸引物序列含有EcoR V限制性內(nèi)切酶的酶切位點和抗癌止痛肽VKVR的N末端區(qū)域氨基酸序列的編碼序列，3'端引物序列含有EcoR I限制性內(nèi)切酶的酶切位點、一個翻譯終止密碼子和抗癌止痛肽VKVR的C末端區(qū)域氨基酸序列的編碼序列。
·
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點對應(yīng)于酵母表達載體PPIC9K上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(其中EcoR V和SnaB I的內(nèi)切酶切口為平末端)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和KarO，一個來自2P質(zhì)粒的復(fù)制子，一個AOXl啟動子，在畢赤酵母中可由甲醇誘導(dǎo)高效表達，一個a -因子的信號肽序列，一個轉(zhuǎn)錄終止信號，一個HIS4選擇性標記以及整合序列。用SnaB I和EcoR I消化pPIC9K載體，用EcoR V和EcoR I消化插入片段，隨后將插入片段連入PPIC9K載體，連接產(chǎn)物熱轉(zhuǎn)化E. coli DH 5 a菌株，在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在含有Amp (IOOii g/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)含所需構(gòu)建物的克隆。抽提質(zhì)粒，測序驗證插入片段正確插入。取質(zhì)粒線性化后，電轉(zhuǎn)化入酵母細胞，線性化的重組載體通過與宿主基因組的同源序列發(fā)生同源重組產(chǎn)生穩(wěn)定的酵母轉(zhuǎn)化體。利用G418篩選出高拷貝的整合轉(zhuǎn)化子。將篩選得到的菌株接種于裝有25ml MGY、BMG或BMGY培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，于28 30°C/250 300轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)至0D600 = 2 6 (16 18 h);室溫下3000轉(zhuǎn)/分離心5min，收集菌體，用1/5到1/10原培養(yǎng)體積的麗、BMM或BMMY重懸菌體(約10 20ml);將步驟2所得的菌液置于IOOml的搖瓶中，用雙層紗布或粗棉布封口，放置于28 30°C /250 300轉(zhuǎn)/分的搖床上繼續(xù)生長；每24h向培養(yǎng)基中添加100%甲醇至終濃度為0. 5
I.0% ;分離樣品的上清液，用截留分子量為3000Da的超濾膜超濾除去色素，用SDS-PAGE、Western-Blot及活性實驗檢測與鑒定重組蛋白的表達。該體系表達產(chǎn)物結(jié)構(gòu)特征為VKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGRCNG。同上原則獲得抗癌止痛肽VKVR衍生物、類似物、活性片段的表達產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)特征為
MVKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGRCNG。VKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGRCNGG。MVKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGRCNGG。(SGGGG)n VKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGRCNG。(n可以是I或2或3或4或5)。(SGGGG)n VKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGRCNGG。(n可以是I或2或3或4或5)。M (SGGGG)n VKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGRCNG。(n可以是I或2或3或4或5)。M (SGGGG)n VKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGRCNGG。(n可以是I或2或3或4或5)。實施例6 體內(nèi)鎮(zhèn)痛活性一小鼠醋酸扭體法
本實施例通過小鼠體內(nèi)鎮(zhèn)痛模型確定抗癌止痛肽VKVR的體內(nèi)生物活性-鎮(zhèn)痛活性。此外也旨在驗證抗癌止痛肽VKVR衍生物、類似物、活性片段的鎮(zhèn)痛活性。蛋白濃度采用Lowry方法進行測定。小鼠醋酸扭體法鎮(zhèn)痛模型將冰醋酸作為化學(xué)刺激物注入昆明種小鼠腹腔內(nèi)，繼而引起深部的、大面積而較持久的疼痛刺激，致使小鼠產(chǎn)生“扭體”反應(yīng)(腹部內(nèi)凹、軀干與后腿伸張、臀部高起)。以嗎啡為陽性對照，生 理鹽水為空白對照，按照下述公式計算各個給藥組的扭體反應(yīng)抑制率。
空白組扭體次數(shù)-給藥組扭體次數(shù) 抑制傘=-棚扭體次數(shù)-Xl00%從實施例I.、2. 、3.、4.、5.獲得的抗癌止痛肽VKVR或該活性肽的部分片段或該活性肽的衍生物、類似物，在小鼠醋酸扭體模型，注射給予上述樣品，劑量在0. lmg/kg體重至16. Omg/kg#m,小鼠扭體反應(yīng)抑制率在0. 0%至100%。如，從實施例I.獲得的SDS-PAGE單一區(qū)帶的抗癌止痛肽VKVR的ED5tl (半數(shù)有效量)為2. 7mg/kg體重；陽性對照藥-嗎啡的ED5tl (半數(shù)有效量)為I. lmg/kg;抗癌止痛肽VKVR部分片段、衍生物、類似物的ED5tl不高
于3. Omg/kg體重。實施例7:
體內(nèi)鎮(zhèn)痛活性一小鼠熱板法模型
在小鼠熱板法模型，注射給予從實施例I.、2.、3.、4.、5.獲得的抗癌止痛肽VKVR或該活性肽的部分片段或該活性肽的衍生物、類似物樣品，劑量在0. 111^/1^#1至16. Omg/kg小鼠痛閾值(在55°C ±5°C熱板上舔后足所需時間)為正常值(10秒至30秒)至60秒(如果痛閾值超過60秒，小鼠仍不舔后足，則取出小鼠)之間。如，從實施例I.獲得的SDS-PAGE單一區(qū)帶的抗癌止痛肽VKVR，注射給予3. 5mg/kg#m,在5分鐘、15分鐘、25分鐘、35分鐘、45分鐘、60分鐘、90分鐘的痛閾提高率，分別為160%、244. 8%(痛閾值超過60秒)、244. 8% (痛閾值超過60秒)、216%、108%、44%、15% ;而注射給予10. 011^/1^_嗎啡的痛閾提高率，則分別為2%、80%、160%、75%、19%、4%、4% ;抗癌止痛肽VKVR部分片段、衍生物、類似物(3. 5mg/kg體重)，在5分鐘、15分鐘、25分鐘、35分鐘、45分鐘、60分鐘、90分鐘的痛閾提高率，均分別不低于140%、244. 8% (痛閾值超過60秒)、244. 8% (痛閾值超過60秒)、200%、90%、30%、10%。實施例8
體內(nèi)抗腫瘤活性一小鼠S18tl肉瘤的實體型腫瘤模型
在小鼠試驗?zāi)[瘤模型(S18tl肉瘤的實體型腫瘤)，從實施例I.、2.、3.、4.、5.獲得的抗癌止痛肽VKVR或該活性肽的部分片段或該活性肽的衍生物、類似物樣品均具有抗腫瘤活性。注射給予0. lmg/kg^^g 10. Omg/kg連續(xù)給樣七天，其S18tl肉瘤實體型腫瘤的瘤重抑制率〔(C-T)/C;C:對照組平均瘤重，T:樣品組平均瘤重〕為0%至72%。如，從實施例I.獲得的SDS-PAGE單一區(qū)帶的抗癌止痛肽VKVR，劑量為4. 4 mg/kg#m,其瘤重抑制率為46%;而陽性對照藥-環(huán)磷酰胺，劑量為60.0 mg/kg其瘤重抑制率為50%。
實施例9
體內(nèi)抗腫瘤活性一小鼠S18tl肉瘤的艾氏腹水型腫瘤模型
在小鼠試驗?zāi)[瘤模型(S18tl肉瘤的艾氏腹水型腫瘤)，從實施例I.、2.、3.、4.、5.獲得的抗癌止痛肽VKVR或該活性肽的部分片段或該活性肽的衍生物、類似物樣品均具有抗腫 瘤活性。注射給予0. lmg/kg^^g 10. Omg/kg^^,連續(xù)給樣十天，在艾氏腹水型腫瘤模型的生命延長率為0%至39%。如，從實施例2.獲得的SDS-PAGE單一區(qū)帶的抗癌止痛肽VKVR，劑量為4.4 mg/kg#i，其生命延長率分別為20%;而陽性對照藥-環(huán)磷酰胺，劑量為60.0mg/kg 其生命延長率為17%。
權(quán)利要求
1.抗癌止痛肽VKVR，其特征在于，它是從蝎毒或蝎尾或全蝎提取、分離、純化獲得的，其結(jié)構(gòu)特征為VKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGRCNG。
2..如權(quán)利要求I所述的抗癌止痛肽VKVR的制備方法，其特征在于，它包括(I)蝎毒或蝎尾或全蝎用蒸餾水或酸性溶液或堿性溶液溶解提取，離心除去雜質(zhì)得到抽提液，(2)抽提液經(jīng)疏水層析柱分離得到抗癌止痛活性組分，(3)得到抗癌止痛活性組分經(jīng)超濾以去除鹽和雜蛋白，同時進行濃縮，通過離子交換層析柱分離得到抗癌止痛活性組分，(4)經(jīng)疏水層析柱進ー步分離得到抗癌止痛活性組分，(5)經(jīng)超濾以去除鹽和濃縮，通過離子交換層析柱純化得到抗癌止痛活性組分，(6)經(jīng)凝膠過濾層析柱進一步純化得到抗癌止痛活性組分，(7)經(jīng)反向?qū)游鲋玫礁呒兌鹊目拱┲雇措腣KVR。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的抗癌止痛肽VKVR，其特征在于，所述的分離和純化包括蝎毒或蝎尾或全蝎用蒸餾水或酸性溶液或堿性溶液溶解提取并經(jīng)離心除去雜質(zhì)得到的抽提液，該抽提液可以通過疏水層析柱、離子交換層析柱、凝膠過濾層析柱的不同組合以及經(jīng)超濾去除鹽、雜蛋白和濃縮得到抗癌止痛肽VKVR。
4.權(quán)利要求I所述的抗癌止痛肽VKVR的衍生物或類似物或活性片段，其特征在干，它包含權(quán)利要求I所述的氨基酸序列全序或片段。
5.如權(quán)利要求4所述的抗癌止痛肽VKVR的衍生物或類似物或活性片段，其特征在干，包括如下抗癌止痛肽VKVR的衍生物或類似物或活性片段MVKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGRCNG ；VKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGRCNGG ；MVKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGRCNGG ； (SGGGG)n VKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKN GAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVP I RVPGRCNG (n可以是 I 或2 或 3 或4或 5); (SGGGG)n VKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKN GAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVP I RVPGRCNGG (n可以是 I 或2或3或4或5); M (SGGGG)n VKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKN GAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVP I RVPGRCNG (n可以是 I 或2 或 3 或4或 5); M (SGGGG)n VKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKN GAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVP I RVPGRCNGG (n可以是 I 或2或3或4或5)。
6.如權(quán)利要求4或5所述的抗癌止痛肽VKVR及其衍生物或類似物或活性片段，可以利用基因工程技術(shù)進行表達獲得，其特征在于，表達宿主細胞為原核細胞或真核細胞。
7.如權(quán)利要求6所述的抗癌止痛肽VKVR及其衍生物或類似物或活性片段基因工程表達后的分離純化方法，其特征在于，它包括(I)表達的基因工程菌體經(jīng)破碎后，離心除去不溶物獲得的上清液；或基因工程菌分泌表達后離心除去不溶物獲得的上清液(2)上清液經(jīng)疏水層析柱分離得到抗癌止痛活性組分，(3)得到抗癌止痛活性組分經(jīng)超濾以去除鹽和雜蛋白，同時進行濃縮，通過離子交換層析柱分離得到抗癌止痛活性組分，(4)經(jīng)疏水層析柱進ー步分離得到抗癌止痛活性組分，(5)經(jīng)超濾以去除鹽和濃縮，通過離子交換層析柱純化得到抗癌止痛活性組分，(6)經(jīng)凝膠過濾層析柱進一步純化得到抗癌止痛活性組分，(7)經(jīng)反向?qū)游鲋玫礁呒兌鹊目拱┲雇措腣KVR。
8.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的抗癌止痛肽VKVR及其衍生物或類似物或活性片段，可以利用化學(xué)合成技術(shù)獲得，其特征在于，化學(xué)合成為人工合成或合成儀合成。
9.抗癌止痛肽VKVR及其衍生物或類似物或活性片段在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述的抗癌止痛肽VKVR及其衍生物或類似物或活性片段可以與藥學(xué)上可接受的載體混合制備臨床上可接受的注射劑、ロ服制齊U、透皮吸收制劑、粘膜吸收制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及從天然材料提取、分離、純化獲得的抗癌止痛肽VKVR及其制備方法、利用基因工程技術(shù)獲得抗癌止痛肽VKVR方法、抗癌止痛肽VKVR衍生物、類似物、活性片段的結(jié)構(gòu)及其制備方法和抗癌止痛肽VKVR及其衍生物、類似物、活性片段作為鎮(zhèn)痛和抗癌藥物在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。所述的抗癌止痛肽VKVR及其衍生物或類似物或活性片段可以與藥學(xué)上可接受的載體混合制備臨床上可接受的注射劑、口服制劑、透皮吸收制劑、粘膜吸收制劑。本發(fā)明所述的抗癌止痛肽VKVR及其衍生物、類似物、活性片段具有較好的鎮(zhèn)痛和抗腫瘤活性，其獲得方法常規(guī)、簡單、產(chǎn)量高。
文檔編號C07K1/34GK102690342SQ20111006900
公開日2012年9月26日 申請日期2011年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月22日
發(fā)明者劉巖峰, 吳春福, 崔勇, 張景海 申請人:沈陽藥科大學(xué)