專利名稱：抗癌免疫療法的應激蛋白-肽復合物的制作方法
技術領域：
本申請總體上涉及癌癥治療領域，具體地說，涉及人癌的免疫療法。
背景技術：
人們已經發(fā)現(xiàn)，預先免疫近交繁殖的小鼠和大鼠，可以抵抗由同一遺傳背景的小鼠和大鼠而來的腫瘤。(Gross(1943)癌癥研究3323-326；Prehn等(1957)國家癌癥學會雜志18769-778；Klein等(1960)癌癥研究201561-1572；Old等(1962)紐約科學院年刊10180-106；綜述見Srivastava等(1988)現(xiàn)代免疫學978-83)。這些研究不僅指出接種沒有活性的癌細胞的小鼠可以對后續(xù)的活性癌細胞的攻擊產生免疫力，并且表明腫瘤特異性抗原的存在。
進一步的研究揭示了這種預防性誘導免疫力的現(xiàn)象具有腫瘤特異性。盡管小鼠能對用來免疫它們的瘤細胞產生特異的免疫力，它們對于其它無關的腫瘤的攻擊仍然敏感。(Basombrio(1970)癌癥研究302458-2462，Globerson等(1964)國家癌癥學會雜志321229-1243)。癌細胞免疫原性的證實引起了對能夠引發(fā)對腫瘤攻擊產生抗性的癌源分子的研究。一般的途徑是分級分離癌細胞來源的蛋白，然后分別檢測它們使小鼠對該級分由之制備的癌產生免疫的能力(Srivastava(1988)同上；Old(1981)癌癥研究41361-375)。利用這種方法已鑒定出一些蛋白，但是，這些蛋白中大部分與一類被稱作應激誘導蛋白或應激蛋白的蛋白相關(Lindquist等(1988)遺傳學綜述年刊22631-677)。由于應激蛋白在性質上是最高度保守和最豐富的蛋白之一，因此，看來它們并不是腫瘤特異性抗原的候選物。隨后發(fā)現(xiàn)應激蛋白以非共價形式與多種肽類結合，形成應激蛋白--肽復合物。(Gething等(1992)自然35533-45；Lindquist等(1988)同上；Young(1990)免疫學綜述年刊8401-420；Flynn等(1991)自然353726-730)。
研究顯示，在用ATP進行處理時應激蛋白--肽復合物會失去其免疫原性。(Udono等(1993)實驗醫(yī)學雜志1781391-1396)。這種處理能把應激蛋白-肽復合物解離成應激蛋白和肽兩部分?？紤]到從正常細胞和腫瘤細胞得到的應激蛋白的結構沒有差別，并且應激蛋白以ATP依賴方式與多種肽類相結合，這種應激蛋白-肽復合物的抗原性似乎并不是應激蛋白本身形成的，而是由與應激蛋白結合的肽形成的。
因此，本發(fā)明的一個目的是為治療性地抑制哺乳動物腫瘤的增殖提供一種新的方法。這里所描述的方法不要求對特異性抗原決定簇進行分離和表征，并且，可以為制備和利用對抑制哺乳動物特異性的預定腫瘤增殖有效的免疫原性組合物提供一種更快的方法。
本發(fā)明的這一目的和其他的目的及特征在下面的說明和權利要求中是顯而易見的。
發(fā)明概述應激蛋白與分離出它們的細胞的抗原性肽相伴隨這一發(fā)現(xiàn)，為容易地分離預選腫瘤的抗原性肽提供了一種方法。一旦分離完畢，這種應激蛋白-肽復合物又被回輸給分離出它的動物，以引發(fā)對原有腫瘤的免疫應答。因此，這種方法不必對腫瘤特異性抗原進行分離和表征，可以使技術人員容易地制備出對抗預選腫瘤的有效的免疫原性組合物。
廣義地講，本發(fā)明為抑制哺乳動物中預選腫瘤的增殖提供了一種方法。這種方法包括給治療中的哺乳動物施用一種組合物，該組合物包含與應激蛋白-肽復合物聯(lián)合應用的藥用載體。這種復合物是從預先從哺乳動物切下的腫瘤細胞中得到的，其特征為可以有效地啟動哺乳動物對分離出該復合物的腫瘤細胞的免疫應答。隨后將這種復合物以足夠的數(shù)量回輸給哺乳動物，以引發(fā)哺乳動物對腫瘤細胞的免疫應答，由此，可以抑制哺乳動物中任何仍然殘存的腫瘤細胞的增殖。
預計這種方法可以和其它常規(guī)的癌癥治療方法(包括，例如，外科手術、放療、化療)聯(lián)合應用。例如，技術人員可以在手術切除癌組織之后，用本文描述的方法，從切除的組織中分離應激蛋白-肽復合物并把這種復合物回輸給哺乳動物。這種復合物可隨后誘導機體對在外科手術中沒有被切除的仍然存在的腫瘤細胞產生特異性免疫應答。當原發(fā)腫瘤轉移到身體的不同部位時，這種方法對癌癥治療是適合的。
本文所用的術語“腫瘤”，可以理解為細胞的任何一種異?；虿豢煽刂频纳L，這種生長可導致對正常組織的侵害?？梢灶A計這一術語也包括已轉移了的異常生長或生長失控的細胞，即已經從身體原發(fā)部位(即原發(fā)腫瘤)擴散到空間上與原發(fā)部位不同的繼發(fā)部位的異常細胞。
本文所用的術語“應激蛋白”，可以理解為任何一種滿足下列條件的細胞蛋白當細胞受到應激性刺激時，它在細胞內的濃度升高，它能夠結合其它的蛋白或肽，在ATP存在或pH值低的情況下能夠釋放結合的蛋白或肽。應激性刺激包括但不僅限于熱休克、營養(yǎng)缺乏、代謝紊亂、氧基和細胞內病原體的感染。
第一種要鑒定的應激蛋白是熱休克蛋白(Hsp)。正如它的名字所暗示的，Hsp典型地是由對熱休克產生應答的細胞誘導產生的。目前已經鑒定出的哺乳動物三個主要Hsp家族，包括Hsp60、Hsp70和Hsp90。數(shù)字反映了應激蛋白以千道爾頓為單位的近似分子量。每個家族的成員都高度保守，見例如，Bardwell等(1984)美國國家科學院院刊81848-852；Hickey等，(1989)分子細胞生物學92615-2626；Jindal(1989)分子細胞生物學92279-2283，其公開內容在此引入作為參考。到目前為止，鑒定出的哺乳動物Hsp90家族成員包括胞液Hsp90(亦稱作Hsp83)和內質網對應物Hsp90(亦稱作Hsp83)、Hsp87、Grp94(亦稱作ERp99)和gp96。見例如(Gething等(1992)自然35533-45，其公開內容在此引入作為參考。到目前為止，鑒定出的Hsp70家族成員包括胞液Hsp70(亦稱作p73)和Hsc70(亦稱作p72)；內質網對應物Bip(亦稱作Grp78)；線粒體對應物Hsp70(亦稱作Grp75)，Gething等(1992)同上。到目前為止，哺乳動物Hsp60的家族成員僅僅在線粒體中鑒定出。Getnhing等(1992)同上。
此外，已經發(fā)現(xiàn)Hsp60、Hsp70和Hsp90家族由在氨基酸序列上與應激蛋白相關(例如有大于35％的氨基酸序列一致)的蛋白組成，但是他們的表達水平并不因應激性刺激而改變。因此，可以預計在這里所用的應激蛋白的定義，包括其他蛋白，其突變蛋白，類似物和變異體，與這三個家族的成員最少具有35％-55％，優(yōu)選55％-75％，最優(yōu)選75％-85％的氨基酸序列一致性，這三個家族的成員在細胞內的表達水平在對應激性刺激應答時受到激發(fā)。
這里所用的術語“肽”，可理解為任何一種從哺乳動物腫瘤細胞分離到的以應激蛋白-肽復合物形式存在的氨基酸序列。
這里所用的術語“免疫原性應激蛋白-肽復合物”，可以理解為任何一種能夠從哺乳動物腫瘤細胞分離并且包含與肽非共價結合的應激蛋白的復合物。這種復合物又以有效地引發(fā)哺乳動物對分離出它的腫瘤細胞的免疫應答為特征。
這里所用的術語“免疫應答”，可以理解為哺乳動物在抗原刺激下產生的任何一種目的為從哺乳動物中清除抗原的細胞過程。這種免疫應答典型地由一種或多種性質上屬于淋巴細胞和/或吞噬細胞的細胞群所介導。
在本發(fā)明更特殊的方面中，應激蛋白-肽復合物中的應激蛋白選自Hsp70、Hsp90和gp96。包含有Hsp70-肽、Hsp90-肽和gp96-肽復合物的應激蛋白-肽復合物可同時從一批由哺乳動物切割而來的腫瘤細胞中分離得到?？梢灶A計，在免疫治療的過程中可把一種或多種前面提到的復合物施用給哺乳動物，以刺激機體對腫瘤產生最合適的免疫應答。
預計，本文所描述的方法對人癌的治療特別有效。但是，可以預計，本文所描述的方法也對其它哺乳動物癌癥的免疫療法有效，這些動物例如農場動物(即牛、馬、山羊、綿羊和豬)和家庭寵物(即貓和狗)。
在本發(fā)明的另一方面中，預計免疫應答受T細胞級聯(lián)方式的影響，更具體地說，是受細胞毒T細胞級聯(lián)方式的影響。這里所用的術語“細胞毒T細胞”，可理解為任何一種表達細胞表面糖蛋白標志CD8的T淋巴細胞，這種淋巴細胞能靶向和裂解細胞表面帶有I型組織相容性復合物的被細胞內病原體感染的靶細胞。
在本發(fā)明的另一方面中，這種應激蛋白-肽復合物可以和一些治療有效量的細胞因子聯(lián)合施用給哺乳動物。這里所用的術語“細胞因子”指任何一種影響其它介導免疫應答細胞的功能的分泌型多聚肽。因此，可以預計這種復合物可以和細胞因子一起施用以增強針對腫瘤的免疫應答。優(yōu)選的細胞因子包括，但不僅限于，白細胞介素-1α(IL-1α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-3(IL-3)、白細胞介素-4(IL-4)、白細胞介素-5(IL-5)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-7(IL-7)、白細胞介素-8(IL-8)、白細胞介素-9(IL-9)、白細胞介素-10(IL-10)、白細胞介素-11(IL-11)、白細胞介素-12(IL-12)、干擾素α(IFN-α)、干擾素β(IFN-β)、干擾素γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(TNFα)、腫瘤壞死因子β(TNFβ)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、和轉化生長因子β(TGF-β)。
該復合物可利用本領域眾所周知的技術與常規(guī)的藥用載體、佐劑或賦形劑相結合。應激蛋白-肽復合物家族必要的施用劑量和方式依賴于不同的因素，比如生理條件下復合物的穩(wěn)定性、復合物在誘導免疫應答時的有效性、腫瘤的大小及分布、受治療哺乳動物的年齡、性別和重量。
典型地，施用該復合物的量應該足以誘發(fā)哺乳動物對分離出該復合物的腫瘤產生免疫應答和抑制腫瘤細胞的增殖。應激蛋白-肽復合物的施用量的范圍優(yōu)選的是1-1000微克復合體/公斤哺乳動物體重/次施用，最優(yōu)選的是大約100-250微克復合體/公斤哺乳動物體重/次施用。預計一個大約75公斤體重的人的典型劑量范圍是大約5-20mg。此外，預計通過反復向個體施用這種復合物可以提高機體的免疫應答強度。哺乳動物優(yōu)選地至少每隔一周接受兩劑應激蛋白-肽復合物。如果必要的話，可通過稍后施用這種復合物而在較晚的時間增強免疫應答。預計，本領域的技術人員通過常規(guī)的實驗可找到最適的劑量和免疫方案。
發(fā)明詳述本發(fā)明基于如下觀察，即應激蛋白-肽復合物與分離出它們的細胞的抗原性肽相伴隨。常規(guī)的癌癥治療基于對腫瘤特異性抗原進行分離、表征，然后以此抗原作為特定治療方案的目標。由于哺乳動物癌癥的抗原差異性，所以，對每種特定腫瘤的特定腫瘤抗原進行分離和表征是不現(xiàn)實的。本發(fā)明避免了對每種被治療的腫瘤的腫瘤特異性抗原進行分離和表征，為癌癥的免疫治療提供了另外一種途徑。
本發(fā)明為抑制哺乳動物預選腫瘤的增殖提供了一種方法。這種方法包括從接受治療的哺乳動物分離或獲得腫瘤細胞?？赏ㄟ^采用本領域熟知的外科手術方法容易地完成。典型地，腫瘤細胞可從進行常規(guī)腫瘤外科切除的哺乳動物中獲得。此方法隨后涉及包括從切除的腫瘤細胞中分離應激蛋白-肽復合物。這可以利用下面詳細描述的任何一種分離方案完成。這種應激蛋白-肽復合物的特征在于，當它們又回輸給哺乳動物時，能起始機體對分離出它們的同一類型腫瘤細胞產生特異性免疫應答。最后，這種方法包括把應激蛋白-肽復合物回輸給哺乳動物，所用的量足以在哺乳動物中誘發(fā)機體對腫瘤細胞產生免疫應答，由此抑制哺乳動物中殘存的任何腫瘤細胞的增殖。
預計這種方法可以和一種或多種常規(guī)的癌癥治療方法(包括例如外科手術、放療和化療)聯(lián)合應用。例如，技術人員可用這里所描述的方法在腫瘤組織切除以后，從中分離應激蛋白-肽復合物，并把它回輸給該哺乳動物。于是，該復合物可誘導哺乳動物對手術中沒有去除的腫瘤細胞產生特異性免疫應答。另外，本文所描述的方法為原發(fā)腫瘤已轉移到機體多個部位時的癌癥治療提供了一種新的方法。例如，在癌癥已轉移，不能實行外科手術的情況下，可單獨應用這種應激蛋白-肽復合物或與另一種癌癥治療中標準的化療藥劑聯(lián)合應用。
預計，本發(fā)明在人癌的免疫治療方面有特別的應用，但是，這里所描述的方法也適于例如農場動物(即牛、馬、綿羊、山羊和豬)和家庭寵物(即貓和狗)的癌癥治療中。
本方法相對于常規(guī)方法的主要優(yōu)點在于不必對每一種腫瘤的腫瘤特異性抗原進行分離、表征。一旦分離出應激蛋白-肽復合物，就可不用進一步表征、而簡單地回輸給哺乳動物。由于分離免疫原性復合物的方法是本領域常規(guī)而已知的，所以技術人員可快速地、常規(guī)地為每個接受治療的個體制備出“定做的”特異免疫原性組合物。
這種方法優(yōu)于常規(guī)方法的另一優(yōu)點在于把這種純化的應激蛋白-肽復合物回輸給分離出它們的個體，可以消除給治療中的哺乳動物注射潛在轉化劑(即轉化DNA)和/或免疫抑制劑的危險，當復合物存在于生化性質尚未明確的腫瘤或腫瘤提取物中時，它們的應用就會成為問題。此外，應激蛋白-肽復合物在無佐劑時就可誘導明顯的腫瘤免疫。因此，盡管佐劑能進一步提高復合物的免疫治療特性，但是它們的存在在誘導明顯的免疫應答時并不是先決條件。
預計，這種方法可用于不同腫瘤的治療，例如，間質組織來源的腫瘤(肉瘤)即，纖維肉瘤；黏液肉瘤；脂肪肉瘤；軟骨肉瘤；成骨肉瘤；血管肉瘤；內皮肉瘤；淋巴管肉瘤；滑膜肉瘤；間皮肉瘤；Ewing’s瘤；骨髓白血??；單核細胞白血病；惡性淋巴瘤；淋巴細胞白血病；漿細胞瘤；平滑肌肉瘤和橫紋肌肉瘤。
此外，預計這種方法可用于上皮組織來源的腫瘤(癌)的治療即，鱗狀細胞或表皮癌；基細胞癌；汗腺癌；皮脂腺癌；腺癌；乳狀癌；乳腺癌；囊腺癌；骨髓癌；未分化癌(單成份癌)；支氣管癌；鰓裂癌；黑色素癌；腎細胞癌；肝細胞癌；膽管癌；乳頭狀癌；過渡型細胞癌；鱗狀細胞癌；絨毛膜癌；精原細胞瘤；胚胎癌；惡性畸胎瘤和畸胎癌。下面將詳細論述制備這種有效地誘導對這些腫瘤產生免疫應答的組合物的一般方法。
盡管不希望被理論所束縛，預計這種應激蛋白-肽復合物通過T細胞級聯(lián)刺激機體對分離出它們的腫瘤細胞產生免疫應答。先前的實驗證明，用始發(fā)于同系大鼠或小鼠的腫瘤分離出的應激蛋白-肽復合物預先免疫小鼠，小鼠可針對分離出這種復合物的腫瘤產生免疫性抵抗。但是，不能針對抗原性不同的腫瘤產生免疫力。而且，從正常組織中分離到的應激蛋白-肽復合物不能誘導小鼠對任何受試腫瘤的抵抗。見例如，Srivastava等(1984)國際癌癥雜志33417；Srivastava等(1986)美國國家科學院院刊833407；Palladino等(1987)癌癥研究475074；Feldweg等(1993)細胞生化雜志.增刊17D108(摘要)；Udono(1993)細胞生化雜志.增刊17D113；Udono(1993)實驗醫(yī)學雜志1781391-1396。這些內容在此引入作為參考。最近已經確定預防免疫以T細胞級聯(lián)方式被介導，更具體地說，由細胞毒T細胞級聯(lián)介導。見例如，Blachere等(1993)免疫療法雜志14352-356，這些內容在此引入作為參考。由此，可預計應激蛋白-肽復合物也許由同樣的機制介導它們有效的治療作用；具體地說，通過細胞毒T細胞級聯(lián)。
預計，這種應激蛋白-肽復合物典型地可以從治療中哺乳動物切除的腫瘤組織中直接分離。但是，在某些情況下，用于分離復合物的腫瘤組織的數(shù)量有限，因此，預計在分離應激蛋白-肽復合物之前，可通過運用本領域眾所周知的技術使切除的腫瘤組織增殖。例如，切除的腫瘤組織可在體內增殖，例如，將腫瘤組織的標本轉染給裸鼠，或在體外，例如可對培養(yǎng)中的腫瘤組織進行連續(xù)傳代，隨后，可收獲這些增殖的瘤組織，并作為分離應激蛋白-肽復合物的初始物。
在本發(fā)明實踐中有效的應激蛋白可定義為任何一種滿足下列條件的細胞蛋白當細胞受到應激性刺激時，該蛋白的細胞內的濃度升高；可以結合其它的蛋白或肽；在ATP存在或pH值低時，可釋放結合的蛋白或肽。
第一種要鑒定的應激蛋白為Hsp，這是在對熱休克產生應答的細胞內合成的。目前為止，已鑒定出哺乳動物Hsp的三個主要家族，包括Hsp60、Hsp70和Hsp90，這里的數(shù)字反映了應激蛋白以千道爾頓為單位的分子量。以后又發(fā)現(xiàn)在對其它應激性刺激，包括但不僅限于，營養(yǎng)缺乏、代謝紊亂、氧基和細胞內病原體的感染等產生應答時也可誘導出這些家族的許多成員。見例如Welch(1993年5月)科學美國人56-64；Young(1990)同上；Craig(1993)科學2601902-1903；Gething等，同上；Lindquist等(1988)同上，這些內容在此引入作為參考。預計，所有屬于這三個家族的哺乳動物應激蛋白在本發(fā)明的實踐中是有效的。
主要的應激蛋白在應激的細胞中積累到非常高的水平，在沒有受到應激的細胞里則低到中等水平。例如，具有高度可誘導性的哺乳動物的Hsp70在常溫下難以檢測，但在受到熱休克的細胞中則成為最活躍地合成的蛋白之一。(Welch等(1985)細胞生物雜志1011198-1211)。不同的是，大部分，但不是全部哺乳動物細胞的Hsp90、Hsp60蛋白在常溫下含量豐富，可由熱進一步誘導。(Lai等(1984)分子細胞生物學42802-10；van Bergen en Henegouwen等(1987)，基因進展1525-31)。
到目前為止，已鑒定出的哺乳動物Hsp90家族成員包括胞液中的Hsp90(亦稱作Hsp83)和內質網對應物Hsp90(亦稱作Hsp83)，Hsp87，Grp94(亦稱作ERp99)和gp96(Gething等(1992)同上)。這些內容在此引入作為參考。鑒定出的Hsp70家族成員包括胞液Hsp70(亦稱作p73)和Hsc70(亦稱作p72)；內質網對應物Bip(亦稱作Grp78)；線粒體對應物Hsp70(亦稱作Grp75)，Gething等(1992)同上。目前，哺乳動物Hsp60的家族成員僅僅在線粒體中鑒定出，Gething等(1992)同上。
應激蛋白是現(xiàn)存的最高度保守的蛋白之一。例如，DnaK，E.coli的Hsp70有大約50％的氨基酸序列與真核細胞的Hsp70蛋白一致。(Bardwell等，美國國家科學院院刊(1984)81848-852)。相似地，Hsp60和Hsp90家族均具有高度的家族內保守性(Hickey等(1989)分子細胞生物學92615-2626；Jindal分子細胞生物學92279-2283)。此外，已發(fā)現(xiàn)Hsp60、Hsp70、Hsp90的家族由在序列上與應激蛋白相關的蛋白組成，例如，有大于35％的氨基酸序列一致，但是在應激狀態(tài)下其表達水平并不改變。因此，預計這里所用的應激蛋白的定義包括其它的蛋白，其突變的蛋白、類似物和變異體，這些蛋白的氨基酸序列至少有35％-55％，優(yōu)選55％-75％，最優(yōu)選75％-85％與這三個家族成員的一致，在對應激性刺激應答的過程中，這三個家族成員的細胞內表達水平增高。
本發(fā)明的免疫原性應激蛋白-肽復合物包括任何一種含有以非共價形式結合的應激蛋白和肽的復合物，所述肽能在哺乳動物體內誘導免疫應答。優(yōu)選的復合物包括但不僅限于，Hsp70-肽、Hsp90-肽和gp96-肽復合物。例如，在本發(fā)明的實踐中，可應用哺乳動物的應激蛋白gp96，它是胞液Hsp90的內質網相對物。
以下將詳細論述分離本發(fā)明實踐中所用的應激蛋白-肽復合物的典型方法。
Hsp70-肽復合物的純化以前已經描述過Hsp70-肽復合物的純化方法，見例如，Udono等(1993)同上。
首先，將腫瘤細胞懸浮在3體積的由5mM磷酸鈉緩沖液(PH7)、150mM NaCl，2mM CaCl2，2mM MgCl2和1mM苯甲磺酰氟(PMSF)組成的1×裂解緩沖液中。接著，在冰浴中對細胞團進行超聲處理，直到顯微鏡下檢測99％以上的細胞裂解。作為超聲處理的替代方法，可用機械剪切對細胞進行裂解，在這種方法中，細胞常重懸于30mM碳酸氫鈉pH7.5、1mM PMSF的溶液中，冰浴中培養(yǎng)20分鐘，然后在dounce勻漿器中勻漿，直到95％以上的細胞裂解。
然后，將裂解物離心1000g×10min，以去除未破裂的細胞、核和其它細胞碎片。得到的上清液再離心100,000g×90min，收集上清，與被含有2mM Ca2+和2mM Mg2+的磷酸鹽緩沖液(PBS)平衡過的ConA瓊脂糖混合。當細胞被機械剪切裂解時，可先用等體積的2×裂解緩沖液稀釋，然后再與ConA瓊脂糖混合。上清液可在4℃和ConA瓊脂糖混合2-3h，收集未結合的物質，用10mM Tris乙酸鹽pH7.5、0.1mM EDTA、10mM NaCl、1mM PMSF透析36小時(三次，每次100體積)。然后，將透析液離心17000rpm×20min(Sorvall SS34轉頭)。所得的上清液被收集，上Mono Q FPLC柱，該柱用20mM Tris乙酸鹽pH7.5、20mMNaCl、0.1mM EDTA和15mM 2-巰基乙醇平衡液平衡。接著用20mM-500mM的NaCl梯度進行展開，洗脫級分由十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，使用合適的抗Hsp70抗體，用免疫印跡法進行表征。
合并與抗Hsp70抗體進行強烈免疫反應的級分，用硫酸銨沉淀Hsp70-肽復合物，具體地說，用50％-70％的硫酸銨分離。生成的沉淀通過17000rpm(SS Sorvall轉頭)離心獲得，并用70％的硫酸銨洗滌。溶解洗滌的沉淀物，任何殘存的硫酸銨可通過交聯(lián)葡聚糖RG25(Pharmacia)柱進行凝膠過濾而被清除。
用這種方法能把Hsp70-肽復合物純化得很均一。典型地，從1克細胞或組織能純化到1mg Hsp70-肽復合物。
Hsp90-肽復合物的純化首先，將腫瘤細胞懸浮在3體積的由5mM磷酸鈉緩沖液(PH7)、150mM NaCl、2mM CaCl2、2mM Mgcl2和1mM苯甲磺酰氟(PMSF)組成的1×裂解緩沖液中。接著，在冰浴中對細胞團進行超聲處理，直到顯微鏡下檢測99％以上的細胞裂解。作為超聲處理的替代方法，可用機械剪切對細胞進行裂解，在這種方法中，細胞常重懸于30mM碳酸氫鈉pH7.5、1mM PMSF的溶液中，冰浴中培養(yǎng)20分鐘，然后在dounce勻漿器中勻漿，直到95％以上的細胞裂解。
然后，將裂解物離心1000g×10min，以去除未破裂的細胞、核和其它細胞碎片。得到的上清液再離心100,000g×90min，收集上清，與被1含有2mM Ca2+和2mM Mg2+的磷酸鹽緩沖液(PBS)平衡過的ConA瓊脂糖混合。當細胞被機械剪切裂解時，可先用等體積的2x裂解緩沖液稀釋，然后再與ConA瓊脂糖混合。上清液可在4℃下和ConA瓊脂糖混合2-3小時，收集未結合的物質，用10mM Tris乙酸鹽pH7.5、0.1mMEDTA、10mM NaCl、1mM PMSF透析36小時(三次，每次100體積)。然后，將滲析液離心17000rpm×20min(Sorvall SS34轉頭)。所得的上清液被收集，上Mono Q FPLC柱，該柱用裂解緩沖液平衡。用200mM-600mM的NaCl梯度洗脫蛋白。
洗脫的級分由SDS-PAGE分離，使用象3G3(Affinity Bioreagent)這樣的抗Hsp90抗體，用免疫印跡法對含有Hsp90-肽復合物的級分進行鑒定。用這種方法能把Hsp90-肽復合物純化得很均一。典型地，從1克細胞或組織能純化到150-200μg Hsp90-肽復合物。
gp96-肽復合物的純化首先，將腫瘤細胞懸浮在3體積的由5mM磷酸鈉緩沖液(PH7)、150mM NaCl、2mM CaCl2、2mM MgCl2和1mM苯甲磺酰氟(PMSF)組成的1×裂解緩沖液中。接著，在冰浴中對細胞團進行超聲處理，直到顯微鏡下檢測99％以上的細胞裂解。作為超聲處理的替代方法，可用機械剪切對細胞進行裂解，在這種方法中，細胞常重懸于30mM碳酸氫鈉pH 7.5、1mM PMSF的溶液中，冰浴中培養(yǎng)20分鐘，然后在dounce勻漿器中勻漿，直到95％以上的細胞裂解。
然后，將裂解物離心1000g×10min，以去除未破裂的細胞、核和其它細胞碎片。將得到的上清液再離心100,000g×90min，收集上清，與被含有2mM Ca2+和2mM Mg2+的磷酸鹽緩沖液(PBS)平衡過的ConA瓊脂糖混合。當細胞被機械剪切裂解時，可先用等體積的2x裂解緩沖液稀釋，然后再與ConA瓊脂糖混合。上清液可在4℃下和ConA瓊脂糖混合2-3小時。將漿液上柱，用1×裂解緩沖液洗滌，直到OD280降到基線。用1/2柱床體積的10％α-甲基甘露糖苷(α-MM)洗柱，用薄膜封柱，在37℃溫育15分。接著把柱冷卻到室溫，從柱底移去薄膜，用5倍柱體積的α-MM洗柱。然后分離洗提物，用SDS-PAGE表征。通常，生成的gp96-肽復合物的純度依細胞類型和組織對裂解液的裂解率不同而大約為60％-95％。
如果需要進一步純化，可把樣品加到用含有5mM磷酸鹽的pH7緩沖液平衡的Mono Q FPLC柱。用0-1M的NaCl梯度從柱上洗脫蛋白。gp96級分的洗脫物在400-500mM NaCl之間。
作為可選方案，從100,000g細胞團分離來的gp96級分，可重懸于5體積含有1％脫氧膽酸鈉(無鈣離子和鎂離子)的PBS液中，在冰浴中培養(yǎng)1小時，將所得上清液離心20,000g×30min，收集所得的上清液，在更換幾次的PBS液(無鈣離子和鎂離子)中透析，以洗去去污劑。所得透析液離心100,000g×90min，將上清液進一步純化。然后把鈣和鎂加到上清液，終濃度為2mM。接著把樣品加到用含有5mM磷酸鹽的pH7緩沖液平衡的Mono Q FPLC柱。用0-1M的NaCl梯度從柱上洗脫蛋白。gp96級分的洗脫物在400-550mM NaCl之間。
用這種方法能把gp96-肽復合物純化得很均一。典型地，從1克細胞或組織能純化到10-20μg gp96-肽復合物。
復合物的制劑和施用一旦將應激蛋白-肽復合物從切除的腫瘤中純化出來，它們就可回輸給接受治療的哺乳動物中，以刺激哺乳動物產生對分離出它們的腫瘤細胞的免疫應答。通過與生理可接受載體、賦形劑和穩(wěn)定劑混合可對本發(fā)明的應激蛋白-肽復合物進行儲存或準備施用。這些物質在所用劑量和濃度范圍內應對接受者無毒性。
當這種復合物是水溶性時，它可在合適的緩沖液中配制，例如，PBS(5mM磷酸鹽、150mM NaCl，pH7.1)或其它生理可接受溶液?？蛇x地，如果所得復合物在水溶液中的溶解度低，可用象吐溫、聚乙二醇這樣的非離子表面活性劑配制。
口服或胃腸外施用時所用的溶液可通過任何一種藥物學領域熟知的方法制備，例如，在Remington氏藥物科學(Gennaro，A.，ed.)，Mack出版社，1990中所描述的。這些制劑包括，例如，象聚乙二醇這樣的聚亞烷基二醇、植物油、氫化萘等。直接應用的制劑，具體地說，可包括甘油和其它高粘度的組合物。生物相容的，優(yōu)選生物可再吸收的聚合物，包括例如，透明質酸、膠原、磷酸三鈣、聚丁酸酯、聚交酯、聚乙交酯和交酯/乙交酯的共聚物，它們也許是有效控制應激蛋白-肽復合物在體內釋放的賦形劑。
用于吸入的制劑可包含賦形劑，例如，乳糖。水溶液可包含，例如，聚氧乙烯-9-十二烷基醚、甘膽酸鹽和脫氧膽酸鹽。油性溶液在滴鼻劑中也許有用。凝膠可以應用于鼻內局部施用。
通過與藥用非毒性賦形劑和載體混合，本發(fā)明提供的復合物可配制成藥物組合物。此外，制劑可優(yōu)選地包含一種或多種佐劑。優(yōu)選的佐劑包括但不限于，環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷的3嵌段共聚物、胞壁酰二肽和它的衍生物、減毒內毒素、皂角苷和它的衍生物如QS-21和脂質體。本發(fā)明進一步設想緩釋劑型，在這種劑型中復合物可在一段延長的時間內釋放。
按照本發(fā)明制備的應激蛋白-肽復合物家族的施用方式必須依賴于生理條件下復合物的穩(wěn)定性和接受治療的哺乳動物中的腫瘤的大小和分布。施用的復合物的優(yōu)選劑量似乎也依賴于腫瘤的大小和分布、接受者的年齡、性別和體重、特定接受者的整體健康狀況、復合物的相對生物效能、復合物的劑型、制劑中賦形劑的存在及其類型和施用的途徑等不同因素。
通常，本發(fā)明的化合物可溶于水性生理緩沖液中，溶液中含有大約0.001-0.1％(w/v)的化合物，用于胃腸外施用。優(yōu)選的劑量范圍是大約1-1000微克復合物/公斤接受者體重/次施用，最優(yōu)選的施用范圍是大約100-250微克復合物/公斤接受者體重/次施用。具體地說，一個大約75公斤體重的人的典型劑量范圍是5-20mg。但是，這些量要依照與復合物一起施用的佐劑而變化。
這種復合物優(yōu)選地包含用標準方法可以施用的部分水溶液，所述方法例如，靜脈內、皮下、肌肉內、眶內、眼內、心室內、顱內、中央囊內、脊柱內、腦池內、腹腔內、口腔、直腸、陰道、鼻內或噴霧施用。水溶液優(yōu)選生理可接受的，這樣除了給哺乳動物輸送所需的復合物之外，溶液不會影響機體的電解質和/或容積的平衡。這樣，復合物的水介質可包括通常的生理鹽水(0.9％NaCl，0.15M)，pH7-7.4或它的其他藥用鹽。
優(yōu)選地，接受者應每隔兩周接種三次疫苗。如果有必要，可通過隨后施用這種復合物在較晚的時間內增強免疫應答。預計，通過本領域熟知的技術可經驗性地為每一種應激蛋白-肽復合物制定出最合適的劑量和接種方案。
不同的細胞因子、抗生素和其它的生物活性劑也可和這種應激蛋白-肽復合物一起施用。例如，各種已知的細胞因子，即，白細胞介素-1α(IL-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-3(IL-3)、白細胞介素-4(IL-4)、白細胞介素-5(IL-5)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-7(IL-7)、白細胞介素-8(IL-8)、白細胞介素-9(IL-9)、白細胞介素-10(IL-10)、白細胞介素-11(IL-11)、白細胞介素-12(IL-12)、干擾素α(IFN-α)、干擾素β(IFN-β)、干擾素γ(IFN-γ)，腫瘤壞死因子α(TNFα)、腫瘤壞死因子β(TNFβ)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)，粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和轉化生長因子β(TGF-β)也可和復合物一起施用，以使生理應答最大化。然而，可以預料，其他的但尚未被發(fā)現(xiàn)的細胞因子對本發(fā)明也可能是有效的。此外，常規(guī)的抗生素也可和這種應激蛋白-肽復合物一起施用。但是，對合適的抗生素的選擇尚依賴于所要治療的疾病。
實施例1在本實施例中，小鼠C57BL/6和C3H的體重大約100克，購自Jackson實驗室，Bar Harbor，Me.。在小鼠皮下注射惡性腫瘤細胞，以誘發(fā)實驗性腫瘤。具體地說，將惡性紡錘形細胞癌6139細胞注射到C3H小鼠的皮下，將小鼠的惡性Lewis肺癌細胞注射到C57BL/6小鼠的皮下，將小鼠的惡性B16黑色素瘤細胞注射到C57BL/6小鼠的皮下。
當腫瘤長到既能看到又能摸到大小的時候，切下腫瘤組織作樣品。作為對照，也從荷瘤小鼠切下非惡性的正常組織。
然后，用以上描述的方法從切除的正常組織和腫瘤組織分離gp96-肽、Hsp90-肽和Hsp70-肽復合物。一旦分離，則把這種復合物和PBS一起回輸給分離出復合物的小鼠中。通常每次實驗檢測6只小鼠。實驗按下述方案進行實驗 回輸給小鼠的組合物1 gp96-肽2 Hsp70-肽3 Hsp90-肽4 gp96-肽和Hsp70-肽5 gp96-肽和Hsp90-肽6 Hsp70-肽和Hsp90-肽7 Hsp70-肽、Hsp90-肽和gp96-肽8 只用緩沖液在一組實驗中復合物從腫瘤細胞分離，而在另一組實驗中復合物從正常細胞分離。用預選的復合物20mg(全重)每隔一周給小鼠接種3次。治療過程中，每天測量每個腫瘤的大小。4周以后處死小鼠，并對腫瘤的生長情況進行組織學檢測。此外，還檢測處死的小鼠有無轉移。
預期的結果是，用從正常組織得到的復合物治療的小鼠的腫瘤繼續(xù)生長并且轉移。相反，用從腫瘤組織得到的復合物治療的小鼠腫瘤比對照動物的腫瘤生長慢，在某些情況下，治療過程中的瘤塊可能變小，腫瘤消退。其它的實施方案本發(fā)明也可在不違背其精神或本質特征的情況下以其它特殊方式實施。因此，本實施方案從所有方面考慮是一種實例性的而不是限制性的，本發(fā)明的范圍由所附的權利要求而不是上述說明書指出，因此權利要求的等價的含義和范圍內的全部改變也將包括在內。
權利要求
1.一種抑制哺乳動物體內腫瘤增殖的方法，該方法包括給荷瘤哺乳動物施用一種組合物，該組合物包含(a)從腫瘤細胞分離出的免疫原性應激蛋白-肽復合物，該復合物可以有效地在哺乳動物體內起始對腫瘤的免疫應答，和(b)藥用載體，所用的量足以在哺乳動物體內引發(fā)對腫瘤的免疫應答，由此抑制腫瘤的增殖。
2.權利要求1的方法，其中復合物中的應激蛋白是Hsp70、Hsp90或gp96。
3.權利要求1的方法，其中復合物中的肽與應激蛋白非共價結合。
4.權利要求1的方法，其中施用復合物起始T細胞介導的免疫應答。
5.權利要求4的方法，其中施用復合物起始細胞毒T細胞介導的免疫應答。
6.權利要求1的方法，其中施用給哺乳動物的復合物的劑量范圍是大約1-1000微克復合物/公斤哺乳動物體重/次施用。
7.權利要求6的方法，其中所說的劑量范圍是大約100-250微克復合物/公斤哺乳動物體重/次施用。
8.權利要求1的方法，其中復合物被重復地施用給哺乳動物。
9.權利要求1的方法，其中組合物與細胞因子一起施用給哺乳動物。
10.一種抑制哺乳動物腫瘤增殖的方法，該方法包括以下步驟(a)提供從哺乳動物切割下來的腫瘤細胞；(b)從細胞中分離一種免疫原性應激蛋白-肽復合物，它可以有效地在哺乳動物中起始對腫瘤細胞的免疫應答；(c)給哺乳動物施用分離的應激蛋白-肽復合物，其用量足以在哺乳動物中引發(fā)對腫瘤細胞的免疫應答，由此抑制哺乳動物中殘存的任何腫瘤細胞的增殖。
11.權利要求10的方法，其中復合物中的應激蛋白是Hsp70、Hsp90或gp96。
12.權利要求10的方法，其中復合物中的肽與應激蛋白非共價結合。
13.權利要求10的方法，其中施用復合物起始T細胞介導的免疫應答。
14.權利要求13的方法，其中施用復合物起始細胞毒T細胞介導的免疫應答。
15.權利要求10的方法，其中施用給哺乳動物的復合物的劑量范圍是大約1-1000微克復合物/公斤哺乳動物體重/次施用。
16.權利要求15的方法，其中所說的劑量范圍是大約100-250微克復合物/公斤哺乳動物體重/次施用。
17.權利要求10的方法，其中復合物被重復施用給哺乳動物。
18.權利要求10的方法，其中復合物與細胞因子一起施用給哺乳動物。
全文摘要
本發(fā)明公開的是一種抑制哺乳動物體內腫瘤增殖的方法。該方法包括以下步驟(a)從預先從哺乳動物中得到的腫瘤細胞中分離應激蛋白-肽復合物，(b)將分離的應激蛋白-肽復合物回輸給哺乳動物，以刺激哺乳動物對分離出該復合物的腫瘤的免疫應答。在本發(fā)明實踐中具有特殊應用的應激蛋白-肽復合物包括Hsp70-肽、Hsp90-肽和gp-96肽復合物。
文檔編號C07K19/00GK1167440SQ95196515
公開日1997年12月10日 申請日期1995年4月6日 優(yōu)先權日1994年9月30日
發(fā)明者P·K·斯里瓦斯塔瓦 申請人:紐約城市大學辛乃山醫(yī)科學校