專利名稱：新型脂酶原-牛胰蛋白酶原融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型脂酶原-牛胰蛋白酶原(PLBTR)融合蛋白、編碼它們的基因、及其產(chǎn)品和應(yīng)用。更具體地，本發(fā)明涉及以最優(yōu)量生產(chǎn)PLBTR融合蛋白的方法，PLBTR融合蛋白包括正常情況下對自催化活性敏感的異源多肽。更具體地，本發(fā)明涉及融合蛋白，其包括異源多肽，例如融合于脂肪酶信號序列的絲氨酸蛋白酶，其可通過重組宿主細胞以期望量表達。本發(fā)明還涉及編碼此類融合蛋白的多核苷酸、涉及用于表達此類融合蛋白的表達載體、 涉及用此類多核苷酸/載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞、以及涉及生成此類融合蛋白的方法。
背景技術(shù)：
胰蛋白酶是一種高價值的蛋白酶，其具有很多工業(yè)和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。持續(xù)增長的對具有特殊性能的非動物源的胰蛋白酶的需求已經(jīng)促進關(guān)注在微生物中克隆和表達蛋白酶。由于與蛋白表達和自催化性能相關(guān)的困難，有關(guān)重組胰蛋白酶表達的報告在成功程度上有很大的差別。巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)似乎是生產(chǎn)胰蛋白酶最具潛力的微生物宿主。
胰蛋白酶是 25kDa的絲氨酸蛋白酶，由胰腺的腺泡細胞以無活性的前體-胰蛋白酶原分泌。激活肽氨基酸DDDDK在成熟胰蛋白酶中出現(xiàn)在胰蛋白酶原前面，其由腸激酶在腸道中切割。激活的胰蛋白酶將在可及精氨酸(R)和賴氨酸(K)氨基酸殘基的羧基端切割蛋白。胰蛋白酶不僅消化包含可及R和K的任何蛋白，而且作用于其自身序列的可及R 和K并降解本身(自催化活性)。因此在微生物或哺乳動物系統(tǒng)中生產(chǎn)重組胰蛋白酶是一個非常大的挑戰(zhàn)。并且表達水平非常低。為克服該問題，本發(fā)明的發(fā)明人已將97個氨基酸的米根霉(Miizopus oryzae)脂肪酶信號序列融合至牛胰蛋白酶原并在巴斯德畢赤酵母中表達。脂酶原序列的存在穩(wěn)定了胰蛋白酶原的表達并且似乎防止了體內(nèi)的活化。
脂酶原作為脂肪酶的N端延伸物，與信號序列不同，信號序列是輸送蛋白進入或穿過細胞膜，或分泌進入細胞外基質(zhì)所必要的。米根霉脂肪酶的69個氨基酸前肽區(qū) (propeptide region)在26-氨基酸信號序列之后。現(xiàn)有研究顯示脂酶原區(qū)中的突變(C56 至 S)減緩脂肪酶的折疊(Beer H. D.，Wohlfahrt G.，Schmid R. D.，McCarthy J. Ε. G.， Biochem. J. 319 :351-359,1996)。用來自于米根霉脂肪酶的脂酶原區(qū)替換天然的牛胰蛋白酶原的前區(qū)(前肽，propeptide)，驚人地促進了重組牛胰蛋白酶原的穩(wěn)定性和產(chǎn)量。
現(xiàn)有的技術(shù)狀態(tài)未能提供一種可接受的令人滿意的/理想的生產(chǎn)方法，能在合適的宿主細胞中表達異源融合多肽的可純化形式。
因此廣泛認為需要一種沒有以上限制的方法，并且有這種方法是非常有利的。
本發(fā)明的改進的新型脂酶原-牛胰蛋白酶原融合蛋白克服了以上討論的和現(xiàn)有技術(shù)中的許多其他缺點和不足。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的
本發(fā)明的主要目的是獲得融合多肽，該融合多肽包括融合于脂肪酶信號序列的至少一種絲氨酸蛋白酶。
本發(fā)明的另一個主要目的是獲得一種表達融合多肽的方法。
本發(fā)明的又一個目的是獲得包括上述序列的載體。
本發(fā)明的再一個目的是獲得轉(zhuǎn)化細胞，該轉(zhuǎn)化細胞包括上述的可表達方式的序列。
本發(fā)明的陳述
因此，本發(fā)明涉及一種融合多肽，包括融合于脂肪酶信號序列的至少一種絲氨酸蛋白酶，所述融合多肽在甲基營養(yǎng)酵母(methyloptropic yeast)中表達，其中所述融合多肽具有與SEQ ID NO :1至少80%同源性的氨基酸序列；融合多肽包括融合于脂肪酶信號序列的至少一種絲氨酸蛋白酶，所述融合多肽在甲基營養(yǎng)酵母中表達，其中所述融合多肽具有與SEQ ID NO 2至少80%同源性的核苷酸序列；一種表達融合多肽的方法，包括由甲基營養(yǎng)酵母生產(chǎn)的融合于脂肪酶信號序列的至少一種絲氨酸蛋白酶，所述融合多肽具有與 SEQ ID No 1表示的核苷酸序列或SEQ ID NO. 2表示的氨基酸序列至少80%同源性的核苷酸序列；一種包括上述序列的載體；以及一種包括上述的可表達形式的序列的轉(zhuǎn)化細胞。


圖1 脂酶原的PCR擴增產(chǎn)物以及牛胰蛋白酶原編碼序列。
圖2 融合的PLBTR擴增的PCR產(chǎn)物。
圖3 通過使用^CbaI和BamHI限制酶切分析來篩選陽性克隆。
圖4 :A、分析從不同克隆獲得的脂酶原牛胰蛋白酶原。
B、使用胰蛋白酶原抗體的SDS PAGE和蛋白印記
C、SDS PAGE 示出活化的 PLBTR
通道1 蛋白分子量標記
通道2:PLBTR 克隆 #1
通道3 =PLBTR 克隆 #2
通道4 =PLBTR 克隆 #3
通道5 =PLBTR 克隆 #4
通道6 =PLBTR 克隆 #5
通道7 =PLBTR 克隆 #6
通道8:GS115 母株
圖5 :pMBL210載體細節(jié)
圖6 :CPLBTR/pMBL210克隆#3的限制性內(nèi)切酶譜。
通道1 :CPLBTR/pMBL210 克隆 #3，具有 EcoRI+XhoI (5400bps+1030bps)
通道2 :CPLBTR/pMBL210 克隆 #3，具有 &icl (線性化、6426bps)
通道M 基因標尺1Kb DNA梯度。
通道3 :CPLBTR/pMBL210 克隆 #3，具有 Ndel+Kpnl (4781bps+1645bps)
通道4 :CPLBTR/pMBL210 克隆 #3，具有 XbaI (5104bps+806bps+516bps)
圖 7 :CPLBTR/pMBL210 載體細節(jié)。
圖8 =PCR確認基因整合入所有的博萊霉素(Zeocin)抗性克隆的基因組。
通道1-16 :9435Zeo25oo 抗性克隆。
通道17 9435宿主(陰性對照)。
通道18 陽性對照(CPLBTR/pMBL210 質(zhì)粒)。
通道M :1Kb DNA 梯度。
通道19-22 :9452Zeo25oo 抗性克隆。
通道23 9452宿主(陰性對照)。
圖9 :A、從多個9450克隆獲得的脂酶原牛胰蛋白酶原的分析。
B、從多個9453克隆獲得的脂酶原牛胰蛋白酶原的分析。
C、使用胰蛋白酶原抗體的SDS PAGE和蛋白印記。
圖9A:通道M=蛋白分子量標記
通道1 = PLBTR 克隆 #1
通道2 = CPLBTR 9450 克隆 #1
通道3 = CPLBTR 9450 克隆 #2
通道4 = CPLBTR 9450 克隆 #3
通道5 = CPLBTR 9450 克隆 #4
通道6 = CPLBTR 9450 克隆 #5
通道7 = CPLBTR 9450 克隆 #6
通道8 = CPLBTR 9450 克隆 #7
通道9 = CPLBTR 9450 克隆 #8
圖9B:通道M=蛋白分子量標記
通道1 = PLBTR 克隆 #1
通道2 = CPLBTR 9453 克隆 #1
通道3 = CPLBTR 9453 克隆 #2
通道4 = CPLBTR 9453 克隆 #3
通道5 = CPLBTR 9453 克隆 #4
通道6 = CPLBTR 9453 克隆 #5
通道7 = CPLBTR 9453 克隆 #6
通道8 = CPLBTR 9453 克隆 #7
通道9 = CPLBTR 9453 克隆 #8
圖9C:通道M 蛋白分子量標記
通道1 標準胰蛋白酶
通道2 宿主對照
通道3 =PLBTR 克隆 #1
通道4 :CPLBTR 9450#1
通道5 CPLBTR 9453#6
圖10 =SDS PAGE上的上清液分析(所有樣本均負載15 μ 1)
圖11 發(fā)酵裝置運行的典型趨勢(T、pH、D0、WCW)
(Τ =溫度、DO =溶解的氧、WCW =細胞濕重)具體實施方式
本發(fā)明涉及一種融合多肽，包括融合于脂肪酶信號序列的至少一種絲氨酸蛋白酶，所述融合多肽在甲基營養(yǎng)酵母中表達，其中所述融合多肽具有與SEQ ID N0:1至少 80%同源性的氨基酸序列。
本發(fā)明涉及一種融合多肽，包括融合于脂肪酶信號序列的至少一種絲氨酸蛋白酶，所述融合多肽在甲基營養(yǎng)酵母中表達，其中所述融合多肽具有與SEQ ID N0:2至少 80%同源性的核苷酸序列。
在本發(fā)明的一個實施例中，SEQ ID 1或2的68和69號的氨基酸被氨基酸精氨酸和賴氨酸替換。
在本發(fā)明的另一個實施例中，68號氨基酸被酪氨酸替換。
在本發(fā)明的又一個實施例中，多肽使得胰島素前體形式或胰島素類似物或胰島素衍生物轉(zhuǎn)化為它們對應(yīng)的活性型，提供至少50%的步驟產(chǎn)率(st印yield)。
在本發(fā)明的另一實施例中，甲基營養(yǎng)酵母屬于畢赤酵母屬(Pichia sp.)。
在本發(fā)明的另一實施例中，甲基營養(yǎng)酵母是巴斯德畢赤酵母。
本發(fā)明涉及一種表達融合多肽的方法，所述融合多肽包括產(chǎn)于甲基營養(yǎng)酵母的融合于脂肪酶信號序列的至少一種絲氨酸蛋白酶，所述融合多肽具有與由SEQ ID NO 1表示的核苷酸序列或由SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列具有至少80%同源性的核苷酸序列。
在本發(fā)明的一個實施例中，絲氨酸蛋白酶是胰蛋白酶原。
在本發(fā)明的另一個實施例中，甲基營養(yǎng)酵母屬于畢赤酵母屬。
在本發(fā)明的又一個實施例中，甲基營養(yǎng)酵母是巴斯德畢赤酵母。
本發(fā)明涉及一種載體，包括上述的序列。
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)化的細胞，包括可表達形式的上述序列。
提供對應(yīng)于新型脂酶原-牛胰蛋白酶原(PLBTR)融合蛋白核酸序列的分離的核酸分子。此外，包含對應(yīng)于多核苷酸的氨基酸序列。具體地，本發(fā)明提供分離的核酸分子，包括編碼以SEQ ID NO :1示出的氨基酸序列的核苷酸序列。還提供了脂酶原-牛胰蛋白酶原， 具有由本文中的核酸分子-SEQ ID NO :2編碼的氨基酸序列。
優(yōu)選融合的胰蛋白酶絲氨酸蛋白酶樣蛋白具有至少一種自然存在的胰蛋白酶絲氨酸蛋白酶樣蛋白所具有的生物活性。
本發(fā)明也包括與序列表中列出的核苷酸和氨基酸序列基本上同源的變異核酸分子和多肽。此外，提供核苷酸和氨基酸序列的片段和基本上同源的片段。
本發(fā)明也提供載體和宿主細胞，用于重組表達本文的核酸分子，以及生產(chǎn)此類載體和宿主細胞的方法，并且使用它們通過重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的多肽或肽。
參考附圖和所附的說明書可更好地理解本發(fā)明的原理和操作。
在詳細說明本發(fā)明的至少一個實施例之前，應(yīng)當理解，本發(fā)明的應(yīng)用并不限于以下說明的或?qū)嵗纠粤谐龅募毠?jié)。本發(fā)明可以有其他實施例或通過不同的方式實施或進行。并且，應(yīng)當理解，本文采用的措辭和術(shù)語僅用于說明的目的而不應(yīng)理解為限制。
現(xiàn)將詳細參考本發(fā)明的優(yōu)選實施例，與以下實例一起，用于說明本發(fā)明的原理。
以下列出的實例是用于幫助理解本發(fā)明，但不旨在，并且不應(yīng)解釋為，以任何方式限制本發(fā)明范圍。實例不包括用于載體的構(gòu)造、編碼多肽的基因插入至此類載體或?qū)⒌玫降馁|(zhì)粒引入至宿主的傳統(tǒng)方法的詳細說明。實例也不包括用于分析由此類宿主載體系統(tǒng)產(chǎn)生的多肽中使用的傳統(tǒng)方法的詳細說明。此類方法已為本技術(shù)領(lǐng)域人員公知并在大量出版物中進行說明，包括以實例的方式。
標準技術(shù)已用于各種重組DNA技術(shù)、轉(zhuǎn)化(例如，電穿孔、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染)和試驗。根據(jù)本領(lǐng)域中公知的傳統(tǒng)方法和本說明書中引用和討論的各種一般和專用參考，常規(guī)進行重組技術(shù)禾口重組實驗。見例如 Sambrook 等人的 Molecular Cloning :A Laboratory Manual (3rd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y(2001)),其通過引證結(jié)合于此。
在本發(fā)明的說明書和權(quán)利要求中，下面術(shù)語將依據(jù)本文的定義使用。
除非本文另有定義，本發(fā)明相關(guān)使用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語應(yīng)具有本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的含義。此外，除上下文另有要求，單數(shù)術(shù)語應(yīng)包括復(fù)數(shù)并且復(fù)數(shù)術(shù)語應(yīng)包括單數(shù)。本發(fā)明的方法和技術(shù)通常根據(jù)本領(lǐng)域公知的傳統(tǒng)方法進行。通常，與本文描述的分子和細胞生物學(xué)、生物化學(xué)、蛋白和核酸化學(xué)和雜交技術(shù)相關(guān)的命名是公知的且在本領(lǐng)域中通用的。本發(fā)明的方法和技術(shù)通常根據(jù)本領(lǐng)域公知的傳統(tǒng)方法進行。
如本文中使用的，術(shù)語“方法”指的是用于完成給定任務(wù)的方式、方法、技術(shù)和程序，包括但不限于化學(xué)、藥理學(xué)、生物學(xué)、生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)從業(yè)人員公知的方式、方法、技術(shù)和程序或由已知的方式、方法、技術(shù)和程序易于得到的方式、方法、技術(shù)和程序。
如本文中使用的，術(shù)語“載體”指的是能輸送與其連接的另一個核酸的核酸分子。 術(shù)語“表達載體”包括能夠合成目標蛋白的質(zhì)粒、粘?；蚴删w，此類蛋白由它們各自的載體攜帶的重組基因編碼。優(yōu)選載體是那些能自我復(fù)制和表達它們所連接的核酸的載體。在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可交換使用，因為質(zhì)粒是最常用的載體形式。此外，本發(fā)明旨在包括此類其他方式的表達載體，其提供等同的功能且在本領(lǐng)域中隨后是已知的。
本文使用的術(shù)語“重組”用于描述一種蛋白或多肽，是指通過重組多核苷酸表達生產(chǎn)的多肽。本文提到細胞時使用的術(shù)語“重組”是指能用作或已被用作重組載體或其他轉(zhuǎn)化DNA的受體，并且包括已轉(zhuǎn)染的原始細胞的后代。應(yīng)當理解，單個親本細胞的后代由于意外或故意的突變可能在形態(tài)或基因上不完全相同或與原始親本不完全DNA互補。與親本足夠相似的親本細胞的后代具有相關(guān)特征，例如出現(xiàn)編碼期望的多肽的核苷酸序列，也被視為后代。
“感興趣基因”(GOI)是期望轉(zhuǎn)錄表達增加的核酸序列。GOI可編碼功能性核酸分子(例如，RNA，如反義RNA分子)或，更典型地，編碼期望產(chǎn)量增加的肽、多肽或蛋白。本發(fā)明的載體可用作表達“異源”蛋白。如本文使用的，術(shù)語“異源”是意核酸序列或多肽，其來源于外來品種，如果來源于同種，其一般是經(jīng)過從原始形態(tài)修飾的。此外，細胞中非正常表達的修飾的或未修飾的核酸序列或多肽被認為是異源的。本發(fā)明的載體可具有一種或多種G0I，在相同或不同的插入位點插入，其中每個GOI可操作地連接于調(diào)整的核酸序列，其允許GOI的表達。
脂酶原作為脂肪酶的N端延伸，與信號序列不同，它是輸送蛋白進入或穿過細胞膜或分泌到細胞外基質(zhì)中所必需的米根霉脂肪酶的69氨基酸前肽區(qū)位于26-氨基酸信號序列之后?，F(xiàn)有研究已示出脂酶原區(qū)中的突變(C56至S)減緩脂肪酶的折疊(Beer H. D.，Wohlfahrt G.，Schmid R, D.，McCarthy J. Ε. G.，Biochem J. 319 :351-359,1996)。用來自于米根霉脂肪酶脂酶原區(qū)替代天然的牛胰蛋白酶原的前區(qū)(proregion)，驚人地提高了重組牛胰蛋白酶原的穩(wěn)定性和產(chǎn)量。
如本文討論的“可操作元件”包括至少一個啟動子、至少一個操作子、至少一個前導(dǎo)序列、至少一個Siine-Dalgamo序列、至少一種終止密碼子、和需要或優(yōu)選用于載體DNA 的適當轉(zhuǎn)錄和隨后翻譯的任何其他DNA序列。尤其是，考慮此類載體可包含至少一個宿主微生物識別的復(fù)制起點，以及至少一個可選標記，和至少一個能啟動DNA序列轉(zhuǎn)錄的啟動子序列。此外，在一個實施例中，優(yōu)選載體包含能發(fā)揮調(diào)控子作用的某些DNA序列、以及能為調(diào)控子蛋白編碼的其他DNA序列。在一個實施例中，此類調(diào)控子用于在某些環(huán)境情況下或在其他環(huán)境情況下防止DNA序列的表達，允許由DNA序列編碼的蛋白的轉(zhuǎn)錄和隨后的表達。
本文使用的“氨基酸”指的是肽或蛋白序列或其部分。術(shù)語“蛋白”、“肽”和“多肽”可替換使用。
本發(fā)明提供新型融合的脂酶原胰蛋白酶絲氨酸蛋白酶分子。“脂酶原胰蛋白酶絲氨酸蛋白酶分子”是指一種稱為PLBTR的新序列、及其變體和片段。這些全長基因或其片段被稱為“PLBTR”序列，表示它們具有與胰蛋白酶絲氨酸蛋白酶基因相似的序列。提供了包括編碼氨基酸序列在SEQ ID NO :2中給出的PLBTR多肽的核苷酸序列的分離的核酸分子， 或其變體或片段。編碼PLBTR多肽的核苷酸序列在SEQ ID N0:1中示出。此類序列是胰蛋白酶絲氨酸蛋白酶家族成員。
為表達本發(fā)明的融合蛋白，核酸可操作地連接至指導(dǎo)基因表達的信號。當位于與另一個核酸序列成功能性關(guān)系時，核酸為“可操作地連接”。例如，如果啟動子或增強子影響序列的轉(zhuǎn)錄，該啟動子或增強子可操作地連接至編碼序列。一般地，“可操作地連接”是指連接的核酸序列是連續(xù)的，并且在需連接兩個蛋白編碼區(qū)域處是連續(xù)的并且在閱讀框中。
一般很希望在選定用于表達的宿主細胞類型中用啟動子和/或增強子有效地指導(dǎo)重組核酸序列的表達。分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常知道啟動子、增強子、以及用于重組多肽表達的細胞類型重組的使用(例如，見Sambrook等人，1989，下文)。在適當?shù)那闆r下，采用的控制序列可以是構(gòu)成的、組織特異性的、可誘導(dǎo)的、和/或有用的，以指導(dǎo)重組核酸序列的高水平表達，例如在重組多肽的大規(guī)模生產(chǎn)中是有利的。
優(yōu)選地，本發(fā)明的融合多肽具有氨基酸序列，其與SEQ ID NO :1或2至少65%相似。更優(yōu)選的，與本發(fā)明載體多肽的氨基酸序列SEQ ID NO :1或2的相似度為約66%，更優(yōu)選67 %，更優(yōu)選68 %，更優(yōu)選69 %，更優(yōu)選70 %，更優(yōu)選71%，更優(yōu)選72 %、更優(yōu)選73 %、 更優(yōu)選74 %、更優(yōu)選75 %、更優(yōu)選76 %、更優(yōu)選77 %、更優(yōu)選78 %、更優(yōu)選79 %、更優(yōu)選 80 %、更優(yōu)選81%、更優(yōu)選82 %、更優(yōu)選83 %、更優(yōu)選84 %、更優(yōu)選85 %、更優(yōu)選86 %、更優(yōu)選87%、更優(yōu)選88%、更優(yōu)選89%、更優(yōu)選90%、更優(yōu)選91%、更優(yōu)選92%、更優(yōu)選93%、更優(yōu)選94 %、更優(yōu)選95 %、更優(yōu)選96 %、更優(yōu)選97 %、更優(yōu)選98 %、更優(yōu)選99 %、并且最優(yōu)選 100%,
更優(yōu)選地，本發(fā)明的融合多肽具有與SEQ ID NO :1或2相同的氨基酸序列。
從原核宿主和真核宿主選擇重組表達系統(tǒng)。真核宿主包括酵母細胞(例如，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris))、哺乳動物細胞或植物細胞。細菌和真核細胞可從許多不同來源獲得，包括于本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的商業(yè)途徑，例如，美國典型培養(yǎng)物保藏所(American Type Culture Collection) (ATCC ； Rockville Md.)。用于重組蛋白表達的細胞的商業(yè)途徑也提供使用這些細胞的說明。表達系統(tǒng)的選擇取決于用于表達多肽的需要的特征。
因此，本發(fā)明的目的是表達系統(tǒng)或表達盒，其在來源于選自由畢赤酵母菌株組成的組中，尤其是選自由巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇畢赤酵母(Pichia methanol!ca)和栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)組成的組中的細胞是有功能的，并且允許編碼其蛋白片段的期望多肽的表達，位于其表達所需的元件控制下。
優(yōu)選用表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞，宿主細胞包括重組多核苷酸，并且其還包括以及至少一種表達控制序列，其可操作地連接于重組多核苷酸并且能夠控制宿主細胞中的重組多核苷酸的表達，從而能夠生產(chǎn)可溶融合蛋白。
本發(fā)明最優(yōu)選的方面，最優(yōu)選的宿主細胞是甲基營養(yǎng)酵母?？墒褂帽景l(fā)明改造的甲基營養(yǎng)酵母菌株包括，但不限于，能在甲醇上生長的酵母菌株，例如畢赤酵母屬、假絲酵母屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、球擬酵母(Torulopsis)。優(yōu)選的甲基營養(yǎng)酵母是畢赤酵母屬。可使用本發(fā)明方法改造的甲基營養(yǎng)酵母菌株也包括那些甲基營養(yǎng)酵母菌株，它們已被設(shè)計成表達感興趣的一種或多種異源蛋白。
如本文中使用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”和“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化”指的是一種細胞，該細胞中已將一種非自身(異源)多核苷酸序列整合入游離質(zhì)粒，而該游離質(zhì)粒保存至少兩代。
如本文中使用的，“重組”包括是指一種細胞或載體，其已通過引入異源核酸序列被改造或該細胞源于經(jīng)如此改造的細胞。
載體可轉(zhuǎn)化到宿主細胞中，使用的方式包括，但不限于，電穿孔、病毒感染、磷酸鈣沉淀、二乙氨基乙基葡聚糖(DEAE-葡聚糖)、直接顯微注射、負載DNA的脂質(zhì)體和 lipofectamine-DNA復(fù)合物、細胞聲波降解法、使用高速微粒的基因轟擊或本文中描述的或本領(lǐng)域中公知的任何其他方式。該載體還可包括DNA序列編碼功能以利于基因表達，通常為啟動子、轉(zhuǎn)錄起始位點、轉(zhuǎn)錄終止和多腺苷酸化功能。
本發(fā)明也涉及一種生產(chǎn)期望蛋白的方法，包括發(fā)酵，在一定情況下并且在適合于生產(chǎn)此類蛋白化合物或其類似物，在諸如畢赤酵母屬的有機物中，其中也包含編碼足以指導(dǎo)生產(chǎn)期望的終端產(chǎn)物的多肽的基因。
根據(jù)另一個方面，本發(fā)明涉及重組生產(chǎn)牛胰蛋白酶的方法，所述方法包括
(a)用重組DNA載體轉(zhuǎn)化宿主，其包括融合于編碼脂酶原的核苷酸序列的編碼牛胰蛋白酶原或其衍生物的DNA序列。
(b)在合適的培養(yǎng)基中，在有利于牛胰蛋白酶原表達并分泌到培養(yǎng)基中的情況下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主，以及
(c)從培養(yǎng)基中回收牛胰蛋白酶原或胰蛋白酶或其衍生物。
對本領(lǐng)域技術(shù)人員，本發(fā)明的其他目的、優(yōu)點、和新型特征將通過對以下實例的解釋變得顯而易見，實例不是限制的目的。此外，如以上描述和如權(quán)利要求部分中要求的本發(fā)明的各種實施例和各個方面在以下實例中找到實驗支持。
參考以下實例更充分說明并理解本發(fā)明，以下實例以說明的方式給出并且不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
一個本領(lǐng)域的技術(shù)人員將擁有必要的專門知識獲取或利用合適表達的載體，用于生產(chǎn)本發(fā)明的可溶融合蛋白，取決于應(yīng)用和目的。以下提供關(guān)于獲取和利用表達載體的相關(guān)通常指導(dǎo)，其可用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞從而使宿主細胞表達重組多肽。更優(yōu)選地，根據(jù)以下實例部分提供的指導(dǎo)原則來獲取和利用本發(fā)明的表達載體。如以下實例部分的實例說明和示出，本發(fā)明的融合蛋白可由本發(fā)明的宿主細胞適當?shù)乇磉_，宿主細胞由表達載體轉(zhuǎn)化。
因而，本發(fā)明還提供用重組多肽和/或表達載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的宿主細胞。根據(jù)應(yīng)用和目的，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可按各種方式常規(guī)地實踐獲得表達載體。
進一步借助于以下實例和圖說明本發(fā)明。然而，這些實例不應(yīng)解釋為對本發(fā)明范圍的限制。
實例1
脂酶原-牛胰蛋白酶原融合蛋白的核苷酸序列在SEQ ID 1中示出并且對應(yīng)的氨基酸序列在SEQ ID 2中示出。
從米根霉脂肪酶/pPIC9K載體擴增脂酶原基因片段，使用的是高保真度PWO聚合酶和以下引物
PR0RHILIPFP2 = 5，CTC GAG AAA AGA GAG GCT GAA GCT GTTCCT GTT TCT GGT AM TC3'
PLBTRRP = 5，TTG TCA TCG TCA TCG GCG CTG TTG GTA GATCCA GA 3’
從牛胰蛋白酶原/TA載體擴增牛胰蛋白酶原基因，使用的是高保真度PWO聚合酶和以下引物對該牛胰蛋白酶原基因進行密碼子優(yōu)化，使用的是用于密碼子優(yōu)化的基于軟件的 Entechelon 網(wǎng)。
PLBTRFP = 5，CTA CCA ACA GCG CCG ATG ACG ATG ACA AGATTG TCG GA 3'
BTRPRP1 = 5’ GCG GCC GCT TAG TTA GAC GCA ATT GTT TGCTTG 3’
使用Qiagen公司的凝膠提取試劑盒純化這些產(chǎn)品。這些純化產(chǎn)品每個2 μ 1用作模板。使用以下引物進行重疊延伸PCR(overlapping PCR)，以融合脂酶原和牛胰蛋白酶原閱讀框內(nèi)編碼序列。將融合的產(chǎn)品命名為PLBTR。
PR0RHILIPFP2 = 5，CTC GAG AAA AGA GAG GCT GAA GCT GTTCCT GTT TCT GGT AM TC 3'
BTRPRP1 = 5’ GCG GCC GCT TAG TTA GAC GCA ATT GTT TGCTTG 3’
得到的PCR產(chǎn)品在的瓊脂糖凝膠上分析。
從以上瓊脂糖凝膠切出正確大小的基因產(chǎn)品，并通過凝膠提取純化。該產(chǎn)品在 16°C下連接入pTZ57R/T載體過夜。該連接混合物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)E. coli DH5 α細胞，在包含 100 μ/ml氨比西林的LB瓊脂平板上選擇克隆。使用沸騰微量制備法(boiling miniprep method)篩選獲得的菌落。通過釋放用限制性內(nèi)切酶^Cbal和BamHI消化的插入片段來確認插入片段的存在。選擇克隆#11并使用Qiagen miniprep kit分離更多的質(zhì)粒。
實例2
將該產(chǎn)品亞克隆入pPIC9K
使用Biol和EcoRI位點切出PLBTR片段并在相同位點連接入pPIC9K。該連接混合物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)E. coli DH5a細胞，在包含100 μ/ml氨比西林的LB瓊脂平板選擇克隆。使用沸騰微量制備法篩選獲得的克隆。插入片段的存在是通過釋放用限制性內(nèi)切酶Xhol 和EcoRI消化的插入片段確認的。名為PLBTR/pPICTk的正確克隆通過限制消化驗證。
用PLBTR/pPIC9K質(zhì)粒進行巴斯德畢赤酵母GSl 15菌株轉(zhuǎn)化
使用McI線性化PLBTR/pPIC9K載體并遵循h(huán)vitrogen手冊中描述的方法通過電穿孔轉(zhuǎn)化入巴斯德畢赤酵母GS115。在0.5mg/ml的G418上篩選約1200個克隆。發(fā)現(xiàn)四i^一個克隆抵抗0. 5mg/ml的G418。這些克隆放于2mg/ml的G418上。
檢測所有六個抗性克隆，以檢測感興趣基因的基因組整合的情況。對這些克隆進行脂酶原-牛胰蛋白酶原融合蛋白的誘導(dǎo)表達研究。
下表收集了所有篩選數(shù)據(jù)
無CFU0.5mg/ml G418r CFU2mg/mlG418r CFUPCR確認12004166
Mut+ 和 Muts 的篩選
使用AOX啟動子FP和AOX終止子RP引物進行PCR篩選Mut+和Muf轉(zhuǎn)化體的。
GSl 15小規(guī)模表達研究
在搖瓶中進行小規(guī)模表達研究。簡要地，克隆在BMGY中在30°C下生長，隨后在 BMMY中在30°C下用甲醇誘導(dǎo)?？偣灿?天進行甲醇的誘導(dǎo)。用六個克隆進行表達研究。簡要地，克隆在BMGY中在30°C下生長，隨后在BMMY中在30°C下用甲醇誘導(dǎo)?？偣灿?天進行甲醇的誘導(dǎo)。
實例3:
在自制巴斯德畢赤酵母菌株中，畢赤酵母優(yōu)化密碼子的脂酶原-牛胰蛋白酶原 (CPLBTR)的表達
畢赤酵母優(yōu)化密碼子的脂酶原-牛胰蛋白酶原(CPLBTR)的合成基因在SEQ ID 3中表示。
PMBL210中胰蛋白酶原的克隆。
1.PCR 擴增:
使用質(zhì)粒0900098 Seq 3 pMA進行脂酶原-牛胰蛋白酶原的PCR擴增，質(zhì)粒 0900098 Seq 3 pMA 是使用引物 CPLBTRFP 和 CPLBTRRP 從 Geneart 得到的。
· CPLBTRFP :5’ ACC TCG AGAAGA GAG TTC CAG T 3’
· CPLBTRRP :5，GGG AAT TCT TAG TTA GAA GCG ATA GTT TGC 3，
PCR反應(yīng)混合物
權(quán)利要求
1.一種融合多肽，包含融合于脂肪酶信號序列的至少一種絲氨酸蛋白酶，所述融合多肽在甲基營養(yǎng)酵母中表達，其中所述融合多肽具有與SEQ ID N0:1至少80%同源性的氨基酸序列。
2.一種融合多肽，包含融合于脂肪酶信號序列的至少一種絲氨酸蛋白酶，所述融合多肽在甲基營養(yǎng)酵母中表達，其中所述融合多肽具有與SEQ ID NO :2至少80%同源性的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的融合多肽，其中SEQID 1或2的68和69號氨基酸被氨基酸精氨酸和賴氨酸取代。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的融合多肽，其中68號的氨基酸被酪氨酸取代。
5.權(quán)利要求1、2、3或4所述的融合多肽的應(yīng)用，其中所述多肽能夠使胰島素或胰島素類似物或胰島素衍生物的前體形式轉(zhuǎn)化為它們對應(yīng)的活性形式，有至少50%的步驟產(chǎn)率。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的融合多肽，其中所述甲基營養(yǎng)酵母屬于畢赤酵母屬 (Pichia sp.) 0
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的融合多肽，其中所述甲基營養(yǎng)酵母是巴斯德畢赤酵母 (Pichia pastoris)0
8.—種表達融合多肽的方法，所述融合多肽包括由甲基營養(yǎng)酵母生產(chǎn)的融合于脂肪酶信號序列的至少一種絲氨酸蛋白酶，所述融合多肽具有與SEQ ID NO 1表示的核苷酸序列或SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列至少80%同源性的核苷酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述絲氨酸蛋白酶是胰蛋白酶原。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述甲基營養(yǎng)酵母屬于畢赤酵母屬。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述甲基營養(yǎng)酵母是巴斯德畢赤酵母。
12.—種載體，包括權(quán)利要求1、2、3、或4所述的序列。
13.一種轉(zhuǎn)化細胞，包括可表達形式的根據(jù)權(quán)利要求9的權(quán)利要求1或2所述的序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及新型脂酶原-牛胰蛋白酶原(PLBTR)融合蛋白、編碼它們的基因、及其產(chǎn)品和應(yīng)用。更具體地，本發(fā)明涉及以最優(yōu)量生產(chǎn)PLBTR融合蛋白的方法，PLBTR融合蛋白包括正常情況下對自催化活性敏感的異源多肽。更具體地，本發(fā)明涉及融合蛋白，其包括異源多肽，例如融合于脂肪酶信號序列的絲氨酸蛋白酶，其可通過重組宿主細胞以期望量表達。本發(fā)明還涉及編碼此類融合蛋白的多核苷酸、涉及用于表達此類融合蛋白的表達載體、涉及用此類多核苷酸/載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞、并且涉及生成此類融合蛋白的方法。
文檔編號C12P21/06GK102482675SQ200980161363
公開日2012年5月30日 申請日期2009年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月10日
發(fā)明者克達納斯·薩斯特里, 南迪尼·納塔拉杰, 帕薩·哈茲拉, 戈庫爾·約蒂拉曼, 桑賈伊·蒂瓦里, 穆克什·巴布阿帕·帕塔勒, 納加拉杰·戈文達帕 申請人:拜康有限公司