專利名稱：編碼間日瘧原蟲抗原的經(jīng)遺傳修飾的序列的制作方法
編碼間日瘧原蟲抗原的經(jīng)遺傳修飾的序列本發(fā)明涉及經(jīng)修飾的遺傳序列(包括用于間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)的抗原(DBP-PA、DBP-AM、DBP-MT、AMA-1、CS_MSP-1)的序列)的構(gòu)建、由提到的序列編碼的相應(yīng)重組蛋白質(zhì)以及表達(dá)這些重組抗原的經(jīng)遺傳修飾的病毒。除此以外，本發(fā)明還涉及利用腺病毒或痘病毒載體的初免-加強(qiáng)(prime-boost)接種方法、針對(duì)免疫接種哺乳動(dòng)物純化的蛋白質(zhì)以及待用作針對(duì)瘧疾的疫苗的數(shù)種可能的疫苗組合物。WHO認(rèn)為瘧疾是目前三種主要的傳染性疾病之一，并且到目前為止尚無經(jīng)許可的抗該疾病的疫苗。世界上最流行的寄生蟲是間日瘧原蟲和惡性瘧原蟲(P. falciparum)，前者在巴西最常見，在巴西，瘧疾是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。過去數(shù)年中病例數(shù)目的増加加劇了巴西的瘧疾情況。由于兩種寄生蟲之間存在巨大的遺傳差異，因此需要不同的疫苗。數(shù)項(xiàng)研究支持了瘧疾疫苗是可行的的想法。支持該論點(diǎn)的主要論據(jù)是(i)利用經(jīng)輻照的子孢子已在動(dòng)物模型和人類中實(shí)現(xiàn)完全保護(hù)；(ii)居住在流行地的成人比兒童更少受到瘧疾侵襲，提示通過重復(fù)的暴露引起免疫力累積是可能的；(iii)流行地的成人患者的血清保護(hù)其他成人。重組病毒已證明對(duì)疫苗的開發(fā)是有效的。用于瘧疾、結(jié)核病和艾滋病的基于重組病毒的疫苗候選者的臨床試驗(yàn)顯示出前所未有的針對(duì)由病毒表達(dá)的重組產(chǎn)物的細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。這些水平與以純化的重組蛋白為基礎(chǔ)的疫苗配方或DNA質(zhì)粒疫苗相比要高得多 (R0CHAC.，CAETAN0 B. , MACHADO A.，BRUNA-R0MER0 0. Recombinant viruses as tools to induce protective cellular immunity against infectious diseases(作為弓|起抗傳染病的保護(hù)性細(xì)胞免疫的工具的重組病毒).ht. Microbiol. 2004. 7，89-94)。目前，已證實(shí)重組病毒載體是有效的疫苗媒介。在那些證實(shí)有效的病毒載體中，痘病毒、流感病毒和腺病毒是最常使用的。涉及后者的ー些研究處于疾病例如瘧疾和艾滋病的臨床試驗(yàn)的晚期。使用重組病毒的優(yōu)點(diǎn)之ー在于以下事實(shí)病毒顆粒本身對(duì)其自身發(fā)揮佐劑作用， 不需要使用其它佐劑化合物或細(xì)胞因子。因此，腺病毒重組體、流感病毒和痘/痘苗病毒以其免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)脫穎而出(GUILL0T L.，LE GOFFIC R.，BLOCK S.，ESCRI0U N.，AKIRA S.， CHIGNARD. M. SITAHAR M. Involvement of toll-liKe receptor 3in the immune response of lung epithelial ceils to double-stranded RNA and influenza A virus (toll 樣受體3參與肺上皮細(xì)胞對(duì)雙鏈RNA和甲型流感病毒的免疫應(yīng)答).J. Biol. Chem. 2003. 280, 5571-5580)。人腺病毒可有效地刺激免疫應(yīng)答并引起記憶細(xì)胞形成；并且腺病毒血清型5被認(rèn)為是最具免疫原性的病毒之一(Abbink，Peter ；Lemckert, Angelique Α. C. ；Ewald, Bonnie Α. ；Lyncn, Diana Μ. ；Dennoltz, Mattnew ；bmits, Shirley ；Holterman, Lennart ； Damen, Irma ；Vogels, Ronald ；Thorner, Anna R. ；0' Brien, Kara L. ；Carville, Angela ； Mansfield, Keith G. ；Goudsmit, Jaap ；Havenga, Menzo J. ；Barouch, DanH.2007. Comparative Seroprevalence and Immunogenicity of bix Rare Serotype Recombinant Adenovirus Vaccine Vectors from Subgroups Band D (六種來自亞組 B 禾ロ D 的罕見血清型重組腺病毒疫苗載體的血清陽性率和免疫原性的比較).J.Virol. ,81 :1-10)。在獲得性免疫應(yīng)答中，腺病毒通過B細(xì)胞(ffoh lfart, Claes. 1988. Neutralization of Adenoviruses :Kinetics, Stoichiometry, and Mecnanisms、腺炳毒的中禾ロ 動(dòng)力學(xué)、化'乎計(jì)量和機(jī)制)· J. Immunol. ,62 :2321-2328) ,T CD4+細(xì)胞活化(Olive,Melanie ；Eisenlohr, Laurence ；Flomenberg, Neal ；Hsu, Susan ；Flomenberg, Phyllis. 2002. The Adenovirus Capsid Protein Hexon Contains a Highly Conserved Human CD4+T_Cell Epitope(腺炳毒衣殼蛋白六鄰體包含高度保守的人CD4+T細(xì)胞表位).Hum. Gene Ther.，13 :1167-1178) 禾ロ T CD8+ 細(xì)胞(Fitzgerald, Julie C. ；Gao, Guang-Ping ；Reyes-Sandoval, Arturo ； PavlaKis,George N. ；Xiang,Zhi Q. ；fflazlo,Anthony P. ；Giles-Davis,Wynetta ；Wilson, James Μ. ；Ertl, Hildegund G.C.2003.Simian Replication-Defective Adenoviral Recombinant Vaccine to HIV-I feig(抗HIV-1 Gag的猿猴復(fù)制缺陷型腺病毒重組疫苗).J. Immunol. , 170 1416-1422)，來引起抗體的形成和釋放。大多數(shù)重組痘病毒(其中包括Western Reserve (WR)、Copenhage和MVA (經(jīng)修飾的痘苗病毒Ankara)毒株)的構(gòu)建技術(shù)包括穿梭質(zhì)粒和受感染細(xì)胞中的原始病毒之間的同源DNA重組。一般而言，利用包含表達(dá)盒的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移載體產(chǎn)生重組病毒，在表達(dá)盒中，外源基因通常由早期和晚期痘病毒的強(qiáng)啟動(dòng)子控制。該盒側(cè)接與病毒基因組中存在的序列同源的DNA序列，并且該盒可用于引導(dǎo)重組體到需要的基因座。重組率較高，為約0. 1%，并且重組病毒可經(jīng)平板選擇、純化并擴(kuò)増。在使腺病毒成為疫苗開發(fā)的理想候選者的特征中的是對(duì)人類具有低致病性、不能整合到宿主基因組中以及容易純化，導(dǎo)致高病毒效價(jià)以及感染數(shù)種細(xì)胞包括樹突細(xì)胞 、dentritic ceil)的能力(Rocha, Carolina Damas ；Caetano, Braulia Costa ；Machado, Alexandre Vieira ； Druna-Romero, Oscar. 2004. Recombinant viruses as tools to induce protective eel lularimmunity against infectious diseases (作為弓 | 起抗傳染病的保護(hù)性細(xì)胞免疫的工具的重組病毒).Int. Microbiol.，7 :83-94)。在支持使用痘/痘苗病毒作為疫苗載體的特征中的是α)能夠容納大片段外源 DNA并表達(dá)重組蛋白的基因組，(ii)復(fù)制發(fā)生在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，防止病毒基因組整合到宿主遺傳物質(zhì)中，(iii)容易純化，(iv)能夠在單次免疫接種后產(chǎn)生對(duì)插入其基因組的轉(zhuǎn)基因特異的持久的淋巴細(xì)胞(Rocha, Carolina Damas ；Caetano, Braulia Costa ；Machado, Alexandre Vieira ； Druna-Romero, Oscar. 2004. Recombinant viruses astools to induce protective cellular immunity against infectious diseases (作為弓|起抗傳染病的保護(hù)性細(xì)胞免疫的工具的重組病毒).ht. Microbiol.，7 :83-94)。初免-加強(qiáng)免疫接種方案對(duì)引起聯(lián)合的B和T細(xì)胞免疫カ是最高效的，并且依賴多次/序貫給予疫苗。從疫苗構(gòu)建來看，同源初免-加強(qiáng)免疫接種方案是有利的，因?yàn)閮H需要開發(fā)ー種疫苗(待用于免疫接種的單ー載體)，而對(duì)于異源方案，需要開發(fā)兩種或更多種的疫苗，每ー種疫苗都包含待用于免疫接種的載體/抗原之一。數(shù)個(gè)作者提出，由于首次免疫接種后形成的預(yù)先存在的免疫力，同源方案中進(jìn)行的加強(qiáng)在再刺激特異性免疫細(xì)胞方面不那么有效。本發(fā)明使用的6-8周的免疫接種 (初免-加強(qiáng)劑量)間隔證實(shí)在初始接種后引起的初次免疫應(yīng)答的再刺激方面是有效的，這表明，在該時(shí)間段后，預(yù)先存在的免疫力降低至允許給予第二個(gè)疫苗劑量的水平(Complete, long-lasting protection against malaria οι mice primed and boosted with two distinct viral vectors expressing the same plasmodial antigen(用表達(dá)相同瘧原蟲抗原的兩種不同病毒載體初免并加強(qiáng)的小鼠針對(duì)瘧疾的完全、持久保 護(hù)).2001 Bruna-Romero 0, Gonzaalez-AsegUinolaza G, Hafalla JC, Tsuji M, Nussenzweig RS. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 年 9 月 25 日；9バ20) :11491-6)。專利文件W007003384A1描述了可用于針對(duì)瘧疾免疫接種的瘧疾抗原的新用途。 該發(fā)明采用結(jié)合適當(dāng)佐劑的子孢子抗原，特別是CS蛋白質(zhì)或免疫原性衍生片段。專利文件US20050100558A1描述了用來產(chǎn)生有效抗原特異性免疫應(yīng)答的接種方法。該發(fā)明主要描述了使用異源接種載體來引起加強(qiáng)的免疫應(yīng)答。還掲示了使用該接種方案來治療和預(yù)防疾病的方法。專利文件W006040334A1描述了基于初免-加強(qiáng)方案的新疫苗方案。該專利使用了表達(dá)惡性瘧原蟲抗原的中和重組腺病毒載體。還描述了基于重組DNA技術(shù)的疫苗以及適當(dāng)?shù)淖魟?。專利文件US20040131594A1描述了用于接種的方法和試劑，所述接種可產(chǎn)生抗瘧疾、病毒或腫瘤抗原的CD8T細(xì)胞免疫應(yīng)答。該專利描述了新疫苗方案并且該方案使用初免-加強(qiáng)組合物。加強(qiáng)組合物包括使用非復(fù)制或復(fù)制缺陷型痘病毒載體，其表達(dá)至少ー種同樣在初始組合物中存在的CD8T細(xì)胞表位。專利文件US20060188527A1描述了通過接種防止傳染瘧疾的新方法。該發(fā)明包括通過使用基于DNA的疫苗來引起初始抗瘧疾反應(yīng)，然后使用蛋白質(zhì)加強(qiáng)免疫接種疫苗。由于對(duì)生物的認(rèn)識(shí)及其在有益于人類健康的實(shí)驗(yàn)中的認(rèn)可(CREEG等人，1993)， 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是第一種旨在產(chǎn)生外源蛋白所使用的酵母。但是，釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)并不能滿足所有的期望，因?yàn)槠浞置诤蜕a(chǎn)カ效率低下、高糖基化 (hyperglycosylation)、生產(chǎn)菌株不穩(wěn)定、難以保持高的生長(zhǎng)速度以及高的重組細(xì)胞群密度(SWINKELS等人，199 。許多研究已經(jīng)進(jìn)行和正在進(jìn)行，嘗試使用備選酵母來生產(chǎn)重組蛋白。在那些研究中，其表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)設(shè)計(jì)的巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)證實(shí)是合成和分泌用于臨床、學(xué)術(shù)或エ業(yè)用途的異源蛋白質(zhì)的有效宿主(COS等人，2005)。巴斯德畢赤酵母是能夠生長(zhǎng)至高細(xì)胞密度的甲基營(yíng)養(yǎng)酵母，并且產(chǎn)生的重組蛋白的濃度常與獲得的生物量成比例(HINGGS，1998)。數(shù)個(gè)實(shí)例顯示，畢赤酵母可獲得比釀酒酵母、大腸桿菌或桿狀病毒好的產(chǎn)量(CREGG，VEDVICK e RASCHKE，1993 ;R0MAN0S等人， 1992)。畢赤酵母系統(tǒng)的成功主要與醇氧化酶編碼的AOXl基因啟動(dòng)子相關(guān)，該酶在含有甘油的培養(yǎng)基中受到阻遏，但是當(dāng)細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到含有甲醇作為唯一碳源的培養(yǎng)基時(shí)，該酶被誘導(dǎo)(HINGGS, 1998 ；CREEG 1999 ;B0ETTNER 等人，2002)。一旦轉(zhuǎn)化細(xì)胞整合了ー個(gè)基因拷貝，群體密度的増加就増加蛋白質(zhì)的產(chǎn)量(CREEG 等人，1993)。除了獲得高的群體密度，巴斯德畢赤酵母還具有其它優(yōu)點(diǎn)，例如被AOXl啟動(dòng)子高度調(diào)節(jié)；低糖基化(常類似于人蛋白質(zhì)的糖基化)；蛋白質(zhì)表達(dá)的甲醇誘導(dǎo)簡(jiǎn)化；天然蛋白分泌水平低；在簡(jiǎn)單或確定成分培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；以及利用甲醇作為唯一碳源(CREEG等人，1993 ；DIGAN 等人，1989 ；CHEN 等人，1996 ；NOHR等人，2003 ；WITTAKER等人，2004 ；C0S，等人，2005)。用于使巴斯德畢赤酵母生產(chǎn)重組蛋白的生長(zhǎng)培養(yǎng)基成分十分確定、廉價(jià)并且非常適合大規(guī)模生產(chǎn)。該培養(yǎng)基不含可產(chǎn)生毒素的復(fù)雜成分，因此該培養(yǎng)基在藥物生產(chǎn)中易于被接受(CHEN 等人，1996 ；GELLISSEN 等人，2005)。許多細(xì)胞因子、疫苗和其它生物制品正被開發(fā)，例如在南美洲商業(yè)化的乙肝疫苗。 如今，有ー些生物技術(shù)上重要的肽在畢赤酵母中生產(chǎn)，例如胰島素樣生長(zhǎng)因子I(IGF-I) 和HSA。這些肽用于生產(chǎn)階段并用在肌萎縮性硬化的商業(yè)治療中以及作為血清的替代物 (WILLADSEN 等人，1995 ；CANALES 等人，1997 ；CEREGHIN0, 2000)。作為這些觀察的結(jié)果以及巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)分泌有助于其純化過程的蛋白質(zhì)這一事實(shí)，由該系統(tǒng)進(jìn)行的間日瘧原蟲的DBPII表達(dá)可能是獲得生物活性蛋白最可行的方式之一。這使其作為抗原應(yīng)用到免疫接種過程成為可能，具有用于人用的潛力?；蛘撸墒褂幂^容易的表達(dá)系統(tǒng)例如重組細(xì)菌大腸桿菌，前提是該系統(tǒng)表達(dá)的抗原會(huì)與瘧疾患者的血清反應(yīng)。因此，抗瘧疾的免疫接種可基于稱為DARC的紅細(xì)胞中的Duffy抗原的結(jié)合蛋白 (瘧原蟲(Plasmodium)的Duffy結(jié)合蛋白)，DARC對(duì)其結(jié)合具有特異性。該紅細(xì)胞侵入包括復(fù)雜的事件次序并需要紅細(xì)胞受體和寄生蟲蛋白質(zhì)之間的特異性相互作用。已有報(bào)道， 間日瘧原蟲傳染完全依賴于DufTy與人紅細(xì)胞的這種相互作用。據(jù)說，大部分非洲人群耐間日瘧原蟲傳染，并旦那是由于以下事實(shí)所觀察的人群不具有DARC受體，防止了 DPB共價(jià)相互作用。這使DPB成為疫苗的優(yōu)秀候選者，只要針對(duì)該區(qū)域的抗體阻斷DBP和人群中的紅細(xì)胞的相互作用，在所述人群中，間日瘧原蟲為瘧疾的主要原因。結(jié)構(gòu)研究確定，負(fù)責(zé)與紅細(xì)胞連接的DPB區(qū)域包括蛋白質(zhì)區(qū)域II。該區(qū)域富含半胱氨酸，保證了其結(jié)構(gòu)性構(gòu)象。該區(qū)域還富有多態(tài)性，使其能夠逃避宿主的免疫系統(tǒng)。出于命名原因，間日瘧原蟲的DBP區(qū)域II被描述為PvDBPII。研究者已說明了呈其正確的構(gòu)象和功能活性的PvDBPII，即能夠與紅細(xì)胞連接并識(shí)別抗DBPII抗體的PvDBPII。但是，當(dāng)其用于免疫接種時(shí)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)并不能給予完全的保護(hù)。ー些作者提出，更具免疫原性的蛋白質(zhì)的構(gòu)建可根據(jù)PvDBII保守序列進(jìn)行，這提示多態(tài)性區(qū)域遠(yuǎn)離DBPII的結(jié)合位點(diǎn)。但是，巴西流行區(qū)中發(fā)現(xiàn)的PvDBII序列的多態(tài)性研究表明，多態(tài)性位點(diǎn)位于結(jié)合區(qū)域附近。這可提示，針對(duì)間日瘧原蟲的DBPII的疫苗應(yīng)包含多態(tài)性區(qū)域，從而避免瘧原蟲逃避免疫系統(tǒng)。頂膜抗原1 (AMA-I)存在于所有種類的瘧原蟲中(HODDER，A. N. ；CREWTHER, P. E.； ANDERS, F. Specificity of the protective antioody response to apical membrane antigen 1 (對(duì)頂膜抗原1反應(yīng)的保護(hù)性抗體的特異性).hfect. Immun. ν 69，η° 5 ；第 3286-3294頁，2001)。AMA-I合成后儲(chǔ)存于微線體(micronema)中，隨后通過棒狀體或在侵入宿主細(xì)胞過程中被寄生蟲易位到表面。在所有瘧原蟲物種中，除了惡性瘧原蟲以外，AMA-I作為66kDa的跨膜蛋白質(zhì)合成。其是典型的整合蛋白，具有N末端胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和小的C末端細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域 (K0CKEN, C. H. M. ；WITHERS-MARTINEZ, C. ；DUBBELD, Μ.A. ；WEL, A. ；HACKETT, F. ；BLACKMAN, M. J；THOMAS, A. W. high-level expression οι the malaria blooa—stage vaccine candidate Plasmodium falciparum apical membrane antigen 1 and induction of antibodies that inhibit erytrocyte invasion(癥疾血液階段疫苗イ侯選者惡個(gè)生癥原蟲頂膜抗原1的高水平表達(dá)以及抑制紅細(xì)胞入侵的抗體的誘導(dǎo)).Infect. Immun. v. 70，n° 8 ； 第 4471-4476 頁，2002)。在所有經(jīng)表征的瘧原蟲中，AMA-I基因產(chǎn)生胞外結(jié)構(gòu)域中保守的16個(gè)Cys 錢 S (PIZARRO, J. C. ；N0RMAND, B. V.；等 K ■ Cristal structure of the malaria vaccine candidate apical membrane antigen 1 ( 疾疫畝イ丨矢選者頂月旲抗原1的晶體結(jié)構(gòu)).kience.v. 308，第408-411頁，2005)并且被分成由8個(gè)ニ硫鍵限定的三個(gè)結(jié)構(gòu)域(HODDER, A. N. ；CREWTHER, P. E. ；MATTHEW, Μ. L. S. Μ. ；REID, G. Ε. ；MORITZ, R. L.； SIMPSON, R. J. ；ANDERS, R. F. The disulfide bond structure of Plasmodium apical membrane antigen-1 (瘧原蟲頂膜抗原 1 的ニ硫鍵結(jié)構(gòu))· J. Biol. Chem. V 271，n° 46 ；第 29446-29452 頁，1996)。間日瘧原蟲AMA-I (PvAMA-I)胞外結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)于Pro43至Leu487殘基的晶體結(jié)構(gòu)， 證實(shí)分成了三個(gè)結(jié)構(gòu)域，并且結(jié)構(gòu)域I和II在結(jié)構(gòu)上與屬于PAN超家族的其它蛋白質(zhì)類似，PAN超家族的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出與附著和連接受體或其它蛋白質(zhì)有關(guān)的功能。除此以外， 結(jié)構(gòu)域II具有對(duì)應(yīng)于命名為結(jié)構(gòu)域II的環(huán)的四5-334殘基的無序或活動(dòng)區(qū)(PIZARR0， J. C. ； N0RMAND, B. V.；等人· Cristal structure of the malaria vaccine candidate apical membrane antigen 1 (瘧疾疫苗候選者頂膜抗原1的晶體結(jié)構(gòu)).Science, v. 308， 第 408-411 頁，2005)。在惡性瘧原蟲中，AMA-I作為83kDa的多肽產(chǎn)生，其在合成后經(jīng)過加工，其中N末端的小片段被蛋白酶剪切，產(chǎn)生62kDa的成熟蛋白質(zhì)(Crewther，P. Ε. ；Culvenor, J. G.； Silva,A.；しooper,J.A. ；Anders,R. r. Plasmodium ialciparum :two antigens oi similar size are located in different compartments of the rhoptry(惡性癥原蟲大小類似的兩個(gè)抗原位于棒狀體的不同區(qū)室).Exp.Parasitol. ν 70，n° 2，第193-206頁，1990)。這種分子誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的能力取決于通過ニ硫鍵維持的其構(gòu)象的穩(wěn)定性(HODDER, Α. N. ；CREWTHER, P. Ε. ；MATTHEW, Μ. L. S. Μ. ；REID, G. Ε. ；MORITZ, R. L.； SIMPSON, R. J. ；ANDERS, R. F. The disulfide bond structure of Plasmodium apical membrane antigen-1 (瘧原蟲頂膜抗原 1 的ニ硫鍵結(jié)構(gòu)).J. Biol. Chem. ν 271，η° 46; 第四446-四452頁，1996)，因?yàn)橐种菩钥贵w優(yōu)選與具有通過ニ硫鍵維持的穩(wěn)定構(gòu)象的表位反應(yīng)(HODDER, Α. N. ；CREWTHER, P. Ε. ；ANDERS, R. F. Specificity of the protective antibody response to apical membrane antigen 1 ( X^tTjJiI^JtlJ|i. 1 J^IS的 1 J^t生Jfty[本的特異性).Infect. Immun. V 69，n° 5 ；第 3286_3四4 頁，2001)。AMA-I序列在瘧原蟲物種中相對(duì)保守，其中與所有已知的序列相比，氨基酸序列的同一性水平大于 50 % (CHENG, Q. ； SAUL, A. Sequence analysis of the apical membrane antigen 1 (AMA-I) of dePlasmodium vivax ( fS] H jgJ^^ WTSIIJfiJ^ 1 (AMA-I) 的序列分析).Mol. Biochem. Parasito 1. ν 65 ；第 183-187 頁，2004)。另外，AMA-I 并不存在重復(fù)序列或在其它抗原例如MSP-I和MSP-2中發(fā)現(xiàn)的多態(tài)性(ANDERS，R. F.，SMYTHE, J. A. Polymorphic antigens in Plasmodium falciparum (惡性原蟲中的多態(tài)抗原)· Blood, v. 74 ；第 1865-1875 頁，1989)。AMA-I的生物學(xué)功能仍然未知，但是有證據(jù)表明這種蛋白質(zhì)通過裂殖子參與紅細(xì)胞入侵過程(K0CKEN, C. H. M. ；WITHERS-MARTINEZ, C. ；DUBBELD, Μ. A. ；WEL, A. ；HACKETT,F. ；BLACKMAN, M. J ；THOMAS, A. W. High-level expression of the malaria blood-stage vaccine candidate Plasmodium falciparum apical membrane antigen land induction of antibodies that inhibit erythrocyte invasion(癥疾血液階段疫苗イ侯選者惡性瘧原蟲頂膜抗原1的高水平表達(dá)和抑制紅細(xì)胞入侵的抗體的誘導(dǎo)).Infect. Immun. v. 70, η ° 8 ；第 4471-4476 頁，2002，Li, F. ；DLUZEffSKI, Α. ； COLEY, A.M. ； THOMAS, Α.； TILLEY, L. ；ANDERS, R. F. ；FOLEY, Μ· Phage—displayed peptides bind to the malarial protein apical membrane antigen-land inhibit the merozoite invasion oi nost erythrocytes (噬菌體展示肽與瘧疾蛋白質(zhì)頂膜抗原1結(jié)合并抑制宿主紅細(xì)胞的裂殖子入侵)· J. Biol. Chem. ν 277，n° 52 ；第 50303-50310 頁，2002)。針對(duì)AMA-I的單克隆抗體能夠抑制裂殖子入侵，表明AMA-I在入侵過程中起作用(CREWTHER等人，1990)。Mitchell和合作者Q004)提示，這種蛋白質(zhì)直接負(fù)責(zé)入侵過程中裂殖子的重新定向，或AMA-I可以啟動(dòng)緊密附著，和其依靠Duffy結(jié)合蛋白以使該過程有效地運(yùn)行(MITCHELL, G. H. ；THOMAS, Α. W. ；MARGOS, G. ；DLUZEffSKI, A. R. ；BANNISTER, L. H. Apical membrane antigen 1, a major malaria vaccine candidate, mediates the close attachment of invasive merozoites to host red blood cells (主要的癥疾沒苗候選者頂膜抗原1介導(dǎo)入侵性裂殖子對(duì)宿主紅細(xì)胞的緊密附著).hfect. Immun. ν 72， η° 1 ；第 154-158 頁，2004)。AMA-I還參與入侵肝細(xì)胞。子孢子入侵肝細(xì)胞后停止表達(dá)該種蛋白質(zhì)，并且該蛋白質(zhì)僅在裂殖子中重新表達(dá)。抗AMA-I抗體抑制子孢子的入侵提示，AMA-I可視為多階段瘧疾疫苗的潛在候選者，并且其在紅細(xì)胞內(nèi)期和紅細(xì)胞外期(pre-erythrocyte stage)兩個(gè)階段均為靶標(biāo)(SILVIER,0. ；FRANETICH, J. F. ； CHARRIN,S. ；MUELLER, Μ. S.等人· A role for apical antigen 1 during invasion oi nepatocytes by P. falciparum sporozoites(TjS 端抗原1在惡性瘧原蟲子孢子入侵肝細(xì)胞過程中的作用).J. Biol. Chem. V. 279(10)，第 9490-6 頁，2004)。已知當(dāng)針對(duì)AMA-I的抗體與裂殖子表面相互作用吋，針對(duì)AMA-I的抗體可抑制體外和體內(nèi)寄生蟲的増殖。用AMA-I在動(dòng)物模型(小鼠和猴子)中進(jìn)行的疫苗研究顯示，當(dāng)動(dòng)物受到瘧原蟲物種的攻擊時(shí)，用這種純化或重組的蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫接種誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答。這種蛋白質(zhì)19kDa的C末端片段是疫苗的主要候選者之一。數(shù)項(xiàng)研究顯示，這種抗原能夠觸發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答(KUMAR，S. ；COLLINS,W. ；EGAN,A. ；YADAVA，A. ；GARRAUD,0.； BLACKMAN, Μ. J. ；ΡΑΤΙΝΟ, J. A. G. ；DIGGS, C. ；KASLOff, D. C. Immunogenicity and efficacy in Aotus monKeys oi four recombinant Plasmodium falciparum vaccines in multiple adjuvant formulations based on the 19~kilodalton Cterminus of merozoite surface protein 1(呈基于裂殖子表面蛋白1的19千道爾頓C末端的多佐劑制劑的四種重組惡性瘧原蟲疫苗在夜猴中的免疫原性和效能).hfect. Immun. ν 68, n° 4 ；第2212-2223頁， 2000，ST0WERS等人，2002)。間日瘧原蟲的MSP-I (PvMSPI19)與研究的其它瘧原蟲物種的 MSP-I19類似，其由ー對(duì)具有數(shù)個(gè)結(jié)構(gòu)域間接觸的EGF (表皮生長(zhǎng)因子)樣結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，并且它們相互對(duì)準(zhǔn)成反向平行定向。這導(dǎo)致了 U型構(gòu)象，使C和N末端非?？拷?BAB0N，J.J.； MORGAN, W. D. ；KELLY, G. ；ECCLESTON, J. F. HOLDER, A. A. Structural studies on P. vivaxmerozoite surface protein-1 (間日瘧原蟲裂殖子表面蛋白質(zhì)1的結(jié)構(gòu)研究).Mol. Biochem. Parasitol. V. 153，第 31-40 頁，2007)。Cunha和合作者Q002)比較了在不同細(xì)菌載體中表達(dá)的重組蛋白PvMSP-I19的免疫原性性質(zhì)。在該研究中，研究者表示，由(HIS6MSP-I19)載體表達(dá)的MSP-I19較好地被暴露于間日瘧原蟲的個(gè)體的抗體識(shí)別，并且將PADRE (Pan等位基因DR表位)表位加到 HIS6MSP-I19中并不改變?nèi)丝贵w對(duì)這種重組蛋白的識(shí)別。這些蛋白質(zhì)在C57BL/6中是免疫原性的，誘導(dǎo)對(duì)MSP-I19特異的抗體，并且LT或IFN- γ分泌的増殖試驗(yàn)證實(shí)了對(duì)MSP-I19 特異的 T 細(xì)胞的存在(CUNHA，M.G. ；R0DRIGUES, Μ. M. ；SOARES, I. S. Comparison of the immunogenic properties of recombinant proteins representing the Plasmodium vivax vaccine candidate MSP-I19 expressed in distinct bacterial vectors (^^t 在不同細(xì)菌載體中表達(dá)的間日瘧原蟲疫苗候選者M(jìn)SP-I19的重組蛋白質(zhì)的免疫原性性質(zhì)比較)· Vaccine. ν· 20，第 385-396 頁，2002)。為獲得針對(duì)瘧疾的有效疫苗要克服的主要障礙是免疫原性與保護(hù)性之間的相關(guān)性、具有種類繁多的階段特異性抗原的瘧原蟲周期的復(fù)雜性、引起細(xì)胞免疫應(yīng)答和維持持久的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答(免疫學(xué)應(yīng)答)的困難。包含紅細(xì)胞外(pre-erythrocyte)和紅細(xì)胞寄生蟲形式的特異性抗原的多階段疫苗似乎是獲得針對(duì)瘧疾的保護(hù)最有效的備選。初始和加強(qiáng)方案的給予是具有較高概率針對(duì)瘧疾提供保護(hù)的選擇，這種方案利用作為免疫接種載體的重組病毒(腺病毒和/或痘病毒)以及重組蛋白質(zhì)，來引起這些重組抗原的高水平且同時(shí)發(fā)生(simultaneous)水平的持久性細(xì)胞和體液免疫。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及經(jīng)修飾的遺傳序列(包括間日瘧原蟲的抗原序列DBP-PA、DBP-AM、 DBP-MT、AMA-1、CS和MSP-1)的構(gòu)建、由提到的序列編碼的相應(yīng)重組蛋白質(zhì)以及表達(dá)重組抗原的經(jīng)遺傳修飾的病毒。除此之外，本發(fā)明還涉及利用腺病毒或痘病毒載體的初免-加強(qiáng)接種方法、用于哺乳動(dòng)物免疫接種的純化的蛋白質(zhì)以及有助于用作針對(duì)瘧疾的疫苗的疫苗組合物。針對(duì)間日瘧原蟲引起的瘧疾的Duffy抗原結(jié)合蛋白(Duffy結(jié)合蛋白或DBP)的遺傳序列是經(jīng)過修飾的。本發(fā)明還描述了腺病毒的構(gòu)建，由于將HASS信號(hào)肽摻入病毒載體中，所述腺病毒將重組蛋白分泌到細(xì)胞外介質(zhì)中。重要的是要提及構(gòu)建的特征在于，結(jié)合在巴西人群中發(fā)現(xiàn)的多態(tài)性，目的是增加疫苗的覆蓋度。為獲得多態(tài)性，使用來自巴西流行區(qū)的患者的序列。序列DBP-PA、DBP-MT 和DBP-AM代表在巴西發(fā)現(xiàn)的最常見的DBP多態(tài)性，并且這些序列的聯(lián)合給予在誘導(dǎo)保護(hù)性疫苗反應(yīng)方面是最重要的。多態(tài)性分析基于保藏在GenBank中的SAL-I序列進(jìn)行，該序列的登記號(hào)為 [Gil60275]。該研究中使用的序列用SAL-I序列作為標(biāo)準(zhǔn)并以氨基酸232開始，以氨基酸 548結(jié)束。為構(gòu)建腺病毒，獲取這些患者的血清并利用特定的寡核苷酸將其用于PCR擴(kuò)增。 該寡核苷酸利用分別插入序列開頭和結(jié)尾處的EcoRI和^Cbal限制性位點(diǎn)。擴(kuò)增后，陽性克隆被克隆到pTOPOTA中并通過酶消化進(jìn)行分析。用其位點(diǎn)在擴(kuò)增過程中摻入序列中的限制性內(nèi)切酶將該序列從該質(zhì)粒中移除。將消化產(chǎn)物純化并用pcDNA3. IHASS進(jìn)行克隆， pcDNA3. IHASS包含允許腺病毒分泌蛋白質(zhì)的流感病毒的信號(hào)肽?？寺≡谠撡|(zhì)粒的EcoRI和Xbal位點(diǎn)之間完成。消化陽性克隆以獲得HASS-DBPII部分，將該部分克隆入pADCMV-linkl 中，然后是巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子的表達(dá)。對(duì)陽性克隆進(jìn)行測(cè)序以證實(shí)正確的質(zhì)粒插入。將 pADCMVLinkl-HASS-DBPII用干與另ー質(zhì)粒pJM17重組成同源形式。該重組現(xiàn)象發(fā)生在轉(zhuǎn)染過程中并可供產(chǎn)生腺病毒5。另一重組蛋白自CS的氨基酸序列和間日瘧原蟲Bel6m譜系(GeneBank登記號(hào) AAA29526)獲得。將文獻(xiàn)描述的CS蛋白質(zhì)的表位選擇并插入HBcAg蛋白的策略性點(diǎn)，如先前所說明的(圖6)。進(jìn)行對(duì)設(shè)計(jì)的重組蛋白的結(jié)構(gòu)性構(gòu)象的預(yù)測(cè)以證實(shí)其與先前由 B0ttcher等人(1997)描述的HBcAg単體結(jié)構(gòu)的相似性。這種預(yù)測(cè)的結(jié)果通過Swiss-Pdb Viewer服務(wù)器根據(jù)重組蛋白質(zhì)的氨基酸序列提供，并提示，盡管插入來源于CS蛋白質(zhì)的外源氨基酸，但構(gòu)象結(jié)構(gòu)仍然相同。根據(jù)設(shè)計(jì)的氨基酸序列預(yù)測(cè)核苷酸序列，優(yōu)化用于人類模型的密碼子選擇。還插入限制酶位點(diǎn)，用于重組病毒構(gòu)建的克隆過程?；趦?yōu)化的遺傳序列，通過Entelechon公司生產(chǎn)合成基因(圖7)。在合成基因的Bglll/Ncol位點(diǎn)處克隆IRES序列。將兩個(gè)構(gòu)建類型(HBc-CS和 HBc-CS-IRES)克隆到 pAdCMV-link-Ι 質(zhì)粒的 Bglll/Ncol 位點(diǎn)中(圖 9)。通過在用包含轉(zhuǎn)基因的ρJM17和pAdCMV-1 ink_l質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞中的同源重組過程，來產(chǎn)生重組病毒。PJM17質(zhì)粒包含人腺病毒類型5基因組，該基因組通過 El區(qū)域中的插入(pBRX)而被修飾。pAdCMV-link-Ι質(zhì)粒包含側(cè)接克隆位點(diǎn)的巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(CMV)、聚腺苷酸化位點(diǎn)(聚A)和人腺病毒類型5的同源區(qū)域。pAd-HBc-CS和 pAd-HBc-CS-IRES的同源區(qū)域(Ad 0-1和Ad 9-16)配對(duì)并與pJM17重組，并且將帶有轉(zhuǎn)基因的表達(dá)盒轉(zhuǎn)移到腺病毒5基因組中，除去pBR插入物。還開發(fā)出能夠在HEK293A細(xì)胞中表達(dá)間日瘧原蟲的MSP-I19 (PvMSP-I19)疫苗抗原的非復(fù)制型(nonreplicant)人腺病毒類型5。病毒載體的使用可由以下事實(shí)確證其主要引起細(xì)胞免疫應(yīng)答，并且由于其用作佐劑，加強(qiáng)免疫應(yīng)答。為生產(chǎn)重組腺病毒 (AdMSP-I19),開發(fā)出基因的獨(dú)特克隆策略，所述基因編碼在pAdCMV-Link-Ι中的間日瘧原蟲的MSP-I19。由腺病毒表達(dá)的重組蛋白對(duì)應(yīng)于BELfiM品系間日瘧原蟲氨基酸序列MSP-1 的1616-1704，并在N末端區(qū)域具有組氨酸尾部以及在C末端具有與⑶4表位(pan等位基因DR表位(PADRE)的融合物(CUNHA等人，2002)。該重組蛋白質(zhì)還具有流感病毒的信號(hào)肽 (HASS)，其允許該蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外介質(zhì)中。由重組腺病毒表達(dá)的另ー疫苗抗原對(duì)應(yīng)于與流感病毒信號(hào)肽(HASS)融合的間日瘧原蟲AMA-I的胞外結(jié)構(gòu)域(其是指分離的間日瘧原蟲BEL-12的ft·,至Leu487殘基)， 該信號(hào)肽允許將AMA-I引導(dǎo)到細(xì)胞外介質(zhì)中，引起體液免疫應(yīng)答，導(dǎo)致特異性抗體產(chǎn)生。 如下產(chǎn)生重組病毒通過同源重組，插入到腺病毒基因組中，將間日瘧原蟲AMA-I的胞外結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)包含于pAdCMV-Link-Ι轉(zhuǎn)移載體中。由腺病毒表達(dá)的重組蛋白對(duì)應(yīng)于分離的BEL-12的間日瘧原蟲的AMA-I的43-487氨基酸序列，BEL-12來源于Bel6m_PA的患者，從質(zhì)粒 pHIS-AMA-I 中獲得(RODRIGUES, M. H. C. ；R0DRIGUES, K. M. ；OLIVEIRA, T. R.； COMODO5A. N. ；RODRIGUES, Μ. Μ. ；KOCKEN, C. H. Μ. ；THOMAS, Α. W. ；SOARES，I. S. Antibody response οι naturally infected individuals to recombinant Plasmodium vivax apical membrane antigen-l (自然感染個(gè)體對(duì)重組間日虐原蟲頂膜抗原1的抗體反應(yīng)).ht. J. Parasitol. v35，第185-192頁，2005)。該重組蛋白質(zhì)還具有流感病毒的信號(hào)肽 (HASS)，其允許將該蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外介質(zhì)中。為生產(chǎn)重組腺病毒(AdAMA-I)，建立了基因克隆策略，所述基因編碼在pAdCMV-Link-Ι中的間日瘧原蟲的AMA-1。復(fù)制缺陷型人腺病毒類型5可在HEK293A細(xì)胞中表達(dá)間日瘧原蟲的 AMA-I (PvAMA-I)疫苗抗原。病毒載體的使用可通過以下事實(shí)確證其主要引起細(xì)胞免疫應(yīng)答以及用作加強(qiáng)免疫應(yīng)答的佐劑。由重組腺病毒表達(dá)的疫苗抗原對(duì)應(yīng)于與流感病毒信號(hào)肽(HASS)融合的間日瘧原蟲的AMA-I的胞外結(jié)構(gòu)域(其是指分離的間日瘧原蟲BEL-12的 Pro43至Leu487殘基)，該信號(hào)肽允許將AMA-I引導(dǎo)到細(xì)胞外介質(zhì)中引起體液免疫應(yīng)答，導(dǎo)致特異性抗體產(chǎn)生。同源初免-加強(qiáng)方案在于在所有免疫接種中給予相同病毒載體或純化的重組蛋白(Ad/Ad、ftx)t/Pr0t、Ad/Ad/Ad或ftOt/Prot/ftOt)。本發(fā)明異源初免-加強(qiáng)方案基于重組腺病毒(人腺病毒類型5或HuAc^)、重組痘病毒(毒株WR、Copenhage或MVA)的序貫給予，所述病毒能夠(從酵母或細(xì)菌宿主中)表達(dá)普通的間日瘧原蟲異源蛋白或其純化重組形式的相同的間日瘧原蟲抗原。組合包括兩個(gè)或三個(gè)劑量的疫苗，前提是在相同的免疫接種方案中使用至少兩種不同的病毒載體或病毒載體加上純化的蛋白質(zhì)。給予初次劑量的腺病毒(Ad)或痘病毒(Pox)后，可用純化的病原體抗原蛋白(Prot)進(jìn)行初免-加強(qiáng)，或反過來。(例如 Ad/Pox、Ad/Prot、Prot/Ad、Prot/Pox、Ad/Ad/Prot、Prot/Prot/Ad、rot/Prot/ Pox, Ad/Ad/Pox)。使用的免疫接種之間的間隔為6-8周，并且不應(yīng)少于30日。本發(fā)明的各個(gè)方面將在下面通過實(shí)施例詳細(xì)描述。需要強(qiáng)調(diào)的是，本發(fā)明不限于這些實(shí)施例，而是還包括其中其起作用的范圍內(nèi)的變化和修飾。實(shí)施例I-DBPII重組腺病毒的構(gòu)建將基于區(qū)域II的引物設(shè)計(jì)成包含EcoRI和)(baI酶的酶限制性位點(diǎn)，這兩個(gè)位點(diǎn)用于將目標(biāo)序列插入PPIC9Z載體中以轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母，還用于在HASS-DBPII克隆入 PAdCMV-IinLysl后，將pTopoTA和后面的克隆插入pcDNA3. 1 HASS中以獲得流感病毒的 HASS信號(hào)肽。以同源方式將該最后的質(zhì)粒與PJM17進(jìn)行重組，產(chǎn)生表達(dá)DBPII的腺病毒。 將通過這些患者血清的PCR獲得的DBPII序列獨(dú)立克隆到質(zhì)粒中并在DBPII克隆階段采用相同的程序。說明間日瘧原蟲經(jīng)遺傳修飾的DBPII抗原的結(jié)構(gòu)
核苷酸的位置Wk.
M03ATG......GAA信號(hào)肽 HASS103-1091GGT.....GATDBII 序列 1091TAA終止密碼子實(shí)施例2-CS重組腺病毒的構(gòu)建進(jìn)行包含間日瘧原蟲的表位B (⑶RADGQPA)的表達(dá)乙肝病毒核心蛋白(HBcAg)(其中CS蛋白質(zhì)的表位位于該分子特異性點(diǎn))的人腺病毒類型5的構(gòu)建，并在HBcAg的免疫顯性環(huán)(即在78-79氨基酸之間)中重復(fù)三次。在HBcAg的N末端部分，存在流感病毒的血凝素蛋白的信號(hào)肽(信號(hào)肽HASS)。 HBcAg分子在核糖體進(jìn)入(ribosome entry)的內(nèi)部位點(diǎn)(IRES序列)所在的149氨基酸處截短。這種截短后，可得到包含B表位、TCD4和TCD8的間日瘧原蟲CS蛋白質(zhì)的許多部分。將這些部分置于由表位間隔基隔開的六個(gè)區(qū)組(block)中，促進(jìn)它們被細(xì)胞加工，區(qū)組如下區(qū)組1 來自Bel6m品系的CS蛋白質(zhì)的氨基酸1_23，其在每一側(cè)的AAY氨基酸序列 (間隔基)之間包含一個(gè)TCD8人表位；區(qū)組2 氨基酸沈5-272，其包含一個(gè)由AAY間隔基側(cè)接的TCD8人表位；區(qū)組3 氨基酸四2-378，其包含由AAY間隔基側(cè)接的B、TCD4和TCD8 表位；區(qū)組4 來自巨細(xì)胞病毒的TCD8鼠表位，由AAY間隔基側(cè)接；區(qū)組5 氨基酸301-309， 其包含一個(gè)由AAY間隔基側(cè)接的TCD8人表位；區(qū)組6 氨基酸51-9，其包含在N末端部分由 GPGPG間隔基側(cè)接，在C末端部分由終止密碼子側(cè)接的B和TCD4表位。此外，在HASS信號(hào)肽前面有BamHI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，以及在終止密碼子后面有BamHI和KpnI酶位點(diǎn)。實(shí)施例3-經(jīng)修飾的病毒MVA-CS或其它重組痘病毒的構(gòu)建轉(zhuǎn)移質(zhì)粒基本上由通用質(zhì)粒(例如pUC19)構(gòu)成，該質(zhì)粒加入有外來基因組的痘病毒和間日瘧原蟲序列或限定的真核表達(dá)序列(被稱為表達(dá)盒)(在圖6中示例給出)。圖6描繪了通用插入盒和表達(dá)盒。在5' -3'方向，插入盒由以下構(gòu)成與MVA基因組缺失區(qū)域II和/或缺失區(qū)域III的5'末端同源的核苷酸序列(1)；經(jīng)修飾的痘苗病毒的早期/晚期啟動(dòng)子O)；標(biāo)記蛋白質(zhì)-熒光綠蛋白質(zhì)(FGP)或熒光紅蛋白質(zhì)(FRP)的編碼基因⑶；目標(biāo)外源cDNA/基因的克隆位點(diǎn)(4)；痘苗病毒早期/晚期啟動(dòng)子(5)；與MVA 基因組的缺失區(qū)域II和/或缺失區(qū)域II的3'末端同源的核苷酸。然后，在先前用MVA、WR或Copenhage痘病毒株感染的雞胚細(xì)胞(CEC)中通過轉(zhuǎn)移質(zhì)粒(例如PLW17、pLW44、pSCll或等價(jià)痘病毒穿梭質(zhì)粒)的轉(zhuǎn)染產(chǎn)生重組體。病毒經(jīng)先平板純化然后擴(kuò)增克隆的連續(xù)循環(huán)來選擇和純化。實(shí)施例4-特異性 MSP-I19 引物(initiator)通過重組技術(shù)獲得的另一發(fā)明抗原是MSP-I蛋白質(zhì)。裂殖子表面蛋白(MSP-I) 是瘧原蟲物種寄生蟲的紅細(xì)胞內(nèi)時(shí)期的抗原。MSP-I作為190kDa的前體蛋白質(zhì)合成。該前體通過其GPI錨(糖基磷脂酰肌醇)附著于發(fā)育中的裂殖子表面。在裂殖子成熟過程中，MSP-I經(jīng)歷蛋白酶剪切過程，產(chǎn)生四個(gè)保持非共價(jià)締合到裂殖子表面的片段。當(dāng)發(fā)生紅細(xì)胞入侵時(shí)，第二次切割將19kDa的C末端片段與蛋白質(zhì)復(fù)合體分離開，并且僅將通過GPI錨與膜連接的部分轉(zhuǎn)移到新的受感染的紅細(xì)胞中(KAUTH, C. W. ；EPP, C. ；BUJARD, H. ；LUTZ, R. The merozoite surface protein 1 complex of human malaria parasite P. falciparum(人瘧疾寄生蟲惡性瘧原蟲的裂殖子表面蛋白1復(fù)合體).T. J. Biol. Chem. v278, n° 25，第 22257-22264 頁，2003)。編碼間日瘧原蟲蛋白質(zhì)的MSP-I19的基因序列通過PCR從pET_MSPI-PADRE質(zhì)粒擴(kuò)增，其中弓丨物為 5' GCA GAT ATC CATCAC CAT CAC CAT CAC(有義)禾口 5' AAG CTT TTA AGC GGC AGCCTT CAG GGT (反義)。這些密碼子分別是EcoRV和HindIII限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)，加下劃線的密碼子對(duì)應(yīng)終止密碼子。按照制造商的說明和在以下擴(kuò)增條件下，用可靠性高的酶Pfx(Invitrogen)進(jìn)行PCR反應(yīng)94°C下的5分鐘循環(huán)，94°C下40秒、45°C下45 秒以及68°C下1:30分鐘的38個(gè)循環(huán)，以及68°C下4分鐘的最后延伸循環(huán)。實(shí)施例5-克隆策略(MSP-I19)-克隆入pCR-Blunt II Τ0Ρ0 中
用來自克隆入pCR-blunt II TOPO 中的 pET-MSP_l19-PADRE 的 MSP-I19 特異性引物擴(kuò)增399pb的片段。在該克隆中產(chǎn)生了 TOPO-MSP-I19,并且

圖13顯示了陽性克隆選擇。-pAdCMV-Link 1 克隆在pAdCMV-Linkl 克隆中，載體和 TOPO-MSP-I19 克隆均用 EcoRV 和 HindIII 消化。 消化后，所需的片段用QIA快速凝膠提取OiIAGEN)試劑盒純化。純化后，將其克隆入載體中。在該克隆中產(chǎn)生了 pAdCMV-MSP-l19。如圖14所示，用EcoRV和HindIII消化后，陽性克隆呈現(xiàn)388pb的片段。-在pAdCMV-MSP-Ι 中克隆 HASS 信號(hào)肽用BglII消化PAdCMV-MSP-I19來線性化質(zhì)粒，然后用BamHI消化pAd32. 1，產(chǎn)生717pb的片段。消化后，將片段如前所述進(jìn)行純化和連接。在該克隆中產(chǎn)生了部分 pAdCMV-HASS-MSP-l19。用NotI進(jìn)行陽性克隆選擇。如圖15所示，在陽性克隆中發(fā)現(xiàn)1200pb 的片段。-用EcoRV 消化 pAdCMV-MSP-Ι/ 部分用EcoRV消化陽性pAdCMV-HASS-MSP_l19/部分克隆，用于提取625個(gè)額外堿基。然后將線性化的質(zhì)粒從凝膠中切除，純化和用T4DNA連接酶進(jìn)行再環(huán)化，導(dǎo)致最初 pAdCMV-HASS-MSP-l19的形成。如圖15所示，陽性克隆選擇通過用NotI消化來完成。實(shí)施例6-對(duì)用重組腺病毒感染的HEK293A細(xì)胞進(jìn)行PCR和RT-PCR以證實(shí)轉(zhuǎn)基因的存在用對(duì)MSP-I特異的引物自DNA和RNA獲得400pb的擴(kuò)增物，所述DNA和RNA提取自用AdMSP-I19重組病毒感染的HEK293A細(xì)胞。進(jìn)行總RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)并用DNA酶處理產(chǎn)生的cDNA。除擴(kuò)增500pb片段的腺病毒E4基因的特異性引物之外，我們還使用特異性 MSP-I引物。這些來自病毒DNA和RNA的擴(kuò)增物表明，重組腺病毒正在表達(dá)MSP_119。圖16 顯示了這些擴(kuò)增物。實(shí)施例7-用抗體檢測(cè)重組蛋白質(zhì)用AdMSP-I19重組腺病毒感染的HEK293A細(xì)胞提取物經(jīng)蛋白質(zhì)印跡分析表明，其與用MSP-I19免疫的BALB/c小鼠的血清具有高度反應(yīng)性。該結(jié)果證實(shí)了 MSP-I19通過AdMSP-I19 表達(dá)。用200 μ 1帶有20 μ g純化的AMA-I蛋白質(zhì)的乳劑Montanide ISA 720(30 70蛋白質(zhì)/油)于皮下免疫動(dòng)物。進(jìn)行間隔為3周的兩次免疫接種。在每次免疫接種中，在動(dòng)物背部的4個(gè)不同區(qū)域施加50 μ 1，總共200 μ 1。最后一次免疫接種后14天收集血清。用 AdMSP-I19重組腺病毒感染的相同的ΗΕΚ293Α細(xì)胞提取物還顯示出與來自瘧疾流行區(qū)的患者的血清的反應(yīng)性。圖17和18分別顯示了重組蛋白質(zhì)與鼠和人血清的反應(yīng)性。實(shí)施例8-ΑΜΑ-1的特異性引物編碼間日瘧原蟲蛋白質(zhì)的AMA-I的序列通過PCR從質(zhì)粒pHIS-ΑΜΑ-Ι擴(kuò)增，其中引物為 5' GCA GAT ATC GGC AGC AGCCAT CAT CAT (有義)禾P 5' GGT ACC TTA TAG TAG CAT CTG CTTGTT(反義)。高亮的密碼子分別是EcoRV和KpnI限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)，以及加下劃線的密碼子對(duì)應(yīng)終止密碼子。按照制造商的說明和在以下擴(kuò)增條件下，用可靠性高的酶 Pfx (Invitrogen)進(jìn)行PCR反應(yīng)94°C下的5分鐘循環(huán)，94°C下40秒、45°C下45秒以及68°C 下1:30分鐘的38個(gè)循環(huán)，以及68°C下4分鐘的最后延伸循環(huán)。實(shí)施例9-克隆策略
-克隆入pAdCMV-link 1 中用限制性內(nèi)切酶EcoRV和HindIII消化對(duì)應(yīng)于AMA-1和pAdCMV-Linkl的PCR產(chǎn)物(圖21)。消化后，所需的片段用QIA快速凝膠提取OiIAGEN)試劑盒純化和連接。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-I藍(lán)細(xì)菌。因此，產(chǎn)生了 pAdCMV-AMA-1。圖21顯示了陽性克隆的選擇。-將HASS信號(hào)肽克隆入pAdCMV-AMA-Ι中使用包含HASS信號(hào)肽的pAd32. 1。用BglII消化pAdCMV-AMA-l來線性化質(zhì)粒并用BamHI消化pAd32. 1以產(chǎn)生717pb的片段，其中92個(gè)堿基對(duì)應(yīng)于HASS以及余下的625 個(gè)堿基被用于促進(jìn)克隆(圖22)。BglII和BamHI具有匹配的末端，S卩，用BglII產(chǎn)生的末端可直接與BamHI的末端連接，但它們的限制性位點(diǎn)并不重新生成，如圖23所示。消化后，接著將片段進(jìn)行如前所述的純化和連接。在該克隆中產(chǎn)生了部分 pAdCMV-HASS-AMA-Ι。用NotI進(jìn)行陽性克隆選擇，其中陽性克隆呈現(xiàn)2200pb的片段，以及陰性克隆呈現(xiàn)1500pb的片段。圖M顯示了陽性克隆的選擇。-用EcoRV 消化 pAdCMV-HASS-AMA-Ι/ 部分為提取625個(gè)額外堿基，用EcoRV消化pAdCMV-HASS-AMA-Ι陽性克隆。從瓊脂糖凝膠中切除8176個(gè)堿基的較大片段，用QIA快速凝膠提取OiIAGEN)試劑盒進(jìn)行純化。用 T4DNA連接酶重新連接線性化的質(zhì)粒，產(chǎn)生pAdCMV-HASS-AMA-Ι。圖25顯示了該克隆階段。實(shí)施例10-對(duì)用重組腺病毒感染的HEK293A細(xì)胞進(jìn)行PCR和RT-PCR以證實(shí)轉(zhuǎn)基因的存在從用AdAMA-I重組病毒感染的HEK293A細(xì)胞提取的DNA和RNA中，使用AMA-I特異性引物獲得1.41Λ的擴(kuò)增物。對(duì)總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)并用DNA酶處理產(chǎn)生的cDNA。除了 AMA-I特異性引物之外，我們還使用擴(kuò)增500pb片段的腺病毒E4基因的特異性引物。這些來自DNA病毒和RNA病毒的擴(kuò)增物表明，重組腺病毒正在表達(dá)AMA-I。圖沈顯示了這些擴(kuò)增物。實(shí)施例11-用抗體檢測(cè)重組蛋白質(zhì)通過蛋白質(zhì)印跡用抗體檢測(cè)重組蛋白質(zhì)。用重組蛋白質(zhì)免疫的小鼠BALB/c血清被用作初級(jí)抗體。作為次級(jí)抗體，使用與過氧化物酶(Zymed)綴合的抗小鼠。用AdAMA-I重組腺病毒感染的HEK293A細(xì)胞提取物顯示其與用AMA-I免疫的 BALB/c小鼠的血清具有高度反應(yīng)性。該結(jié)果證實(shí)了 AMA-I通過AdAMA-I表達(dá)。用200 μ 1 具有20 μ g純化的AMA-I蛋白質(zhì)的乳劑Montanide ISA 720(30 70蛋白質(zhì)/油)于皮下免疫動(dòng)物。進(jìn)行間隔為3周的兩次免疫接種。在每次免疫接種中，在動(dòng)物背部的4個(gè)不同區(qū)域施加50 μ 1，總共200 μ 1。最后一次免疫接種后14天收集血清。圖27顯示了 AMA-I 與大腸桿菌和AdAMA-I中表達(dá)的鼠血清的反應(yīng)性。附圖簡(jiǎn)述圖01 在pTopoTA質(zhì)粒的EcoRI和)(bal位點(diǎn)通過PCR擴(kuò)增的DBPII克隆。圖 02 在 pcDNA3. IHASS 的 EcoRI 和 XbaI 酶促位點(diǎn)中用 EcoRI 和 XbaI 酶自 ρ^ΓοροΤΑ 提取DBPII克隆以加入HASS信號(hào)肽。對(duì)三名患者采用相同的程序ΑΜ、ΜΤ和ΡΑ。圖 03 (A)pAdCMV-linkl-HASS-DBP AM、MT 和 PA 中克隆位點(diǎn)的示意圖。(B)CMV 啟動(dòng)子和SV40尾部。將DBP AM克隆入該質(zhì)粒的EcoRV位點(diǎn)。箭頭表示這些引物的位置。圖4:表示在用于產(chǎn)生表達(dá)DBPII的腺病毒的HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染期間發(fā)生在 pAdCMV-link-Ι和pJM17之間的同源重組的圖。圖5:用于通過電穿孔轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母的pPIC9Z載體中的DBPII克隆圖?？寺∪雙AdCMV-linkl的序列將通過EcoRI和XbaI酶提取，從而配置信號(hào)肽HASS序列。在各自的EcoRI和)(bal位點(diǎn)將DBPII克隆入pPIC9Z中，DBPII將具有作為信號(hào)肽的pPIC9z表達(dá)系統(tǒng)中存在的釀酒酵母的會(huì)面-α因子(meeting-alpha factor)。在DBPII序列的末端有六個(gè)組氨酸殘基。圖06(1)顯示其以下部分的疫苗重組蛋白圖HASS信號(hào)肽的氨基酸序列HBcAg的氨基酸序列(aa 1-78以及后面的aa 79-149)和從CS蛋白質(zhì)獲得的表位。1.重復(fù)部分，包含表位B和T⑶42. CS蛋白質(zhì)的信號(hào)肽(表位T CD8_aa 1-23)3.對(duì)HLA-B;35-等位基因特異的表位T CD8aa 264-2724. CS蛋白質(zhì)的C末端部分-aa四2_378(表位8、1 CD4和TCD8)5.鼠 T CD8 表位6.對(duì)HLA-A2-等位基因特異的T CD8表位aa 301-3097. CS蛋白質(zhì)的N末端部分aa 51_90(表位B和T CD4)終止密碼子圖07 O) :PAdCMV-link-l質(zhì)粒圖，顯示與Ad5基因組同源的區(qū)域、巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、聚腺苷酸化位點(diǎn)和克隆位點(diǎn)。圖08(3) (A)用于構(gòu)建MVA重組病毒的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒；B)包含以下基因元件的插入和表達(dá)盒的細(xì)節(jié)與MVA基因組缺失II區(qū)域和/或缺失III區(qū)域的5'部分同源的核苷酸序列(1)；痘苗病毒經(jīng)修飾的早期/晚期啟動(dòng)子O)；綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)或紅色熒光蛋白質(zhì)(RFP)標(biāo)記蛋白質(zhì)的編碼基因(3)；目標(biāo)外源cDNA/基因的克隆位點(diǎn)(4)；痘苗病毒經(jīng)修飾的早期/晚期啟動(dòng)子(5)；與MVA基因組的缺失II區(qū)域和/或缺失III區(qū)域的3'部分同源的核苷酸序列。圖9 :A-pAdCMV-Link-l轉(zhuǎn)移載體巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(CMV)、克隆位點(diǎn)、聚腺苷化位點(diǎn)(聚A)、與HAdV5同源的區(qū)域。m.u.圖距單位。B.克隆入pAdCMV-Link-l的 HASS-MSP-119。將信號(hào)肽克隆入Bg/II位點(diǎn)，克隆后該位點(diǎn)消除；將MSP-119克隆入EcoRV和 HindIII 位點(diǎn)。* 用于克隆 HASS-MSP-1 的酶位點(diǎn)BglII、EcoRV 和 HindIII。圖10 :pJM17質(zhì)粒包含由位于)(bal位點(diǎn)之間的El區(qū)域的插入物(pBRX)修飾的人類型5腺病毒基因組。圖11 :pAdCMV-HASS-MSP-l19和pJM17質(zhì)粒之間同源重組的示意圖 pAdCMV-HASS-MSP-l19中的同源區(qū)域(Ad 0-1和Ad 9-16)經(jīng)歷與pJM17的配對(duì)和重組，并且將表達(dá)盒MSP-I19轉(zhuǎn)移到腺病毒5的基因組中，通過pBRx插入消除El。圖12 克隆位點(diǎn)pAdCMV-MSP-l19、CMV啟動(dòng)子和SV40聚A尾部的示意圖。對(duì)應(yīng)于 HASS-MSP-I19的序列位于NotI和HindIII位點(diǎn)之間。引物的位置用箭頭表示。
圖13 通過用EcoRV和HindIII限制性內(nèi)切酶消化以及用BamHI、EcoRV和HindIII 酶消化相同的克隆進(jìn)行陽性克隆選擇。PM:標(biāo)準(zhǔn)分子量。IOOpb !Iomega，1 未經(jīng)消化的克隆，2 用 BamHI 消化的(387pb)，3 用 HindIII 消化的(454pb), 4 用 EcoRV 消化的(412pb)，
5用 EcoRV 和 HindIII 消化的(388pb)。圖14 通過用EcoRV和HindIII限制性內(nèi)切酶消化進(jìn)行陽性克隆選擇。 PAdCMV-MSP-I19陽性克隆產(chǎn)生388pb的片段。PM Ikb Invitrogen0泳道1-4 陽性克隆。圖15 將HASS克隆到pAdCMV-MSP_l19中的過程1 采用NotI消化陽性克隆 pAdCMV-HASS-MSP-l19部分，產(chǎn)生1200pb的片段。2 用EcoRV消化相同的克隆，產(chǎn)生625pb 的片段，該片段在載體中消除。3 新克隆pAdCMV-HASS-MSP-l19，其當(dāng)用NotI消化時(shí)生成對(duì)應(yīng)于HASS-MSP-I19的序列的560pb片段。圖16 來自病毒DNA和RNA的PCR和RT-PCR，所述病毒DNA和RNA從用AdMSP-I19 感染的HEK293A中提取。用對(duì)10^-119特異的引物獲得400pb的擴(kuò)增子(泳道1_4 病毒DNA， 9-12泳道病毒RNA)并用對(duì)腺病毒E4基因特異的引物獲得500pb的擴(kuò)增子(泳道5_8 病毒 DNA，泳道 14-16 病毒 RNA)。PM IOOpb Promega, 1 :CP(陽性對(duì)照):pAdCMVMSP_l19， 2 經(jīng) 1 5 稀釋的 DNA, 3 經(jīng) 1 10 稀釋的 DNA, 4 =CN(陰性對(duì)照)，5 :CP :pAdCMVMSP_l19，
6經(jīng) 1 5 稀釋的 DNA，7 經(jīng) 1 10 稀釋的 DNA，8 :CN，9 =CP :pAdCMVMSP_l19，10 未經(jīng)稀釋的 cDNA，ll:經(jīng) 1 5 稀釋的 cDNA，12 經(jīng) 1 10 稀釋的 cDNA，13 :CN，14 經(jīng) 1 5 稀釋的 cDNA，15 45l 10 稀釋的 cDNA，16 :CN圖17 在大腸桿菌中表達(dá)和由腺病毒表達(dá)的MSP-I19重組體，其通過特異性抗體經(jīng)由利用經(jīng)MSP-I19免疫動(dòng)物的血清的蛋白質(zhì)印跡測(cè)定來檢測(cè)。rMSP-l19 在大腸桿菌中表達(dá)的，CN 陰性對(duì)照，AdMSP-I 由重組腺病毒表達(dá)的。圖18 在大腸桿菌中表達(dá)和由腺病毒表達(dá)的MSP-I19重組體，其通過特異性抗體經(jīng)由利用瘧疾流行區(qū)的患者的血清的蛋白質(zhì)印跡測(cè)定來檢測(cè)。rMSP-l19 在大腸桿菌中表達(dá)的，CN 陰性對(duì)照，AdMSP-I 由重組腺病毒表達(dá)的。圖19 =A :PAdCMV-Link-l轉(zhuǎn)移載體巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子、克隆位點(diǎn)、聚腺苷化(聚A)位點(diǎn)、與HAdV5同源的區(qū)域。m.u.圖距單位。B.克隆入pAdCMV-Link-l的 HASS-AMA-1。將信號(hào)肽克隆入Bg/II位點(diǎn)，克隆后該位點(diǎn)將消除，并將AMA-I克隆入EcoRV 和KpnI位點(diǎn)。*用于克隆HASS-AMA-I的酶位點(diǎn)=BglIKEcoRV和KpnI。圖20 :pAdCMV-HASS-AMA-l和pJM17質(zhì)粒之間同源重組的示意圖 pAdCMV-HASS-AMA-Ι中的同源區(qū)域(Ad 0_1和Ad 9-16)經(jīng)歷與pJM17的配對(duì)和重組，并且將帶有AMA-I的表達(dá)盒轉(zhuǎn)移到腺病毒5的基因組中，通過pBR插入消除E1。圖21 通過用EcoRV和KpnI限制性內(nèi)切酶消化來選擇陽性克隆。陽性克隆產(chǎn)生 1431pb 的片段。PM:lkb promega, 1-4 pAdCMV-AMA-l 陽性克隆。圖22 :pAd32. 1的717pb片段的示意圖，將該片段插入pAdCMV-AMA_l中，其中起始的92個(gè)堿基對(duì)應(yīng)HASS序列。圖23 具有匹配末端的BamHI和BglII限制性位點(diǎn)。圖M 通過用NotI消化來進(jìn)行陽性克隆選擇。陽性克隆產(chǎn)生2200pb的片段。PM Ikb promega, 2,4 陽性克隆，6 陰性克隆，1、3和5 泳道2、4和6中各自的克隆未經(jīng)消化的DNA質(zhì)粒。
圖25 將HASS克隆到pAdCMV-AMA-l中的過程1 采用NotI消化陽性克隆 pAdCMV-HASS-AMA-Ι部分，產(chǎn)生2200pb的片段。2 用EcoRV消化相同的克隆，產(chǎn)生625pb的片段，該片段從載體中消除。3 :新克隆pAdCMV-HASS-AMA-1，其當(dāng)用NotI消化時(shí)產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于HASS-AMA-I的序列的1600pb片段。圖26 來自病毒DNA和RNA的PCR和RT-PCR，所述病毒DNA和RNA從用AdAMA-I感染的HEK293A中提取。用對(duì)腺病毒E4基因特異的引物獲得500pb的擴(kuò)增子(泳道1_3 病毒DNA，泳道4-7 病毒RNA)并用對(duì)AMA-1特異的引物獲得1. 4Kb的擴(kuò)增子(泳道8-11 病毒 DNA,泳道 12-16 病毒 RNA)。1 :CP (陽性對(duì)照):pAdCMVAMA-l, 2 病毒 DNA, 3 =CN(陰性對(duì)照)，4 用 DNA 酶處理的 RNA 的 RT-PCR，5 用 DNA 酶處理的 RNA 的 PCR，6 :CP :pAdCMVAMA-l, 7 :CN,8 標(biāo)準(zhǔn)分子量 1Kb Promega,9 :CP :pAdCMVAMA-l, 10 病毒 DNA，11 :CN，12 用 DNA 酶處理的 RNA 的 RT-PCR，13 用 DNA 酶處理的 RNA 的 PCR，14 =CN, 15 =CP0圖27 在大腸桿菌中表達(dá)和由腺病毒表達(dá)的AMA-I重組體，其通過使用經(jīng)AMA-I 免疫的動(dòng)物血清的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)。rAMA-1 (在大腸桿菌中表達(dá)的)，AdAMA-I (由腺病毒表達(dá)的)，CN:陰性對(duì)照。
權(quán)利要求
1.經(jīng)遺傳修飾的間日瘧原蟲抗原序列，其中DNA序列選自IDn° (1), Seq. ID n° (2)、kq.IDn° (3)、kq.IDn° (4)、kq.IDn° (5)和 kq. ID n° (6)。
2.DBP MSP-I AMA-I CS重組蛋白質(zhì)，其中氨基酸序列選自Seq. ID n° (1) > Seq. ID n° (2)、kq.IDn° (3)、kq. ID n° (4)、kq.IDn° (5)和 kq. ID n° (6)。
3.表達(dá)重組抗原的經(jīng)遺傳修飾的病毒，其包括単獨(dú)或一起表達(dá)％(1.ID n° (1), Seq. ID n° (2)、kq.IDn° (3)、kq.IDn° (4)、kq.IDn° (5)和 kq. ID n° (6)。
4.權(quán)利要求3的表達(dá)重組抗原的經(jīng)遺傳修飾的病毒，其中所述病毒選自腺病毒和/或痘病毒。
5.權(quán)利要求4的表達(dá)重組抗原的經(jīng)遺傳修飾的病毒，其中人腺病毒包括血清型5。
6.權(quán)利要求5的表達(dá)重組抗原的經(jīng)遺傳修飾的病毒，其中痘苗病毒包括WR毒株或 Copenhagen毒株、經(jīng)修飾的Ankara病毒(MVA)或痘病毒的其它毒株。
7.針對(duì)瘧疾的疫苗組合物，包含抗原性純化的權(quán)利要求2中定義的重組蛋白質(zhì)和/或權(quán)利要求3-6中定義的表達(dá)重組抗原的經(jīng)遺傳修飾的病毒以及至少ー種生理學(xué)上可接受的載體。
8.權(quán)利要求7的針對(duì)瘧疾的疫苗組合物，其可與其它治療組合物、疫苗組合物、抗原組合物或免疫學(xué)組合物共同給予或序貫給予。
9.權(quán)利要求8的針對(duì)瘧疾的疫苗組合物，其可與足以加強(qiáng)CD8+和/或CD4+免疫應(yīng)答的其它物質(zhì)例如白細(xì)胞介素或CD配體共同給予或序貫給予。
10.針對(duì)瘧疾的疫苗組合物，其通過ロ服、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下或透皮途徑遞送，或作為可植入或注射的裝置遞送。
11.權(quán)利要求7-10的針對(duì)瘧疾的疫苗組合物，其用于制備用于預(yù)防瘧疾的藥物。
12.利用重組病毒遞送瘧疾疫苗的方法，其包括在初免-加強(qiáng)方案中使用人腺病毒和/ 或痘病毒和/或重組蛋白質(zhì)。
13.權(quán)利要求12的利用重組病毒遞送瘧疾疫苗的方法，其包括兩次序貫的免疫接種。
14.權(quán)利要求13的利用重組病毒遞送瘧疾疫苗的方法，其中初次免疫接種包括使用人腺病毒血清型5或重組蛋白質(zhì)，并且加強(qiáng)免疫接種包括使用人腺病毒血清型5或者痘苗病毒W(wǎng)R毒株或Copenhagen毒株或經(jīng)修飾的Ankara (MVA)或其它痘病毒毒株或者純化的重組蛋白質(zhì)。
15.權(quán)利要求14的利用重組病毒遞送瘧疾疫苗的方法，包括兩次免疫接種之間6-8周的間隔。
全文摘要
本發(fā)明涉及經(jīng)修飾的遺傳序列(包括間日瘧原蟲的抗原序列(DBP-PA、DBP-AM、DBP-MT、AMA-1、CS和MSP-1))的構(gòu)建、由所述序列編碼的相應(yīng)重組蛋白質(zhì)以及表達(dá)這些重組抗原的經(jīng)遺傳修飾的病毒。另外，本發(fā)明還涉及使用腺病毒或痘病毒載體的初免-加強(qiáng)接種方法、用于哺乳動(dòng)物免疫接種的純化的蛋白質(zhì)以及待用作針對(duì)瘧疾的疫苗的疫苗組合物。
文檔編號(hào)C12N15/30GK102575256SQ200980160391
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2009年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月5日
發(fā)明者B·德安德拉德佩賴?yán)? C·利馬卡拉拉, C·費(fèi)賴?yán)柧S斯德布里托, F·達(dá)方塞卡吉馬雷斯, I·索亞雷斯, L·E·馬杜羅布伊萊特, M·C·達(dá)方塞卡, M·馬丁斯羅德里古斯, O·布魯納羅梅羅, R·托斯特斯加齊內(nèi)利 申請(qǐng)人:米納斯吉拉斯州聯(lián)邦大學(xué)