一種編碼三種活化型生長因子的序列及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種同時表達IGF1、EGF和FGF2三種生長因子的編碼序列，利用本發(fā)明提供的編碼序列，可以構建相應的表達載體，通過導入細胞而高效穩(wěn)定地分泌具有生物活性的IGF1、EGF和FGF2三種生長因子，用于各種需要添加這三種生長因子的研究。與傳統(tǒng)的添加各種重組生長因子相比，解決了由于細胞生長對生長因子的持續(xù)消耗而添加外源重組生長因子不能夠穩(wěn)定維持濃度的問題，也避開了各種商品化重組生長因子價格昂貴的缺點。另外構建的表達載體可根據(jù)需要選擇轉染不同細胞，構建各種不同的細胞共培養(yǎng)體系，實現(xiàn)豐富靈活的應用，將需要同時添加外源生長因子和采用共培養(yǎng)體系的工作步驟大大簡化，也減少了成本。
【專利說明】—種編碼三種活化型生長因子的序列及其應用

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬生物技術，涉及多個基因同時表達，具體地說，涉及一種可以在同一轉錄物上編碼三種可分泌的活化的生長因子IGFUEGF和FGF2的序列。該序列可以用于構建真核細胞表達載體，并能夠在導入真核細胞后在細胞中同時穩(wěn)定表達上述無需加工直接具有活性的三種生長因子并分泌到細胞外。

【背景技術】
[0002]近年來，隨著干細胞相關機制研究的深入及以各種方式獲取干細胞的努力不斷取得新的成果，干細胞巨大的分化潛能在修復和受損器官的再生方面顯示出了廣泛的應用前景，為多種疾病的治療帶來了希望。干細胞是一類能進行自我更新的多潛能細胞，在一定條件下可誘導分化成為多種組織細胞類型。根據(jù)來源不同，通過模擬體內(nèi)特定細胞的正常分化成熟過程 ，干細胞可以被分別誘導分化為神經(jīng)細胞、心肌細胞、各種血細胞、內(nèi)耳細胞等終末分化的功能細胞。影響干細胞分化的因素很多，機制復雜。利用干細胞進行疾病治療時，需要將干細胞有效地定向分化為特定類型的功能細胞，并且需要一定的分化細胞數(shù)量和純度，以達到較好的療效并盡量減少不良反應。為了達到這一目的，通常需要根據(jù)情況在培養(yǎng)體系中加入各種外源生長因子。在所有外源添加的生長因子中，胰島素樣生長因子I(IGF1)、表皮生長因子(EGF)和成纖維細胞生長因子2 (FGF2)是應用最多的生長因子。這三種生長因子通常同時使用，它們是強有力的促有絲分裂原，受體分布廣泛，不僅能夠維持細胞生存，促進細胞增殖，還參與多種細胞的分化過程，調(diào)節(jié)細胞的活動和功能。
[0003]另外，在很多腫瘤學研究中，原代腫瘤細胞或細胞系的生長也有許多情況下需要添加上述生長因子，以利于原代腫瘤細胞在離體后的存活、生長以及進行靶向藥物研究時檢測腫瘤細胞對相應生長因子或受體的依賴性。如研究表皮生長因子受體(EGFR)小分子抑制劑的作用及機制時需要添加相應的生長因子EGF來刺激腫瘤細胞生長、研究成纖維生長因子受體(FGFR)抑制劑類藥物的作用機制時需要添加相應的生長因子通常為FGF2、研究腫瘤干細胞特性的球體形成實驗中也需要在無血清培養(yǎng)液中添加兩種生長因子EGF和FGF2。
[0004]但是由于生長因子本身在培養(yǎng)液中的穩(wěn)定性受其半衰期影響，而細胞生長對生長因子的需求又是持續(xù)的，人為添加重組生長因子不能穩(wěn)定地維持其作用，而且重組生長因子本身價格也很昂貴。因此如果能夠通過細胞穩(wěn)定表達有活性的生長因子，則可有效地在培養(yǎng)過程中穩(wěn)定地維持生長因子的濃度。
[0005]因此可以通過構建可同時表達活化型IGF1、EGF和FGF2三種生長因子的表達載體、并導入到相應的細胞中(如建立用于共培養(yǎng)體系的工程細胞)，得到同時穩(wěn)定表達三種生長因子的細胞系，用于進一步的研究，如與干細胞建立共培養(yǎng)體系，利用工程細胞持續(xù)穩(wěn)定的分泌三種生長因子，誘導干細胞向特定細胞分化；與原代腫瘤細胞共培養(yǎng)，維持其體外生存、生長及增殖。
[0006]在真核細胞中，目的基因表達主要受到轉錄(包括轉錄后加工)和翻譯(包括翻譯后加工)兩個水平的調(diào)控。在轉錄水平常常通過采用強啟動子(如CMV啟動子)來達到高水平的穩(wěn)定的轉錄，而轉錄物盡量僅包括成熟的mRNA開放讀框以避免需要額外的轉錄后加工(影響產(chǎn)生最終可供翻譯的轉錄產(chǎn)物的效率)；而在翻譯水平的調(diào)控則包括能夠增強翻譯起始、引導蛋白質(zhì)定位(如分泌所需的信號肽)以及同樣盡量減少合成的蛋白質(zhì)為體現(xiàn)功能或活性而對翻譯后加工的需求
因此，在本發(fā)明中我們按照如圖1所示的設計思路，將IGFUEGF和FGF2三個生長因子編碼序列串聯(lián)連接，使它們在細胞內(nèi)表達時可以處于同一個轉錄物上，即一次轉錄即可表達同時表達三種生長因子；為了減少翻譯后加工效率對最終蛋白質(zhì)產(chǎn)物的影響，使生長因子蛋白質(zhì)合成后不必加工即有活性，我們沒有采用完整的三種生長因子的編碼序列，而是僅僅克隆了包含三種生長因子加工后有活性的部分編碼序列；為了有效地使表達的生長因子分泌到細胞外，我們在每個生長因子前都融合了人免疫球蛋白1、輕鏈的信號肽；由于每個生長因子均為有起始密碼和終止密碼的獨立編碼框，因此我們在三個因子編碼序列之間加上核糖體內(nèi)部進入位點(Internal ribosome entry site, IRES),以保證三個生長因子均能有效地被核糖體識別而翻譯成相應的蛋白質(zhì)；為了提高翻譯起始識別的效率，我們在每個生長因子編碼序列起始密碼前都添加了真核細胞中保守的Kozak序列。
[0007]根據(jù)上述設計，我們發(fā)明了一個同時編碼IGF1、EGF和FGF2三種活化生長因子的人工序列，該序列可以用于進一步構建到表達載體上，并通過導入到細胞中，同時表達出三種具有生物活性的生長因子。
[0008]本發(fā)明可用于各種需要提供穩(wěn)定外源IGFl、EGF和FGF2的研究，包括但不僅限于干細胞相關研究及腫瘤相關研究。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的是提供一種同時表達IGF1、EGF和FGF2三種生長因子的編碼序列，具有如SEQ ID No:1所示的核苷酸序列。其中第7位至第14位、第888位至第895位和第1718位至第1725位為Kozak序列?’第15位至第77位、第896位至第958位和第1726位至第1788位為Igk信號肽編碼序列；第297位至第881位和第1127位至1711位為IRES序列?’第78至290位為活化型IGFl編碼序列?’第959位至第1120位為活化型EGF編碼序列；第1789位至2256位為活化型FGF2編碼序列。
[0010]本發(fā)明的另一個目的是提供該編碼序列的應用。該編碼序列用于構建真核表達載體，在導入細胞(如293T細胞)后，可以穩(wěn)定高效地表達IGFUEGF和FGF2三種活化的生長因子，用于進一步和各種研究。
[0011]本發(fā)明同現(xiàn)有技術相比具有以下優(yōu)點及效果:
利用本發(fā)明提供的編碼序列，可以構建相應的表達載體，通過導入細胞而高效穩(wěn)定地分泌具有生物活性的IGF1、EGF和FGF2三種生長因子，用于各種需要添加這三種生長因子的研究。與傳統(tǒng)的添加各種重組生長因子相比，解決了由于細胞生長對生長因子的持續(xù)消耗而添加外源重組生長因子不能夠穩(wěn)定維持濃度的問題，也避開了各種商品化重組生長因子價格昂貴的缺點。另外構建的表達載體可根據(jù)需要選擇轉染不同細胞，構建各種不同的細胞共培養(yǎng)體系，實現(xiàn)豐富靈活的應用，將需要同時添加外源生長因子和采用共培養(yǎng)體系的工作步驟大大簡化，也減少了成本。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為IGFl、EGF和FGF2三種因子編碼序列的設計示意圖。
[0013]圖2 IRES序列、Ig K信號肽編碼序列和活化型EGF編碼序列的克隆。
[0014]圖3慢病毒載體的構建及鑒定。
[0015]圖4慢病毒感染HEK293T細胞。
[0016]圖5 Western blot檢測生長因子表達。
[0017]圖6 CCK-8檢測A549細胞增殖。

【具體實施方式】
[0018]本發(fā)明結合附圖和具體實施例作進一步說明。這些實施例僅用于說明，但不限制本發(fā)明。
[0019]實施例1:1RES序列、Ig k信號肽編碼序列、活化型EGF、IGF1和FGF2編碼序列的克隆與合成。
[0020]IRES序列的克隆:
采用PCR方法從pIRES2-EGFP質(zhì)粒中克隆出IRES。引物分別為 IRES-F (SEQ ID No: 2): 5’ -ACTAGTGCCCCTCTCCCTCCCCCC-3?,
IRES-R (SEQ ID No:3): 5，-TCTAGATGTGGCCATATTATCATCGTG-3，(下劃線部分分別為引入的5^ 1和油<3 I酶切位點)。
[0021]PCR擴增條件是94°C變性5min，然后94°C變性30sec、58°C退火30sec、72°C延伸30sec，共30個循環(huán)，最后72°C延伸7min。擴增產(chǎn)物(597bp，圖2A)通過2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并按照QIAGEN的QIAquicK Gel Extract1n Kit說明書進行切膠回收。取3 μ I切膠回收產(chǎn)物與pGEM-T Easy Vector連接，在T4 DNA連接酶作用下16°C連接過夜。連接產(chǎn)物轉化到DH5 α感受態(tài)細胞中，氨芐青霉素抗性平板篩選培養(yǎng)，挑取陽性克隆，經(jīng)EcoRI酶切鑒定正確后測序驗證。
[0022]Ig K信號肽編碼序列的克隆:
采用PCR方法從pSecTag2A質(zhì)粒中克隆出Ig K信號肽編碼序列。引物分別為Ig K _F(SEQ ID No:4): 5，-ACT AGT TAG CCA CCA TGG AGA CAG AC-3’(下劃線部分為引入的分eI酶切位點，斜體加粗部分為引入的Kozak序列)；Ig κ-R (SEQ ID No:5): 5’-GTC ACCAGT GGA ACC TGG AA_3’。PCR擴增條件同上，擴增片段大小為77bp (圖2A)，同上方法克隆并測序驗證。
[0023] 活化型EGF編碼序列的克隆:
以Trizol法提取大腸癌細胞SW620的總RNA，采用Promega公司的逆轉錄試劑M-MLVReverse Transcriptase逆轉錄合成cDNA,再以此cDNA為模板，PCR擴增出EGF編碼序列。引物分別為 EGF-F (SEQ ID No: 6): 5’ -TTCCAGGTTCCACTGGTGACkkTkQTQkCTCTQkkTQTCCCC-3，(斜體加粗部分為引入的Ig丨、信號肽下游互補序列)，EGF-R (SEQ ID No: 7): 5f-JCTAGAmCGCAGTTCCCACCACTTCA-3’(下劃線部分為引入的油a I酶切位點，斜體加粗部分為引入的終止密碼)，PCR擴增條件同上，EGF片段大小為188bp (圖2A)，同上方法克隆并測序驗證。
[0024]以Ig K信號肽和EGF編碼序列片段為模板，分別以Ig K-F (SEQ ID No:4)和EGF-RCSEQ ID No: 7)為上下游引物進行overhangPCR擴增，擴增條件同上，擴增獲取245bpIg K -EGF目的片段(圖2B)，同上方法克隆PCR產(chǎn)物并測序驗證。
[0025]活化型IGFl和FGF2編碼序列的合成:
帶有Kozak序列和Ig K信號肽編碼序列的活化型IGFl和FGF2序列分別由公司直接合成，序列如下:
IGFl (296bp，下劃線部分分別為引入的分el和ZhI酶切位點，斜體加粗部分為引入的Kozak序列，斜體下劃線部分為引入的Ig k信號肽編碼序列)(SEQ ID: 8):
5，-kCXkGlTAGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACT^/mGGACCGGAGACGCTCTGCGGGGCTGAGCTGGTGGATGCTCTTCAGTTCGTGTGTGGAGACAGGGGCTTTTATTTCAACAAGCCCACAGGGTATGGCTCCAGCAGTCGGAGGGCGCCTCAGACAGGCATCGTGGATGAGTGCTGCTTCCGGAGCTGTGATCTAAGGAGGCTGGAGATGTATTGCGCACCCCTCAAGCCTGCCAAGTCAGCTTAATCTAGA-3>FGF2 (551bp，下劃線部分分別為引入的分el和油<31酶切位點，斜體加粗部分為引入的Kozak序列，斜體下劃線部分為引入的Ig k信號肽編碼序列)(SEQ ID: 9):
5，-kCXkGlTAGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACT^/mGCAGCCGGGAGCATCACCACGCTGCCCGCCTTGCCCGAGGATGGCGGCAGCGGCGCCTTCCCGCCCGGCCACTTCAAGGACCCCAAGCGGCTGTACTGCAAAAACGGGGGCTTCTTCCTGCGCATCCACCCCGACGGCCGAGTTGACGGGGTCCGGGAGAAGAGCGACCCTCACATCAAGCTACAACTTCAAGCAGAAGAGAGAGGAGTTGTGTCTATCAAAGGAGTGTGTGCTAAC CGTTACCTGGCTATGAAGGAAGATGGAAGATTACTGGCTTCTAAATGTGTTACGGATGAGTGTTTCTTTTTTGAACGATTGGAATCTAATAACTACAATACTTACCGGTCAAGGAAATACACCAGTTGGTATGTGGCACTGAAACGAACTGGGCAGTATAAACTTGGATCCAAAACAGGACCTGGGCAGAAAGCTATACTTTTTCTTCCAATGTCTGCTAAGAGCTGATAATCTAGA-3，。
[0026]實施例2:慢病毒表達載體的構建
按照圖1的設計，將上述已獲得的各個片段依次連接并克隆至慢病毒載體質(zhì)粒PLVX-1RES-ZsGreenl中，用內(nèi)切酶&oRI和油a I雙酶切鑒定插入片段的方向，正向插入時片段大小為8.2kb和2280bp (圖3)，表明構建成功。正確插入的質(zhì)粒命名為pLVX_3GF。
[0027]用QIAGEN Plasmid Midi Kits 提取質(zhì)粒 pLVX_3GF、pMD2G 和 pSPAX2，分別各取10 稀釋于Iml不含血清不含抗生素的高糖DMEM中，輕柔混勻，再加入30 μL AttracteneTransfect1n Reagent于上述培養(yǎng)基中，輕柔混勻后室溫靜置20min以形成轉染復合物。人胚腎HEK293T細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM培病毒的培養(yǎng)液上清，用
0.45 μ m濾器過濾,4 ° C保存?zhèn)溆谩?br> [0028]實施例3:三種生長因子在HEK293T細胞中的表達
接種HEK293T細胞于3.5cm培養(yǎng)皿中(培養(yǎng)基不含抗生素)，24h后(細胞達到70%匯合度)吸去培養(yǎng)液，加入500養(yǎng)基中，于37 °C、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將Iml消化離心后的HEK293T細胞懸液和Iml轉染復合物輕輕混勻后加入到1cm培養(yǎng)皿中，于37°C、5% CO。的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6-8 h后補足培養(yǎng)基至10ml。分別在轉染48 h及72h后，收集含μL含病毒顆粒的上清和Polybrene (忙備液10mg/ml,終濃度8 μ;〗/ml)，6 h后補足培養(yǎng)液，24h后更換新鮮培養(yǎng)液，細胞繼續(xù)培養(yǎng)48h后，熒光顯微鏡下觀察感染情況(圖4A)，并采用有限稀釋法(I個細胞/孔接種到96孔板中)篩選可表達綠熒光蛋白的穩(wěn)定感染的細胞克隆(圖4B)，將穩(wěn)定感染的細胞克隆命名為HEK293T/3GF。
[0029]利用Western blot法檢測感染后目的蛋白的表達:
細胞中因子檢測:收獲HEK293T/3GF細胞及未感染的HEK293T對照細胞，PBS洗滌細胞3次，離心收集細胞，加入冰預冷的裂解液(25 mM Tris-HCl，pH 7.6, 150 mMNaCl,1% NP-40, 1% 脫氧膽酸鈉，0.1% SDS,含蛋白酶抑制劑 Complete? Protease InhibitorCocktail),并置于冰上裂解30min, 15000r/min,4° C離心15min收集上清,用DC蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，取20 μ」總蛋白進行20% SDS-PAGE凝膠電泳后轉膜，10%牛奶室溫封閉Ih后，分別加入EGF、FGF2和IGFl三種抗體(1:500) 4° C孵育過夜。TBST( TBSiJP 0.l%Tween20)洗膜3 X lOmin，加過氧化物酶標記的二抗(1:5000)室溫孵育2h，洗膜
3X 1min,化學發(fā)光法檢測信號。
[0030]培養(yǎng)液中因子檢測:收集HEK293T/3GF細胞及未感染的HEK293T對照細胞的培養(yǎng)液各10ml，離心去除細胞碎片，-80° C冷凍干燥，溶于500 μL ddH20,各取20 μL進行20%SDS-PAGE，同上轉膜后檢測因子表達。
[0031]Western blot結果如圖5所示,均在6~18 kDa之間分別檢測到了目的蛋白EGF(6.2kDa)、IGFl (6kDa)和FGF2(17.2 kDa)，表明HEK293T/3GF細胞成功表達三種生長因子并可將生長因子分泌到培養(yǎng)液上清中。
[0032]實施例4:三種生長因子功能檢測
HEK293T/3GF細胞及HEK293T對照細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，于37 °C、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞長至80%匯合度后再培養(yǎng)48h后收集上清，作為條件培養(yǎng)液。人肺癌細胞A549細胞以每孔1.5 X 14個細胞接種于96孔板，實驗組加入50 μL HEK293T/3GF細胞的條件培養(yǎng)液和50 μL的新鮮的含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液，對照組加入50 μL ΗΕΚ293Τ細胞的條件培養(yǎng)液和50 μL的新鮮的含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2h后用酶標儀檢測450nm吸光度值。采用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計分析，以means土S.E.Μ.表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗；P〈0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
[0033]結果表明，和HEK293T對照條件培養(yǎng)液相比，HEK293T/3GF細胞條件培養(yǎng)液確實能夠明顯促進A549細胞的生長，差異有統(tǒng)計學意義(P〈0.05)，說明HEK293T/3GF細胞分泌的生長因子確實是具有活性的、能夠促進A549細胞生長的生長因子(圖6)。
【權利要求】
1.一種同時表達IGFUEGF和FGF2三種生長因子的編碼序列，其核苷酸序列如SEQ IDNo:1所示，其中第7位至第14位、第888位至第895位和第1718位至第1725位為Kozak序列?’第15位至第77位、第896位至第958位和第1726位至第1788位為Igk信號肽編碼序列；第297位至第881位和第1127位至1711位為IRES序列?’第78至290位為活化型IGFl編碼序列；第959位至第1120位為活化型EGF編碼序列?’第1789位至2256位為活化型FGF2編碼序列。
2.一種根據(jù)權利要求1所述的編碼序列在構建真核表達載體中的應用，其特征在于，在真核細胞中表達同時表 達IGFUEGF和FGF2三種生長因子，用于進一步研究。
【文檔編號】C12N15/12GK104178492SQ201410330202
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年7月13日 優(yōu)先權日:2014年7月13日
【發(fā)明者】葉景佳, 曹江, 鄭丹丹, 楊蓓蓓 申請人:浙江大學