專利名稱：樣本分析方法和用于該方法的檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸的分析方法。
背景技術(shù)：
DNA芯片是在各數(shù)cm的載玻片和/或硅基板上固定化10 IO5種DNA核酸鏈作為探針而得的器件。在使用DNA芯片分析樣本時(shí)，首先，將所含的核酸用熒光色素、放射性同位素等標(biāo)記，接著，使其與芯片上的探針反應(yīng)。如果樣本中的核酸含有與芯片上的探針互補(bǔ)的核酸，則發(fā)生雜交。被固定于芯片上的探針的序列和固定位置是明確的。因此，通過特定得到來源于標(biāo)記的信號(hào)的芯片上的位置，可以確定樣本中所含的核酸序列(非專利文獻(xiàn) 1)。DNA芯片是對(duì)于1個(gè)樣品一次分析多個(gè)基因非常有用的器件(檢測(cè)器具)。通常對(duì)于 1個(gè)樣品使用1個(gè)芯片。在觀察2個(gè)樣品的表達(dá)量之差時(shí)，對(duì)于2個(gè)樣品使用1個(gè)芯片。另一方面，例如，在傳染病領(lǐng)域等，有時(shí)所研究的基因數(shù)為少數(shù)，但樣本數(shù)多。然而，現(xiàn)有技術(shù)中需要根據(jù)樣本數(shù)而使用多個(gè)芯片，因此包括芯片、勞力、時(shí)間的檢測(cè)成本提尚。非專利文獻(xiàn)1 :Pease et al. Proc Natl Acac Sci USA. 1994，91，5022-5026

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題鑒于上述情況，本發(fā)明的目的是提供降低每1個(gè)樣本的檢測(cè)成本、迅速且簡(jiǎn)便地分析多個(gè)樣本的方法。用于解決課題的方法為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明提供多個(gè)樣本的分析方法，該分析方法具備下述工序 (a) (e)工序(a)對(duì)每個(gè)樣本準(zhǔn)備包含第1引物和第2引物的引物組，所述第1引物包含具有對(duì)每個(gè)所述樣本不同的序列的標(biāo)簽序列，所述第2引物與所述第1引物成對(duì)使用，其中，所述標(biāo)簽序列被設(shè)計(jì)成在所述第1引物與每個(gè)所述樣本的模板核酸中的模板序列雜交時(shí)環(huán)出(loop out)那樣；工序(b)在對(duì)每個(gè)所述樣本獨(dú)立的反應(yīng)體系中，使用與每個(gè)所述樣本對(duì)應(yīng)的所述引物組，擴(kuò)增每個(gè)所述樣本的模板核酸，得到導(dǎo)入了所述標(biāo)簽序列的擴(kuò)增產(chǎn)物；工序(C)將由每個(gè)所述樣本得到的所述擴(kuò)增產(chǎn)物混合在一起；工序(d)使具有檢測(cè)包含所述標(biāo)簽序列的目標(biāo)序列的序列且被固定化于基體上的核酸探針與在工序(C)中被混合的所述擴(kuò)增產(chǎn)物反應(yīng)；工序(e)通過檢測(cè)在工序(d)中生成的雜交量，從而對(duì)于各樣本檢測(cè)所述目標(biāo)核酸的有無和/或量。發(fā)明的效果通過本發(fā)明的方法，可以用1個(gè)芯片檢查多個(gè)樣本，因此可提供降低每1個(gè)樣本的檢查成本、迅速且簡(jiǎn)便地分析多個(gè)樣本的方法。


圖1是顯示標(biāo)簽序列導(dǎo)入引物和核酸探針的圖。圖2是顯示擴(kuò)增工序的方案圖。圖3是顯示檢測(cè)工序的圖。圖4是顯示擴(kuò)增工序的方案圖。圖5是顯示引物的圖。圖6是顯示LAMP擴(kuò)增的中間產(chǎn)物的圖。圖7是顯示擴(kuò)增工序的方案圖。圖8是顯示檢測(cè)工序的圖。圖9是顯示引物的圖。圖10是顯示擴(kuò)增工序的方案圖。圖11是DNA芯片的平面圖。圖12是DNA芯片的平面圖。圖13是顯示通過限制性酶處理來切割擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)果的圖。圖14A是顯示多個(gè)樣本的檢測(cè)結(jié)果的圖。圖14B是顯示多個(gè)樣本的檢測(cè)結(jié)果的圖。圖14C是顯示多個(gè)樣本的檢測(cè)結(jié)果的圖。
具體實(shí)施例方式[定義]本說明書中使用的“核酸”的用語(yǔ)概括地表示DNA、RNA、PNA、LNA、S-寡核苷酸、寡脫氧核苷磷酸甲酯等可以將其部分結(jié)構(gòu)用堿基序列表示的物質(zhì)。所謂“樣本”，是應(yīng)該進(jìn)行本發(fā)明的分析方法的對(duì)象，只要是可能包含核酸的樣品即可。樣本優(yōu)選處于不妨礙擴(kuò)增反應(yīng)和/或雜交反應(yīng)的狀態(tài)。例如，為了使用從生物體等獲得的材料作為本發(fā)明的樣本，可以通過其自身公知的任一方法來進(jìn)行前處理。例如，樣本也可以是液體，這時(shí)也可以稱作“被檢液”。因此，“被檢液”可以解釋為可能存在核酸或模板核酸的溶液。“多樣本(multiple samples) ”和“多個(gè)樣本(plural samples) ”的詞語(yǔ)表示 2 個(gè)或2個(gè)以上的樣本，可以以可交換的方式使用。樣本所含的核酸稱為“樣本核酸”。在樣本核酸中，將要通過本發(fā)明的引物進(jìn)行擴(kuò)增的序列稱為“模板序列”。將包含模板序列的核酸稱為“模板核酸”或“模板”。將模板核酸所含的一部分序列稱為“部分核酸序列”。部分核酸序列是要分析的序列或堿基，本發(fā)明的引物被設(shè)計(jì)成擴(kuò)增包含部分核酸序列的區(qū)域那樣。部分核酸序列可以等于模板序列，也可以包含在模板序列中。所謂“目標(biāo)核酸”，是指將模板核酸或模板序列使用本發(fā)明的正向引物和反向引物擴(kuò)增而得的擴(kuò)增產(chǎn)物。目標(biāo)核酸的一部分中包含目標(biāo)序列。“目標(biāo)序列”由標(biāo)簽序列和模板序列的一部分序列組成。該目標(biāo)序列用于使用核酸探針來檢測(cè)目標(biāo)核酸?！昂怂崽结槨笔前c目標(biāo)序列互補(bǔ)的序列的核酸。核酸探針被固定化于基體等固相上使用，與包含來源于模板序列的區(qū)域的擴(kuò)增產(chǎn)物形成雜種。所謂“來源于模板序列的區(qū)域”，是指在被引物擴(kuò)增的區(qū)域中，在引物結(jié)合的區(qū)域以外的區(qū)域反映模板的序列的區(qū)域。在檢測(cè)基因多態(tài)性或基因突變時(shí)，設(shè)計(jì)成這些部位被收納于該區(qū)域內(nèi)。“DNA芯片”是利用具有與要檢測(cè)的核酸互補(bǔ)的序列的核酸探針與檢測(cè)對(duì)象核酸之間的雜交反應(yīng)來分析核酸的裝置。DNA芯片的用語(yǔ)與一般使用的“核酸芯片”、“微陣列”和 "DNA陣列”等用語(yǔ)含義相同，可以彼此互換使用。所謂“分析多樣本”，是指同時(shí)分析多個(gè)樣本。所謂“分析樣本中的多個(gè)核酸序列” 是指同時(shí)分析1個(gè)樣本中所含的多個(gè)部分核酸序列。同時(shí)分析的多個(gè)部分核酸序列可以包含在1條的模板核酸中，也可以包含在樣本所含的不同種類的樣本核酸中。另外，分析的項(xiàng)目例如，可以是來源于病毒和/或細(xì)菌等的基因等特定核酸的檢測(cè)、基因表達(dá)量的測(cè)定、關(guān)于多態(tài)性的基因型的鑒定和/或突變的有無的檢測(cè)等。但不限于此。[實(shí)施方式]以下，對(duì)于本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行說明。圖1是顯示標(biāo)簽序列導(dǎo)入引物和核酸探針的圖?！匆铩等鐖D1的標(biāo)簽導(dǎo)入F引物所例示的那樣，在引物中導(dǎo)入與模板核酸的引物結(jié)合部位結(jié)合的序列、和用于分析多樣本的標(biāo)簽序列。標(biāo)簽序列根據(jù)樣本不同而使用各自不同的序列。例如，在準(zhǔn)備5個(gè)堿基的標(biāo)簽序列、且該標(biāo)簽序列由A、T、C、G的4種堿基構(gòu)成的情況下，有45即IOM種的標(biāo)簽序列作為候選。然而，在使用1個(gè)堿基不同的標(biāo)簽序列的情況下錯(cuò)配雜交的危險(xiǎn)性高，因此優(yōu)選準(zhǔn)備2 個(gè)堿基以上序列不同的標(biāo)簽序列。關(guān)于所準(zhǔn)備的標(biāo)簽序列的數(shù)，只要準(zhǔn)備構(gòu)成一次要分析的樣本群的樣本的數(shù)即可。由此，可以識(shí)別構(gòu)成樣本群的全部樣本。標(biāo)簽序列被設(shè)計(jì)成在包含該標(biāo)簽序列的引物與模板核酸結(jié)合時(shí)，標(biāo)簽序列部分不與模板核酸結(jié)合而環(huán)出(loop out)那樣。標(biāo)簽序列長(zhǎng)度只要是在能夠環(huán)出(loop out)、 且包含該標(biāo)簽序列的引物能夠擴(kuò)增模板核酸的范圍內(nèi)即可?？梢詾?0個(gè)堿基以下，優(yōu)選為 10個(gè)堿基以下，但不限于此。例如，可以為1 20個(gè)堿基、2 20個(gè)堿基、1 10個(gè)堿基、 2 10個(gè)堿基。引物的長(zhǎng)度可以為13 40個(gè)堿基，例如為15 30個(gè)堿基。關(guān)于所述標(biāo)簽序列在引物上的插入位置，只要是距離引物的3’末端1個(gè)堿基以上的位置即可，引物由于需要標(biāo)簽序列部分環(huán)出(loop out)并與模板結(jié)合，因而優(yōu)選距離引物的3’末端3個(gè)堿基以上的位置。另外在如圖1中那樣檢測(cè)突變和/或單堿基多態(tài)性等多態(tài)性的情況下，核酸探針需要包含標(biāo)簽序列和來源于模板序列的序列兩者。這時(shí)，如果使插入部位位于5’末端側(cè)，則探針變長(zhǎng)，特異性降低。由此，插入部位只要是引物環(huán)出(loop out)且能夠擴(kuò)增的范圍即可，優(yōu)選靠近3 ’末端側(cè)，距離3 ’末端側(cè)為25個(gè)堿基以內(nèi)、更優(yōu)選為15個(gè)堿基以內(nèi)。
在利用PCR作為擴(kuò)增法的情況下，所使用的導(dǎo)入了標(biāo)簽序列的引物可以是正向引物(F引物)或反向引物(R引物)的任一者，如果需要，也可以在兩引物中都導(dǎo)入標(biāo)簽序列。在利用LAMP法作為擴(kuò)增法的情況下，準(zhǔn)備在F2區(qū)域和/或B2區(qū)域?qū)肓怂鰳?biāo)簽序列的引物。構(gòu)成標(biāo)簽序列的核酸的種類只要是DNA、RNA、PNA、LNA、S-寡核苷酸、寡脫氧核苷磷酸甲酯等可以將其一部分結(jié)構(gòu)用堿基序列表示的物質(zhì)即可，不特別限定。<核酸探針>核酸探針由于用于檢測(cè)目標(biāo)核酸中所含的標(biāo)簽序列，因而設(shè)計(jì)成包含與標(biāo)簽序列互補(bǔ)的序列那樣。另外可根據(jù)需要如圖1所示設(shè)計(jì)成包含與來源于模板序列的區(qū)域互補(bǔ)的序列那樣。例如在檢測(cè)樣本中的核酸的基因突變和/或多態(tài)性的情況下，使基因突變和/或基因多態(tài)性部位位于引物結(jié)合部位附近的來源于該模板序列的區(qū)域。然后，分別使用具有標(biāo)簽序列檢測(cè)用序列和基因突變和/或多態(tài)性檢測(cè)用序列的野生型檢測(cè)用核酸探針、突變型檢測(cè)用核酸探針，比較野生型檢測(cè)用核酸探針與目標(biāo)核酸的雜交量、突變型檢測(cè)用核酸探針與目標(biāo)核酸的雜交量，從而判定樣本的基因型。另外，在鑒定分類于同屬的細(xì)菌的多個(gè)種的情況下，例如，對(duì)每個(gè)樣本準(zhǔn)備屬共有地?cái)U(kuò)增的所述標(biāo)簽導(dǎo)入引物進(jìn)行擴(kuò)增。此時(shí)，使各個(gè)種內(nèi)特征的、與其他種出現(xiàn)特異性的區(qū)域位于引物結(jié)合部位附近的來源于該模板序列的區(qū)域。然后，通過比較具有標(biāo)簽序列檢測(cè)用序列和各個(gè)種特征的序列的種鑒定用核酸探針與目標(biāo)核酸的雜交量、顯示與種無關(guān)的序列的陰性對(duì)照用核酸探針與目標(biāo)核酸的雜交量，從而可以進(jìn)行種的鑒定。檢測(cè)樣本中的核酸擴(kuò)增的有無作為用于分析的指標(biāo)的情況下，不一定要包含與來源于模板序列的區(qū)域互補(bǔ)的序列，但也可以包含。對(duì)本發(fā)明的核酸探針的鏈長(zhǎng)不特別限定，優(yōu)選5 50個(gè)堿基的范圍，更優(yōu)選10 40個(gè)堿基的范圍，進(jìn)一步優(yōu)選15 35個(gè)堿基的范圍。另外，核酸探針為了固定化于基體上而可以用氨基、羧基、羥基、硫醇基、磺基等反應(yīng)性官能基、親和素、生物素等物質(zhì)修飾。還可以在官能基與核苷酸之間導(dǎo)入間隔物。間隔物可以使用例如烷烴骨架、乙二醇骨架等。用于固定化核酸探針的固相可以是一般可以作為用于DNA芯片的固相使用的任一基體。這樣的基體可以由玻璃、硅、硝酸纖維素膜、尼龍膜、微板、電極、磁石、珠、塑料、膠乳、合成樹脂、天然樹脂、或光纖等構(gòu)成，但不限于這些。可以在這些基體上固定化多種核酸探針，從而構(gòu)成DNA芯片。< 方法 >接著對(duì)于導(dǎo)入了標(biāo)簽序列的引物和使用DNA芯片的多樣本的分析方法進(jìn)行說明。如圖2所示，首先，對(duì)每個(gè)樣本(樣本1、樣本2、樣本3)準(zhǔn)備導(dǎo)入了序列不同的標(biāo)簽序列(標(biāo)簽序列1、標(biāo)簽序列2、標(biāo)簽序列幻的引物(樣本1用引物、樣本2用引物、樣本 3用引物)，在對(duì)每個(gè)樣本獨(dú)立的反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增。所謂對(duì)每個(gè)樣本獨(dú)立的反應(yīng)體系， 只要是各樣本不混合的反應(yīng)體系即可。例如，只要對(duì)每個(gè)樣本分別用不同的管進(jìn)行擴(kuò)增即可?！胺磻?yīng)體系”是指能在那里進(jìn)行反應(yīng)的空間，例如，管和孔等容器。擴(kuò)增后，獲得了根據(jù)樣本不同而一部分序列不同的擴(kuò)增產(chǎn)物。在不存在模板核酸的情況下(樣本幻不發(fā)生擴(kuò)增，得不到擴(kuò)增產(chǎn)物。各反應(yīng)體系中得到的擴(kuò)增產(chǎn)物包含對(duì)每個(gè)樣本不同的標(biāo)簽序列和來源于模板核酸的區(qū)域(樣本1、樣本幻。因此，通過鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物所含的標(biāo)簽序列，可以特定樣本。將該擴(kuò)增產(chǎn)物混合，如圖3所示使其與固定化于基體上的包含與各標(biāo)簽序列互補(bǔ)的序列的核酸探針雜交。然后，通過適宜的檢測(cè)法來檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物與核酸探針的雜交。在圖2和圖3中顯示3個(gè)樣本的例子，當(dāng)然樣本數(shù)不限于此。另外，如圖1所示， 如果設(shè)計(jì)引物使得突變和/或多態(tài)性部位位于擴(kuò)增產(chǎn)物的來源于模板序列的區(qū)域，則可以通過使用包含標(biāo)簽序列、和具有用于檢測(cè)或鑒定這些突變和/或多態(tài)性的序列的來源于模板序列的序列的核酸探針，來進(jìn)行突變和/或多態(tài)性的分析。而且，如圖4所示，還可以在1個(gè)反應(yīng)體系內(nèi)多項(xiàng)擴(kuò)增序列不同的多個(gè)模板序列。 擴(kuò)增后，只要對(duì)樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA芯片檢測(cè)，就可以進(jìn)行多個(gè)模板序列的檢測(cè)。檢測(cè)如下進(jìn)行使擴(kuò)增產(chǎn)物與固定化于基體上的包含與各標(biāo)簽序列互補(bǔ)的序列的核酸探針雜交。然后，通過適宜的檢測(cè)法來檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物與核酸探針的雜交。圖4中顯示了 3個(gè)模板序列的例子，當(dāng)然模板核酸的數(shù)不限于此。另外，如果設(shè)計(jì)引物使得突變、多態(tài)性和/或要鑒定的生物種中特征的、與其他生物種具有特異性的部位位于擴(kuò)增產(chǎn)物的來源于模板序列的區(qū)域，則可以通過使用包含標(biāo)簽序列、和具有用于檢測(cè)或鑒定這些突變、多態(tài)性和/或生物種特征性部位的序列的來源于模板序列的序列的核酸探針，來進(jìn)行突變、多態(tài)性、生物種等的分析。本發(fā)明中的檢測(cè)對(duì)象包含例如個(gè)體的基因組DNA、基因組RNA、mRNA等。個(gè)體包含人、除人以外的動(dòng)物、植物、以及病毒、細(xì)菌、真細(xì)菌、酵母和支原體等微生物，但不限于這些。這些核酸可以從由個(gè)體采集的樣品中提取，所述樣品例如，血液、血清、白血球、 尿、糞便、精液、唾液、組織、活組織檢查、口腔內(nèi)粘膜、培養(yǎng)細(xì)胞、喀痰等?；蛘?，從微生物直接提取。核酸的提取可以利用市售的核酸提取試劑盒QIAamp(QIAGEN社制)、7 m 卜(住友金屬社制)等來進(jìn)行，但不限于這些。將包含從個(gè)體樣品和/或微生物中提取出的核酸的溶液作為被檢液。樣本通過本發(fā)明的方法所涉及的擴(kuò)增法來擴(kuò)增。在檢測(cè)對(duì)象是RNA的情況下，可以在擴(kuò)增前通過例如逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)換成互補(bǔ)鏈DNA。也可以將逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合物兩者添加到同一管內(nèi)，同時(shí)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和DNA擴(kuò)增。對(duì)于擴(kuò)增法，可以使用例如，聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction)法(PCR 法)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop mediated isothermal amplification)法(LAMP 法)、等溫和嵌合弓I物弓I發(fā)的核酸擴(kuò)增(Isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids) (ICAN ^ ) > j^^lj 1 ! ^±| (Nucleic acid sequence-based amplification)法(NASBA 法)、鏈置換擴(kuò)增(Strand displacement amplification) (SDA 法)、連接酶鏈反應(yīng)(Ligase chain reaction) (LCR 法)、滾環(huán)擴(kuò)增(Rolling Circle Amplification)法(RCA法)等方法。所得的擴(kuò)增產(chǎn)物可以根據(jù)需要片段化，或者單鏈化。 作為單鏈化的方法，例如有，熱變性、使用珠和/或酶等的方法、使用T7 RNA聚合物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的方法。在通過LAMP法、ICAN法等擴(kuò)增、產(chǎn)物中存在單鏈區(qū)域、并以該單鏈區(qū)域?yàn)槟繕?biāo)序列的情況下，可以直接供給雜交工序。
為了省略該單鏈化工序，通過擴(kuò)增而得的目標(biāo)核酸優(yōu)選具有莖環(huán)(stem-loop)結(jié)構(gòu)。具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的擴(kuò)增產(chǎn)物可以適合使用作為單鏈的環(huán)(loop)部分的序列與探針反應(yīng)。目標(biāo)核酸的擴(kuò)增優(yōu)選使用LAMP法(例如，請(qǐng)參照日本專利第3313358號(hào))。LAMP 法是迅速且簡(jiǎn)便的基因擴(kuò)增法，擴(kuò)增產(chǎn)物中具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)。圖5是顯示LAMP法中使用的基本引物的設(shè)計(jì)例的圖。使用圖5的模式圖來簡(jiǎn)單地說明LAMP法的原理。在LAMP法中，使用識(shí)別模板核酸的最大8個(gè)區(qū)域的6種引物和鏈置換型DNA合成酶。模板核酸在等溫(60 65°C)條件下擴(kuò)增。上述8個(gè)區(qū)域從模板核酸的5’末端側(cè)起依次被定義為F3區(qū)域、F2區(qū)域、LF區(qū)域、Fl區(qū)域，從3’末端側(cè)起依次被定義為B3c區(qū)域、B2c區(qū)域、LBc區(qū)域、和Blc區(qū)域。此外，F(xiàn)lc、F2c、F3c、Bi、B2、和B3區(qū)域分別顯示Fl、F2、F3、Blc、B2c、和B3c區(qū)域的互補(bǔ)鏈中的區(qū)域。圖5所示8種引物是:5，末端側(cè)具有與Fl互補(bǔ)的序列、3’末端側(cè)具有與F2相同的序列的FIP內(nèi)部引物，5’末端側(cè)具有與Blc相同的序列、3’末端側(cè)具有與B2c互補(bǔ)的序列的BIP內(nèi)部引物，具有與F3區(qū)域相同的序列的F3引物，具有與B3c區(qū)域互補(bǔ)的序列的B3引物，具有與LF區(qū)域互補(bǔ)的序列的LFc 引物，具有與LBc區(qū)域相同的序列的LBc引物。擴(kuò)增反應(yīng)所需的是FIP內(nèi)部引物、BIP內(nèi)部引物，F(xiàn)3弓丨物、B3弓丨物、LF引物和LB引物是為了提高擴(kuò)增效率而添加的。LAMP法所產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物中形成了如圖6所示的環(huán)結(jié)構(gòu)，F(xiàn)2區(qū)域至Fl區(qū)域之間、 F2c區(qū)域至Flc區(qū)域之間、B2區(qū)域至Bl區(qū)域之間、和B2c區(qū)域至Blc區(qū)域間是單鏈的區(qū)域。 因此，如果在該區(qū)域設(shè)計(jì)目標(biāo)序列，則能夠簡(jiǎn)便且高靈敏度地檢測(cè)目標(biāo)核酸(例如，請(qǐng)參照特開2005-143492號(hào)公報(bào))。在LF引物和/或LB引物與目標(biāo)序列重合的情況下，最好不添加LF引物和/或LB引物。使用圖7，對(duì)于在使用LAMP法時(shí)的標(biāo)簽序列導(dǎo)入引物和使用DNA芯片的多樣本分析方法進(jìn)行說明。首先，對(duì)每個(gè)樣本準(zhǔn)備在F2區(qū)域和/或B2區(qū)域中導(dǎo)入了所述標(biāo)簽序列的引物。接著，使用該引物對(duì)每個(gè)樣本在對(duì)每個(gè)樣本獨(dú)立的反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增。例如，對(duì)每個(gè)樣本在不同管中進(jìn)行擴(kuò)增即可。擴(kuò)增后，得到了在單鏈環(huán)部分根據(jù)樣本不同而一部分序列不同的擴(kuò)增產(chǎn)物。在不存在模板核酸的情況下不發(fā)生擴(kuò)增，得不到擴(kuò)增產(chǎn)物。將該擴(kuò)增產(chǎn)物混合，如圖8所示那樣，使其與固定化于基體上的包含與各標(biāo)簽序列互補(bǔ)的序列的核酸探針雜交。然后，通過適宜的檢測(cè)法來檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物與核酸探針的雜交。在圖7和圖8中，顯示了 3個(gè)樣本的例子，當(dāng)然對(duì)于樣本數(shù)不限于此。另外，如果如圖9所示那樣，使突變和/或多態(tài)性部位位于用核酸探針檢測(cè)的來源于模板序列的區(qū)域、即F2區(qū)域至Fl區(qū)域之間、F2c區(qū)域至Flc區(qū)域之間、B2區(qū)域至Bl區(qū)域之間、和B2c區(qū)域至Blc區(qū)域間之間，則可以通過使用檢測(cè)這些突變和/或多態(tài)性的核酸探針來進(jìn)行檢測(cè)。而且，如圖10所示，還可以在1個(gè)反應(yīng)體系內(nèi)多項(xiàng)擴(kuò)增包含不同序列的多種模板序列。擴(kuò)增后，對(duì)樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA芯片檢測(cè)，則可以對(duì)于多個(gè)目標(biāo)序列來分析多個(gè)樣本。檢測(cè)如下進(jìn)行使擴(kuò)增產(chǎn)物與固定化于基體上的包含與各標(biāo)簽序列互補(bǔ)的序列的核酸探針雜交。然后，通過適宜的檢測(cè)法來檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物與核酸探針的雜交。圖10中顯示了 3個(gè)模板核酸的例子，當(dāng)然模板核酸數(shù)不限于此。另外，如果設(shè)計(jì)引物使得突變、多態(tài)性部位、和/或要鑒定的生物種中特征的且與其他生物種具有特異性的部位位于擴(kuò)增產(chǎn)物的來源于模板序列的區(qū)域，則可以通過使用包含標(biāo)簽序列、和具有用于檢測(cè)或鑒定這些突變、多態(tài)性和/或生物種的序列的來源于模板序列的序列的核酸探針，來進(jìn)行突變、多態(tài)性、生物種等的分析。<DNA 芯片 >本發(fā)明中使用的DNA芯片只要具備基體和固定化于基體上的核酸探針即可。DNA 芯片的基體可以是以電流檢測(cè)型為代表的電化學(xué)檢測(cè)型、熒光檢測(cè)型、化學(xué)發(fā)色型和放射能檢測(cè)型等現(xiàn)有技術(shù)公知的任一種類的微陣列用基體。任一種類的微陣列都可以通過其本身公知的方法來制造。例如，電流檢測(cè)型微陣列的情況下，將陰性對(duì)照探針固定化區(qū)域和檢測(cè)用探針固定化區(qū)域分別配置在不同的電極上即可。圖11中作為模式圖顯示DNA芯片的例子，但是不限于此。DNA芯片在基體1上具備固定化區(qū)域2。核酸探針被固定化于該固定化區(qū)域2。這樣的DNA芯片可以通過本領(lǐng)域公知的方法來制造。配置于基體1上的固定化區(qū)域2的數(shù)量及其配置可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)需要適宜設(shè)計(jì)并改變。這樣的DNA芯片可以適合用于使用熒光的檢測(cè)方法。圖12顯示DNA芯片的其他例。圖12的DNA芯片在基體11上具備電極12。核酸探針被固定化于該電極12。電極12與焊盤13連接。來自電極12的電信息介由焊盤13取得。這樣的DNA芯片可以通過本領(lǐng)域公知的方法來制造。配置于基體11的電極12的數(shù)量及其配置可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)需要適宜設(shè)計(jì)并改變。另外，本例的DNA芯片根據(jù)需要還可以具備參考電極和對(duì)電極。電極可以使用金、金的合金、銀、鉬、汞、鎳、鈀、硅、鍺、鎵或鎢等金屬單體和它們的合金，或者石墨、玻璃碳等碳或它們的氧化物或化合物，但不限于這些。如本例的DNA芯片可以適合用于電化學(xué)檢測(cè)方法。<雜交條件>雜交只要在雜種能夠充分形成的適當(dāng)條件下進(jìn)行即可。適當(dāng)條件根據(jù)目標(biāo)核酸的種類和結(jié)構(gòu)、目標(biāo)序列所含的堿基的種類、核酸探針的種類不同而不同。例如，可以在離子強(qiáng)度為0. 01 5的范圍、PH值為5 9的范圍的緩沖液中進(jìn)行雜交。反應(yīng)溫度可以在 10°C 90°C的范圍。還可以通過攪拌和/或振蕩等來提高反應(yīng)效率。反應(yīng)溶液中還可以添加硫酸葡聚糖、鮭魚精DNA、和牛胸腺DNA等雜交促進(jìn)劑、EDTA、或表面活性劑等。<洗滌條件>雜交后，用于洗滌DNA芯片的洗滌液優(yōu)選使用離子強(qiáng)度為0.01 5的范圍、pH值為5 9的范圍的緩沖液。洗滌液優(yōu)選包含鹽和表面活性劑等。例如，使用氯化鈉或檸檬酸鈉調(diào)制的SSC溶液、Tris-HCl溶液、Tween20溶液、或SDS溶液等可以優(yōu)選使用。洗滌溫度例如在10°C 70°C的范圍內(nèi)進(jìn)行。使洗滌液通過或滯留在探針固定化基體的表面或固定化有核酸探針的區(qū)域?；蛘撸部梢栽谙礈煲褐薪nDNA芯片。這種情況下，洗滌液優(yōu)選被收納在溫度可控制的容器中。<檢測(cè)方法>通過雜交工序而生成的雜種的檢測(cè)可以利用熒光檢測(cè)方式和電化學(xué)檢測(cè)方式。(a)熒光檢測(cè)方式使用熒光標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。將在核酸的擴(kuò)增工序中使用的引物用像FITC、Cy3、Cy5、或羅丹明等熒光色素那樣的熒光活性的物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。或者，還可以使用用這些物質(zhì)標(biāo)記后的二次探針。還可以同時(shí)使用多個(gè)標(biāo)記物質(zhì)。通過檢測(cè)裝置來檢測(cè)標(biāo)記后序列或二次探針中的標(biāo)記。根據(jù)所使用的標(biāo)記來使用適當(dāng)?shù)臋z測(cè)裝置。例如，在使用熒光物質(zhì)作為標(biāo)記的情況下，使用熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。
(b)電化學(xué)檢測(cè)方式 使用本領(lǐng)域公知的雙鏈識(shí)別物質(zhì)。雙鏈識(shí)別物質(zhì)可以從H0echst33258、吖啶橙、喹吖因、道諾霉素、金屬嵌入劑、雙吖啶等雙嵌入劑、三嵌入劑和多嵌入劑中選擇。而且，還可以將這些雙鏈識(shí)別物質(zhì)用電化學(xué)活性的金屬絡(luò)合物、例如二茂鐵、紫晶等修飾。雙鏈識(shí)別物質(zhì)的使用濃度根據(jù)種類不同而不同，一般以Ing/mL lmg/mL的范圍的濃度使用。此時(shí)，使用離子強(qiáng)度為0. 001 5的范圍、PH值為5 10的范圍的緩沖液。測(cè)定如下進(jìn)行，例如施加大于等于雙鏈識(shí)別物質(zhì)電化學(xué)反應(yīng)的電位以上的電位， 測(cè)定來源于雙鏈識(shí)別物質(zhì)的反應(yīng)電流值。此時(shí)，電位可以定速施加，或者脈沖施加，或者施加定電位。可以使用恒電位儀、數(shù)位表、和函數(shù)發(fā)生器等裝置來控制電流、電壓。電化學(xué)檢測(cè)可以通過本領(lǐng)域公知的方法來實(shí)施。例如，可以使用特開平10-146183號(hào)公報(bào)所記載的方法。[檢測(cè)試劑盒]另外本發(fā)明還提供用于在上述的核酸分析方法中使用的檢測(cè)試劑盒。這樣的檢測(cè)試劑盒可以具備下述引物組和DNA芯片所述引物組包含第1引物和第2引物，所述第1引物包含具有對(duì)每個(gè)樣本不同的序列的標(biāo)簽序列，所述標(biāo)簽序列被設(shè)計(jì)成在與每個(gè)所述樣本的模板核酸中的模板序列雜交時(shí)環(huán)出(loop out)那樣，所述第2引物與所述第1引物成對(duì)使用；所述DNA芯片具備基體、和固定化于所述基體上的與包含所述標(biāo)簽序列的目標(biāo)序列互補(bǔ)的核酸探針。此時(shí)核酸探針可以是與包含標(biāo)簽序列和來源于樣本中的模板序列的序列的至少一部分的目標(biāo)序列互補(bǔ)的核酸探針。另外，檢測(cè)試劑盒可以具備下述引物組和DNA芯片所述引物組包含第1引物和第2引物，所述第1引物包含具有對(duì)每個(gè)核酸部分序列不同的序列的標(biāo)簽序列，所述標(biāo)簽序列被設(shè)計(jì)成在與所述每個(gè)核酸部分序列的模板序列雜交時(shí)環(huán)出(loop out)那樣，所述第2引物與所述第1引物成對(duì)使用；所述DNA芯片具備基體、和固定化于所述基體上的與包含所述標(biāo)簽序列的目標(biāo)序列互補(bǔ)的核酸探針。此時(shí)核酸探針可以是與包含標(biāo)簽序列和來源于每個(gè)核酸部分序列的模板序列的序列的至少一部分的目標(biāo)序列互補(bǔ)的核酸探針。另外，檢測(cè)試劑盒所含的第1引物，包含至少1次分析中使用所需的種類和量的引物。在同時(shí)分析η個(gè)樣本的情況下，使用η種第1引物。如果將不同種類的第1引物比較序列，則除標(biāo)簽序列以外可以是相同的序列。檢測(cè)試劑盒所含的第2引物，包含至少1次分析中使用所需的量的引物。另外，除了第1引物之外，第2引物也可以包含標(biāo)簽序列。這時(shí)，第2引物含有至少1次分析中使用所需的種類和量的引物即可。在同時(shí)分析η個(gè)樣本時(shí)，使用η種第2引物。如果將不同種類的第2引物比較序列，則除標(biāo)簽序列以外可以是相同的序列。在檢測(cè)試劑盒利用PCR法的情況下，第1引物例如，可以是包含至少與能含有模板核酸的η個(gè)樣本對(duì)應(yīng)的標(biāo)簽序列、和該模板核酸的一部分序列的互補(bǔ)序列的η種正向引物或反向引物(這里，η是2以上的整數(shù))。第2引物包含至少1次分析中使用所需的量的引物。這樣的第2引物是與第1引物成對(duì)使用的至少1種反向引物或正向引物即可。如果第 1引物是正向引物，則第2引物是反向引物，如果第1引物是反向引物，則第2引物是正向引物。本發(fā)明還提供用于利用LAMP法的分析方法的檢測(cè)試劑盒。在從模板序列的5’末端側(cè)起設(shè)有F3區(qū)域、F2區(qū)域、LF區(qū)域、Fl區(qū)域、從3’末端側(cè)起設(shè)有B3c區(qū)域、B2c區(qū)域、LBc 區(qū)域、Blc區(qū)域的情況下，包含選自以下(1) (9)中的至少1組引物組(1)5’末端側(cè)具有與Fl互補(bǔ)的序列、3’末端側(cè)具有與F2相同的序列、且F2序列內(nèi)插入有根據(jù)樣本不同而不同的標(biāo)簽序列的FIP引物(第1引物)，和5’末端側(cè)具有與Blc 相同的序列、3’末端側(cè)具有與B2c互補(bǔ)的序列的BIP引物(第2引物)；(2)5’末端側(cè)具有與Fl互補(bǔ)的序列、3’末端側(cè)具有與F2相同的序列的FIP引物 (第2引物)，和5’末端側(cè)具有與Blc相同的序列、3’末端側(cè)具有與B2c互補(bǔ)的序列、且B2c 序列內(nèi)插入有根據(jù)樣本不同而不同的標(biāo)簽序列的BIP引物(第1引物)；03)5’末端側(cè)具有與Fl互補(bǔ)的序列、3’末端側(cè)具有與F2相同的序列、且F2序列內(nèi)插入有根據(jù)樣本不同而不同的標(biāo)簽序列的FIP引物(第1引物)，和5’末端側(cè)具有與Blc 相同的序列、3’末端側(cè)具有與B2c互補(bǔ)的序列、且B2c序列內(nèi)插入有根據(jù)樣本不同而不同的標(biāo)簽序列的BIP引物(第2引物)；(4)5’末端側(cè)具有與Fl互補(bǔ)的序列、3’末端側(cè)具有與F2相同的序列、且F2序列內(nèi)插入有根據(jù)樣本不同而不同的標(biāo)簽序列的FIP引物(第1引物)，5’末端側(cè)具有與Blc 相同的序列、3’末端側(cè)具有與B2c互補(bǔ)的序列的BIP引物(第2引物)，具有與F3區(qū)域相同的序列的F3引物(第3引物)，和具有與B3c區(qū)域互補(bǔ)的序列的B3引物(第4引物)；(5)5’末端側(cè)具有與Fl互補(bǔ)的序列、3’末端側(cè)具有與F2相同的序列的FIP引物 (第2引物)，5’末端側(cè)具有與Blc相同的序列、3’末端側(cè)具有與B2c互補(bǔ)的序列、且B2c 序列內(nèi)插入有根據(jù)樣本不同而不同的標(biāo)簽序列的BIP引物(第1引物)，具有與F3區(qū)域相同的序列的F3引物(第3引物)，和具有與B3c區(qū)域互補(bǔ)的序列的B3引物(第4引物)；(6)5’末端側(cè)具有與Fl互補(bǔ)的序列、3’末端側(cè)具有與F2相同的序列、且F2序列內(nèi)插入有根據(jù)樣本不同而不同的標(biāo)簽序列的FIP引物(第1引物)，5’末端側(cè)具有與Blc 相同的序列、3’末端側(cè)具有與B2c互補(bǔ)的序列、且B2c序列內(nèi)插入有根據(jù)樣本不同而不同的標(biāo)簽序列的BIP引物(第2引物)，具有與F3區(qū)域相同的序列的F3引物(第3引物)，和具有與B3c區(qū)域互補(bǔ)的序列的B3引物(第4引物)；(7)5’末端側(cè)具有與Fl互補(bǔ)的序列、3’末端側(cè)具有與F2相同的序列、且F2序列內(nèi)插入有根據(jù)樣本不同而不同的標(biāo)簽序列的FIP引物(第1引物)，5’末端側(cè)具有與Blc 相同的序列、3’末端側(cè)具有與B2c互補(bǔ)的序列的BIP引物(第2引物)，具有與F3區(qū)域相同的序列的F3引物(第3引物)，具有與B3c區(qū)域互補(bǔ)的序列的B3引物(第4引物)，具有與LF區(qū)域互補(bǔ)的序列的LFc引物(第5引物)，和具有與LBc區(qū)域相同的序列的LBc引物(第6引物)；
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(8)5’末端側(cè)具有與Fl互補(bǔ)的序列、3’末端側(cè)具有與F2相同的序列的FIP弓丨物 (第2引物)，5’末端側(cè)具有與Blc相同的序列、3’末端側(cè)具有與B2c互補(bǔ)的序列、且B2c 序列內(nèi)插入有根據(jù)樣本不同而不同的標(biāo)簽序列的BIP引物(第1引物)，具有與F3區(qū)域相同的序列的F3引物(第3引物)，具有與B3c區(qū)域互補(bǔ)的序列的B3引物(第4引物)，具有與LF區(qū)域互補(bǔ)的序列的LFc引物(第5引物)，和具有與LBc區(qū)域相同的序列的LBc引物(第6引物)；(9)5’末端側(cè)具有與Fl互補(bǔ)的序列、3’末端側(cè)具有與F2相同的序列、且F2序列內(nèi)插入有根據(jù)樣本不同而不同的標(biāo)簽序列的FIP引物(第1引物)，5’末端側(cè)具有與Blc 相同的序列、3’末端側(cè)具有與B2c互補(bǔ)的序列、且B2c序列內(nèi)插入有根據(jù)樣本不同而不同的標(biāo)簽序列的BIP引物(第2引物)，具有與F3區(qū)域相同的序列的F3引物(第3引物)，具有與B3c區(qū)域互補(bǔ)的序列的B3引物(第4引物)，具有與LF區(qū)域互補(bǔ)的序列的LFc引物 (第5引物)，和具有與LBc區(qū)域相同的序列的LBc引物(第6引物)。而且，該檢測(cè)試劑盒還可以包含用于進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的酶和/或容器、洗滌液、緩沖液、用于調(diào)制緩沖液的鹽類等。另外，DNA芯片還可以以不一體化的狀態(tài)包含核酸探針和基體。通過這樣的檢測(cè)試劑盒，可以更簡(jiǎn)便地進(jìn)行核酸的分析。[例]顯示利用本發(fā)明的方法進(jìn)行檢測(cè)的具體例。以下例子是使用插入有對(duì)每個(gè)樣本不同的標(biāo)簽序列的引物和DNA芯片來分析多個(gè)樣本的方法的例子。(1)模板核酸的擴(kuò)增首先，使用插入有標(biāo)簽序列的引物進(jìn)行基因擴(kuò)增，通過限制性酶來確認(rèn)是否生成了目標(biāo)基因產(chǎn)物。使用序列號(hào)21的人MTHFR基因作為模板核酸，通過LAMP法擴(kuò)增該模板核酸。[引物]表1顯示目標(biāo)核酸的擴(kuò)增中使用的合成DNA寡聚引物。準(zhǔn)備無堿基插入的FIP引物(FIP-1 ；序列號(hào)1)、在從FIP引物的3’末端側(cè)起第4個(gè)堿基處插入了 AC(FIP-2 ；序列號(hào)2)、ACAC(FIP-3 ；序列號(hào)3)、ACACAC (FIP-4 ；序列號(hào)4)、TGTG(FIP-5 ；序列號(hào)5)、TCTC(FIP_6 ；序列號(hào)6)的、在從FIP引物的3，末端側(cè)第6 個(gè)堿基處插入了 AC(FIP-7序列號(hào)7)、ACAC(FIP-8 ；序列號(hào)8)、ACACAC (FIP-9 ；序列號(hào)9)、 TGTG(FIP-10 ；序列號(hào)10)、TCTC(FIP_11 ；序列號(hào)11)的共計(jì)11種FIP引物。另外，BIP引物(序列號(hào)12)、F3引物(序列號(hào)13)、B3引物(序列號(hào)14)、LBc引物(序列號(hào)15)通用。
權(quán)利要求
1.一種多個(gè)樣本的分析方法，該分析方法具備以下工序(a) (e)工序(a)對(duì)每個(gè)樣本準(zhǔn)備包含第1引物和第2引物的引物組，所述第1引物包含具有對(duì)每個(gè)所述樣本不同的序列的標(biāo)簽序列，所述第2引物與所述第1引物成對(duì)使用，其中，所述標(biāo)簽序列被設(shè)計(jì)成在所述第1引物與每個(gè)所述樣本的模板核酸中的模板序列雜交時(shí)環(huán)出那樣；工序(b)在對(duì)每個(gè)所述樣本獨(dú)立的反應(yīng)體系中，使用與每個(gè)所述樣本對(duì)應(yīng)的所述引物組，擴(kuò)增每個(gè)所述樣本的模板核酸，得到導(dǎo)入了所述標(biāo)簽序列的擴(kuò)增產(chǎn)物；工序(c)將由每個(gè)所述樣本得到的所述擴(kuò)增產(chǎn)物混合在一起；工序(d)使具有檢測(cè)包含所述標(biāo)簽序列的目標(biāo)序列的序列且被固定化于基體上的核酸探針與在工序(c)中被混合的所述擴(kuò)增產(chǎn)物反應(yīng)；工序(e)通過檢測(cè)在工序(d)中生成的雜交量，從而對(duì)于各樣本檢測(cè)所述目標(biāo)核酸的有無和/或量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述核酸探針具有用于檢測(cè)目標(biāo)序列的序列，所述目標(biāo)序列包含所述標(biāo)簽序列和來源于每個(gè)所述樣本的模板序列的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其中，所述引物組選自以下(1) (9)中的至少1者當(dāng)從所述模板序列的5’末端側(cè)起設(shè)定有F3區(qū)域、F2區(qū)域、LF區(qū)域、Fl區(qū)域，從3’末端側(cè)起設(shè)定有B3c區(qū)域、B2c區(qū)域、LBc區(qū)域、Blc區(qū)域時(shí)，(1)5’末端側(cè)具有與Fl互補(bǔ)的序列、3’末端側(cè)具有與F2相同的序列、且F2序列內(nèi)插入有根據(jù)樣本不同而不同的標(biāo)簽序列的FIP引物，和5’末端側(cè)具有與Blc相同的序列、3’ 末端側(cè)具有與B2c互補(bǔ)的序列的BIP引物；(2)5’末端側(cè)具有與Fl互補(bǔ)的序列、3’末端側(cè)具有與F2相同的序列的FIP引物，和5’ 末端側(cè)具有與Blc相同的序列、3’末端側(cè)具有與B2c互補(bǔ)的序列、且B2c序列內(nèi)插入有根據(jù)樣本不同而不同的標(biāo)簽序列的BIP引物；(3)5’末端側(cè)具有與Fl互補(bǔ)的序列、3’末端側(cè)具有與F2相同的序列、且F2序列內(nèi)插入有根據(jù)樣本不同而不同的標(biāo)簽序列的FIP引物，和5’末端側(cè)具有與Blc相同的序列、3’ 末端側(cè)具有與B2c互補(bǔ)的序列、且B2c序列內(nèi)插入有根據(jù)樣本不同而不同的標(biāo)簽序列的BIP 引物；(4)5’末端側(cè)具有與Fl互補(bǔ)的序列、3’末端側(cè)具有與F2相同的序列、且F2序列內(nèi)插入有根據(jù)樣本不同而不同的標(biāo)簽序列的FIP引物，5’末端側(cè)具有與Blc相同的序列、3’末端側(cè)具有與B2c互補(bǔ)的序列的BIP引物，具有與F3區(qū)域相同的序列的F3引物，和具有與B3c 區(qū)域互補(bǔ)的序列的B3引物；(5)5’末端側(cè)具有與Fl互補(bǔ)的序列、3’末端側(cè)具有與F2相同的序列的FIP引物，5’末端側(cè)具有與Blc相同的序列、3’末端側(cè)具有與B2c互補(bǔ)的序列、且B2c序列內(nèi)插入有根據(jù)樣本不同而不同的標(biāo)簽序列的BIP引物，具有與F3區(qū)域相同的序列的F3引物，和具有與B3c 區(qū)域互補(bǔ)的序列的B3引物；(6)5’末端側(cè)具有與Fl互補(bǔ)的序列、3’末端側(cè)具有與F2相同的序列、且F2序列內(nèi)插入有根據(jù)樣本不同而不同的標(biāo)簽序列的FIP引物，5’末端側(cè)具有與Blc相同的序列、3’末端側(cè)具有與B2c互補(bǔ)的序列、且B2c序列內(nèi)插入有根據(jù)樣本不同而不同的標(biāo)簽序列的BIP引物，具有與F3區(qū)域相同的序列的F3引物，和具有與B3c區(qū)域互補(bǔ)的序列的B3引物；(7)5’末端側(cè)具有與Fl互補(bǔ)的序列、3’末端側(cè)具有與F2相同的序列、且F2序列內(nèi)插入有根據(jù)樣本不同而不同的標(biāo)簽序列的FIP引物，5’末端側(cè)具有與Blc相同的序列、3’末端側(cè)具有與B2c互補(bǔ)的序列的BIP引物，具有與F3區(qū)域相同的序列的F3引物，具有與B3c 區(qū)域互補(bǔ)的序列的B3引物，具有與LF區(qū)域互補(bǔ)的序列的LFc引物，和具有與LBc區(qū)域相同的序列的LBc引物；(8)5’末端側(cè)具有與Fl互補(bǔ)的序列、3’末端側(cè)具有與F2相同的序列的FIP引物，5’末端側(cè)具有與Blc相同的序列、3’末端側(cè)具有與B2c互補(bǔ)的序列、且B2c序列內(nèi)插入有根據(jù)樣本不同而不同的標(biāo)簽序列的BIP引物，具有與F3區(qū)域相同的序列的F3引物，具有與B3c區(qū)域互補(bǔ)的序列的B3引物，具有與LF區(qū)域互補(bǔ)的序列的LFc引物，和具有與LBc區(qū)域相同的序列的LBc引物；(9)5’末端側(cè)具有與Fl互補(bǔ)的序列、3’末端側(cè)具有與F2相同的序列、且F2序列內(nèi)插入有根據(jù)樣本不同而不同的標(biāo)簽序列的FIP引物，5’末端側(cè)具有與Blc相同的序列、3’末端側(cè)具有與B2c互補(bǔ)的序列、且B2c序列內(nèi)插入有根據(jù)樣本不同而不同的標(biāo)簽序列的BIP 引物，具有與F3區(qū)域相同的序列的F3引物，具有與B3c區(qū)域互補(bǔ)的序列的B3引物，具有與 LF區(qū)域互補(bǔ)的序列的LFc引物，和具有與LBc區(qū)域相同的序列的LBc引物，工序(b)的擴(kuò)增采用LAMP法。
4.樣本核酸中的多個(gè)部分核酸序列的分析方法，該分析方法具備以下工序(a) (d)工序(a)對(duì)每個(gè)所述核酸部分序列準(zhǔn)備包含第1引物和第2引物的引物組，所述第1引物包含具有對(duì)每個(gè)所述部分核酸序列不同的序列的標(biāo)簽序列，所述第2引物與所述第1引物成對(duì)使用，其中，所述標(biāo)簽序列被設(shè)計(jì)成在所述第1引物與每個(gè)所述核酸部分序列的模板序列雜交時(shí)環(huán)出那樣；工序(b)使用所述引物組，對(duì)每個(gè)所述核酸部分序列的模板序列進(jìn)行多項(xiàng)擴(kuò)增，得到導(dǎo)入了所述標(biāo)簽序列的擴(kuò)增產(chǎn)物；工序(c)使用于檢測(cè)包含所述標(biāo)簽序列的目標(biāo)序列的被固定化于基體上的核酸探針與工序(b)所得的所述擴(kuò)增產(chǎn)物反應(yīng)；工序(d)通過檢測(cè)工序(c)中生成的雜交量，從而對(duì)于各核酸序列檢測(cè)所述目標(biāo)核酸的有無和/或量。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的分析方法，其特征在于，所述核酸探針具有用于檢測(cè)目標(biāo)序列的序列，所述目標(biāo)序列包含所述標(biāo)簽序列和來源于每個(gè)所述核酸部分序列的模板序列的序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的分析方法，其中，所述引物組選自以下(1) (9)中的至少1者當(dāng)從所述模板序列的5’末端側(cè)起設(shè)定有F3區(qū)域、F2區(qū)域、LF區(qū)域、Fl區(qū)域，從3’末端側(cè)起設(shè)定有B3c區(qū)域、B2c區(qū)域、LBc區(qū)域、Blc區(qū)域時(shí)，(1)5’末端側(cè)具有與Fl互補(bǔ)的序列、3’末端側(cè)具有與F2相同的序列、且F2序列內(nèi)插入有根據(jù)樣本不同而不同的標(biāo)簽序列的FIP引物，和5’末端側(cè)具有與Blc相同的序列、3’ 末端側(cè)具有與B2c互補(bǔ)的序列的BIP引物；(2)5’末端側(cè)具有與Fl互補(bǔ)的序列、3’末端側(cè)具有與F2相同的序列的FIP引物，和5’ 末端側(cè)具有與Blc相同的序列、3’末端側(cè)具有與B2c互補(bǔ)的序列、且B2c序列內(nèi)插入有根據(jù)樣本不同而不同的標(biāo)簽序列的BIP引物；(3)5’末端側(cè)具有與Fl互補(bǔ)的序列、3’末端側(cè)具有與F2相同的序列、且F2序列內(nèi)插入有根據(jù)樣本不同而不同的標(biāo)簽序列的FIP引物，和5’末端側(cè)具有與Blc相同的序列、3’ 末端側(cè)具有與B2c互補(bǔ)的序列、且B2c序列內(nèi)插入有根據(jù)樣本不同而不同的標(biāo)簽序列的BIP 引物；(4)5’末端側(cè)具有與Fl互補(bǔ)的序列、3’末端側(cè)具有與F2相同的序列、且F2序列內(nèi)插入有根據(jù)樣本不同而不同的標(biāo)簽序列的FIP引物，5’末端側(cè)具有與Blc相同的序列、3’末端側(cè)具有與B2c互補(bǔ)的序列的BIP引物，具有與F3區(qū)域相同的序列的F3引物，和具有與B3c 區(qū)域互補(bǔ)的序列的B3引物；(5)5’末端側(cè)具有與Fl互補(bǔ)的序列、3’末端側(cè)具有與F2相同的序列的FIP引物，5’末端側(cè)具有與Blc相同的序列、3’末端側(cè)具有與B2c互補(bǔ)的序列、且B2c序列內(nèi)插入有根據(jù)樣本不同而不同的標(biāo)簽序列的BIP引物，具有與F3區(qū)域相同的序列的F3引物，和具有與B3c 區(qū)域互補(bǔ)的序列的B3引物；(6)5’末端側(cè)具有與Fl互補(bǔ)的序列、3’末端側(cè)具有與F2相同的序列、且F2序列內(nèi)插入有根據(jù)樣本不同而不同的標(biāo)簽序列的FIP引物，5’末端側(cè)具有與Blc相同的序列、3’末端側(cè)具有與B2c互補(bǔ)的序列、且B2c序列內(nèi)插入有根據(jù)樣本不同而不同的標(biāo)簽序列的BIP 引物，具有與F3區(qū)域相同的序列的F3引物，和具有與B3c區(qū)域互補(bǔ)的序列的B3引物；(7)5’末端側(cè)具有與Fl互補(bǔ)的序列、3’末端側(cè)具有與F2相同的序列、且F2序列內(nèi)插入有根據(jù)樣本不同而不同的標(biāo)簽序列的FIP引物，5’末端側(cè)具有與Blc相同的序列、3’末端側(cè)具有與B2c互補(bǔ)的序列的BIP引物，具有與F3區(qū)域相同的序列的F3引物，具有與B3c 區(qū)域互補(bǔ)的序列的B3引物，具有與LF區(qū)域互補(bǔ)的序列的LFc引物，和具有與LBc區(qū)域相同的序列的LBc引物；(8)5’末端側(cè)具有與Fl互補(bǔ)的序列、3’末端側(cè)具有與F2相同的序列的FIP引物，5’末端側(cè)具有與Blc相同的序列、3’末端側(cè)具有與B2c互補(bǔ)的序列、且B2c序列內(nèi)插入有根據(jù)樣本不同而不同的標(biāo)簽序列的BIP引物，具有與F3區(qū)域相同的序列的F3引物，具有與B3c區(qū)域互補(bǔ)的序列的B3引物，具有與LF區(qū)域互補(bǔ)的序列的LFc引物，和具有與LBc區(qū)域相同的序列的LBc引物；(9)5’末端側(cè)具有與Fl互補(bǔ)的序列、3’末端側(cè)具有與F2相同的序列、且F2序列內(nèi)插入有根據(jù)樣本不同而不同的標(biāo)簽序列的FIP引物，5’末端側(cè)具有與Blc相同的序列、3’末端側(cè)具有與B2c互補(bǔ)的序列、且B2c序列內(nèi)插入有根據(jù)樣本不同而不同的標(biāo)簽序列的BIP 引物，具有與F3區(qū)域相同的序列的F3引物，具有與B3c區(qū)域互補(bǔ)的序列的B3引物，具有與 LF區(qū)域互補(bǔ)的序列的LFc引物，和具有與LBc區(qū)域相同的序列的LBc引物，工序(b)的擴(kuò)增采用LAMP法。
7.用于權(quán)利要求1所述的多個(gè)樣本的分析方法中的檢測(cè)試劑盒，該檢測(cè)試劑盒具備下述引物組和DNA芯片所述引物組包含第1引物和第2引物，所述第1引物包含具有對(duì)每個(gè)樣本不同的序列的標(biāo)簽序列，所述標(biāo)簽序列被設(shè)計(jì)成在與每個(gè)所述樣本的模板核酸中的模板序列雜交時(shí)環(huán)出那樣，所述第2引物與所述第1引物成對(duì)使用，所述DNA芯片具備基體、和固定化于所述基體上的與包含所述標(biāo)簽序列的目標(biāo)序列互補(bǔ)的核酸探針。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述核酸探針是與包含所述標(biāo)簽序列和來源于所述樣本中的模板序列的序列的目標(biāo)序列互補(bǔ)的核酸探針。
9.用于權(quán)利要求4所述的多個(gè)核酸部分序列的分析方法中的檢測(cè)試劑盒，該檢測(cè)試劑盒具備下述引物組和DNA芯片所述引物組包含第1引物和第2引物，所述第1引物包含具有對(duì)每個(gè)所述核酸部分序列不同的序列的標(biāo)簽序列，所述標(biāo)簽序列被設(shè)計(jì)成在與每個(gè)所述核酸部分序列的模板序列雜交時(shí)環(huán)出那樣，所述第2引物與所述第1引物成對(duì)使用，所述DNA芯片具備基體、固定化于所述基體上的與包含所述標(biāo)簽序列和來源于每個(gè)所述核酸部分序列的模板序列的序列的目標(biāo)序列互補(bǔ)的核酸探針。
10.根據(jù)權(quán)利要求9記載的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述核酸探針是與包含所述標(biāo)簽序列和來源于每個(gè)所述核酸部分序列的模板序列的序列的目標(biāo)序列互補(bǔ)的核酸探針。
全文摘要
本發(fā)明提供如下分析多個(gè)樣本的方法對(duì)多個(gè)樣本，使用包含具有對(duì)每個(gè)樣本不同的序列的標(biāo)簽序列的第1引物和與該第1引物成對(duì)使用的第2引物，在對(duì)每個(gè)樣本獨(dú)立的反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，將多個(gè)所述反應(yīng)體系獲得的導(dǎo)入了標(biāo)簽序列的擴(kuò)增產(chǎn)物混合，使混合后的擴(kuò)增產(chǎn)物與固定化于基體的核酸探針反應(yīng)，檢測(cè)生成的雜交量。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102459630SQ20098016016
公開日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2009年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月29日
發(fā)明者中村奈緒子, 橋本幸二, 源間信弘 申請(qǐng)人:株式會(huì)社 東芝