專利名稱：纖維素酶cel5h相關(guān)試劑及其在微生物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)和遺傳工程的領(lǐng)域，并且特別地關(guān)注借助于合適的酶試劑和表達所述酶試劑的微生物利用纖維素和木質(zhì)素纖維素材料的策略。更特別地，本發(fā)明涉及 Saccharophagus degradans的纖維素酶Cel5H和其同源物、功能片段和/或變體在產(chǎn)溶劑微生物(solventogenic microorganism)的背景中的應(yīng)用，以及涉及來源于Cel5H和其同源物的新結(jié)構(gòu)域和試劑。
背景技術(shù)：
纖維素和木質(zhì)素纖維素材料是植物生物量的主要成分，并且其中發(fā)現(xiàn)的纖維素聚合物可以提供大量的葡萄糖或其他可發(fā)酵的單糖或寡糖的來源，它們可以隨之被產(chǎn)溶劑微生物代謝以產(chǎn)生有用的溶劑，諸如乙醇、丙酮或丁醇。纖維素聚合物可以被纖維素解聚酶水解，所述纖維素解聚酶通常被稱為纖維素水解酶(cellulolytic enzyme)或纖維素酶。例如，天然纖維素的水解主要涉及4種類型的纖維素酶纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase) (1，4_β-D-葡聚糖纖維二糖水解酶， EC 3.2. 1.91)，內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶(內(nèi)切_1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，EC 3.2. 1.4)，內(nèi)切-加工性(processive)纖維素酶(EC 3.2. 1. 4. /3. 2. 1.91)，和 β -葡萄糖苷酶(EC 3. 2. 1. 21)。纖維素酶和相關(guān)的酶已經(jīng)廣泛地用于生物技術(shù)的各個領(lǐng)域包括食品， 啤酒，葡萄酒，動物飼料，紡織品和洗滌品，紙漿和紙工業(yè)，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和其他領(lǐng)域(關(guān)于綜述參見 Bhat 2000. Biotechnical Advances (生物技術(shù)進展)18 :355-383)。纖維素酶的性質(zhì)可以不同，諸如尤其是，它們可以充當(dāng)內(nèi)切葡聚糖酶或加工性外切葡聚糖酶，它們可以產(chǎn)生多種長度的單體或低聚體，它們可以具有水解不同的纖維素形式諸如結(jié)晶纖維素、半結(jié)晶纖維素、無定形纖維素或半纖維素的不同能力，它們可以進一步顯示結(jié)合纖維素物質(zhì)的不同的強度，不同的動力學(xué)參數(shù)等。因此，需要投入大量的努力來進一步表征纖維素酶，從而鑒定其功能部分或結(jié)構(gòu)域，這些功能部分或結(jié)構(gòu)域可能是這些酶的感興趣的特性的基礎(chǔ)。這樣的功能結(jié)構(gòu)域可以有利地與其他纖維素酶或其結(jié)構(gòu)域組合以產(chǎn)生具有所需活性的嵌合酶。此外，在產(chǎn)溶劑微生物中重組表達纖維素酶，從而允許通過這些微生物直接從含纖維素材料中生產(chǎn)有用的溶劑包括，尤其是乙醇尚未得到滿意的進展。為了實現(xiàn)進一步的改進，需要識別、表征和選擇特別適合用于此類應(yīng)用或在此類應(yīng)用中有利的纖維素酶。Saccharophagus degradans 2-40 _ 以 Ilf 己失口為 Microbifulber degradans 2-40株，并且在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)中以ATCC 43961的保藏號保藏，其是一種能夠降解至少10種不同的復(fù)雜多糖包括尤其 M^f ^ # Y-7^W-M (proteobacterium) (Andrykovitch & Marx 1988. Appl Environ Microbiol (應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué))54 :3_4 ;Ensor 等.1999. J Ind Microbiol Biotechnol (工業(yè)微生物學(xué)和生物技術(shù)雜志)23 :123-126)。S. degradans基因組已經(jīng)被測序并且其纖維素酶系統(tǒng)也被鑒定，其中包括被稱為 Cel5H 的纖維素酶(Taylor 等 2006. J Bacteriol (細菌學(xué)雜志)188 :3849-61)。此外，US2007/0292929 一般性地設(shè)想包括表達來自S. degradans的纖維素降解蛋白的產(chǎn)乙醇 (ethanologenic)細菌的重組微生物。然而，僅證明了由S. degradans表達的酶的活性，且不清楚當(dāng)在產(chǎn)乙醇細菌中表達時這些酶的任一種是否將適當(dāng)?shù)匕l(fā)揮作用。發(fā)明概述本發(fā)明人已經(jīng)對S. degradans 2-40株的Cel5H纖維素酶的結(jié)構(gòu)和活性進行了充分的表征并且已經(jīng)結(jié)論性地確定Cel5H對結(jié)晶纖維素顯示較高的活性。因此，Cel5H有利于在產(chǎn)生溶劑的(產(chǎn)溶劑)微生物，更特別地在產(chǎn)乙醇微生物諸如梭菌屬(Clostridium species)的產(chǎn)乙醇細菌包括丙酮丁醇梭菌(C. acetobutylicum)中的異源制備。因此， Cel5H在這些微生物中的表達(和任選地分泌)使它們能夠在包含或富含結(jié)晶、半結(jié)晶或無定形纖維素的纖維素物質(zhì)上生長，從而允許從含纖維素的物質(zhì)中直接產(chǎn)生有用的溶劑諸如乙醇。本發(fā)明人得到的更多數(shù)據(jù)已經(jīng)表明Cel5H可以充當(dāng)外切葡聚糖酶或內(nèi)切加工性 (endoprocessive)纖維素酶，而不是如從其糖苷水解酶家族5 (GH5)催化結(jié)構(gòu)域所預(yù)期的那樣充當(dāng)內(nèi)切葡聚糖酶。此外，Cel5H似乎主要從纖維素中釋放葡萄糖，纖維二糖和纖維三糖。假定Cel5H似乎具有的加工性天性并且因此產(chǎn)生低復(fù)雜度的纖維素衍生物，則其在產(chǎn)溶劑細菌中的重組表達可以是非常有利的。例如，Cel5H作用的產(chǎn)物可以直接被產(chǎn)溶劑微生物利用或需要其他異源纖維素的最小作用，從而簡化了重組微生物的設(shè)計并增加了該過程的有效性。本發(fā)明在其多個方面中結(jié)合了上述出人意料的認識。因此，一個方面提供了一種重組微生物，其表達&iccharophagus degradans 2-40 株的Cel5H多肽或其同源物，或所述Cel5H多肽或所述同源物的功能片段和/或變體。更特別地，本發(fā)明提供了這樣的重組微生物，其能夠通過所述表達的Cel5H多肽降解纖維素或含纖維素材料。根據(jù)具體的實施方案，所述微生物是細菌，更特別地是產(chǎn)溶劑細菌。在具體的實施方案中，所述重組微生物包含編碼Cel5H多肽或其同源物的重組核酸分子，或編碼所述Cel5H多肽或所述同源物的功能片段和/或變體的重組核酸分子，所述重組核酸分子可操作地連接至允許在所述微生物中的表達的調(diào)節(jié)序列。在進一步具體的實施方案中，所述重組微生物產(chǎn)生一種或多種溶劑、燃料和/或化學(xué)中間體，更具體地選自乙醇，丙酮，丁醇，丙酸，丁酸，醚和甘油的溶劑。在進一步的實施方案中，重組產(chǎn)溶劑微生物可以產(chǎn)生，或可以被改造以產(chǎn)生，至少或主要乙醇。由于其作為環(huán)境可接受的燃料的效用，乙醇的工業(yè)重要性在很大程度上迅速地不斷增加。因此，在一個實施方案中，所述重組產(chǎn)溶劑微生物可以是產(chǎn)乙醇微生物。在具體的實施方案中，所述重組微生物可以是細菌。在一個實施方案中，所述重組產(chǎn)溶劑細菌可以是產(chǎn)乙醇細菌。備選地，所述重組產(chǎn)溶劑微生物可以是酵母，更具體地，產(chǎn)乙醇酵母。例如，所述細菌可以是革蘭氏陽性的，諸如例如梭菌屬的細菌。因此本發(fā)明還包括將來源于革蘭氏陰性細菌的纖維素酶引入至革蘭氏陽性細菌中，這在以前沒有被提過。備選地，所述細菌可以是革蘭氏陰性的。在具體的實施方案中，所述重組的產(chǎn)溶劑微生物和優(yōu)選的產(chǎn)乙醇微生物是梭菌屬，優(yōu)選丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)。這些細菌特別地專用作產(chǎn)生溶劑和具體地產(chǎn)生乙醇的細菌。在一個實施方案中，Cel5H多肽或其同源物，或所述Cel5H多肽或所述同源物的功能片段和/或變體，可以由所述微生物分泌。這樣分泌的多肽可以有利地直接作用于并且由此解聚所述微生物暴露在其中的纖維素聚合物或否則與該纖維素聚合物相互作用或改變該纖維素聚合物。然而，也考慮其中所述多肽在細胞內(nèi)表達的實施方案。例如，這樣表達的多肽可以作用于否則被微生物內(nèi)化的纖維素聚合物，或可以在所述微生物的至少一部分溶解時被釋放。本文設(shè)想的重組微生物可以包含編碼Cel5H多肽或其同源物的重組核酸分子，或編碼所述Cel5H多肽或所述同源物的功能片段和/或變體的重組核酸分子，所述重組核酸分子可操作地連接至允許在所述微生物中的分泌的分泌信號序列，任選地與一個或多個其他組件組合，并且所述重組核酸分子可操作地連接至允許在所述微生物中的表達的調(diào)節(jié)序列。如所述的那樣，本發(fā)明還教導(dǎo)了 Cel5H的同源物和所述同源物的功能片段和/或變體，以及它們在重組微生物，更特別地產(chǎn)溶劑微生物中的應(yīng)用。優(yōu)選地，如本文中所考慮的Cel5H同源物可以包含與Cel5H的DZ結(jié)構(gòu)域同源的結(jié)構(gòu)域。具體實施方案提供了本文教導(dǎo)的重組微生物，其中Cel5H多肽的所述同源物是假單胞菌屬物種(Pseudomonas sp. )ND137的ACLA多肽。此外，如由本發(fā)明人所認識到地，天然Ce 15H多肽的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)可概括為 GH5-PSL-CBM6-EPR-DZ，其中GH5代表其糖苷水解酶家族5結(jié)構(gòu)域，PSL代表聚絲氨酸接頭， CBM6代表糖-結(jié)合組件(module)家族6結(jié)構(gòu)域，EPR代表富含谷氨酸-脯氨酸的區(qū)域，以及不被這種解釋所限制，DZ表示被本發(fā)明人鑒定為推測的糖-結(jié)合組件的C-末端結(jié)構(gòu)域。因此，在具體實施方案中，本文教導(dǎo)的重組微生物可以表達包含一個或多個結(jié)構(gòu)域的功能片段，所述結(jié)構(gòu)域選自或?qū)?yīng)于Cel5H的GH5結(jié)構(gòu)域，CBM6結(jié)構(gòu)域和DZ結(jié)構(gòu)域。 在該片段中一個或多個所述結(jié)構(gòu)域的存在可以賦予該片段以由各結(jié)構(gòu)域引起的功能性。本發(fā)明進一步考慮Cel5H多肽、其同源物、功能片段和/或變體與一個或多個異源結(jié)構(gòu)域融合的改造形式，所述異源結(jié)構(gòu)域可以提供在糖聚合物代謝和特別地纖維素代謝中有用的其他功能和活性，諸如解聚纖維素的活性，結(jié)合纖維素的活性，形成多纖維素酶體 (cellulosome)的活性或其他活性。因此，具體實施方案提供了本文教導(dǎo)的重組產(chǎn)溶劑微生物，其中所述Cel5H多肽或其同源物，或所述Cel5H多肽或所述同源物的功能片段和/或變體，與一個或多個與所述Cel5H多肽或其同源物異源的結(jié)構(gòu)域融合，所述結(jié)構(gòu)域選自多纖維素酶體支架蛋白(eellulosomal scaffoldin protein)的糖苷水解酶(GH)催化結(jié)構(gòu)域， 糖結(jié)合組件(CBM)結(jié)構(gòu)域，黏結(jié)蛋白(cohesion)結(jié)合結(jié)構(gòu)域諸如錨定(dockerin)結(jié)構(gòu)域， 和親水(X組件)結(jié)構(gòu)域。另外地或備選地，該Cel5H多肽或其同源物，或所述Cel5H多肽或所述同源物的功能片段和/或變體與異源的或其天然信號肽融合。此外，本發(fā)明還考慮了共同表達Cel5H或相關(guān)多肽和其他多肽或酶的優(yōu)勢，所述其他多肽或酶優(yōu)選地為重組多肽或酶，其有效用于糖聚合物代謝和特別地纖維素代謝中， 諸如解聚纖維素的多肽，結(jié)合纖維素的多肽，形成多纖維素酶體的多肽(諸如，例如，支架蛋白(scaffoldin))或其他多肽。這樣的共表達，和任選地和特別地共分泌可以提供附加的或補充的活性和功能，導(dǎo)致本發(fā)明的微生物更有效地解聚和利用纖維素。因此進一步的實施方案提供了本文教導(dǎo)的重組微生物，其共表達和任選地共分泌 Cel5H多肽或其同源物，或所述Cel5H多肽或所述同源物的功能片段和/或變體，和一種或多種多肽(在本文中也稱為共表達的多肽)，所述一種或多種多肽優(yōu)選地是參與糖聚合物代謝和特別地纖維素代謝的重組多肽，特別地是一種或多種能夠降解木質(zhì)素纖維素材料的酶，更特別地是一種或多種糖苷水解酶，甚至更特別地是一種或多種纖維素酶。在具體實施方案中，所述一種或多種共表達的多肽諸如共表達的酶，更特別地共表達的纖維素酶的催化作用對于Cel5H多肽或其同源物，或所述Cel5H多肽或所述同源物的功能片段和/或變體的酶活性可以是附加的或補充的，優(yōu)選是補充的。通過舉例而非限制，如果第一和第二纖維素酶優(yōu)先作用于不同的物質(zhì)(諸如，例如，結(jié)晶纖維素，半結(jié)晶纖維素，無定形纖維素或半纖維素)，或如果第一和第二纖維素酶產(chǎn)生不同的產(chǎn)物(例如，糖單體和/或低聚體的不同群體)，或如果第一纖維素酶優(yōu)先地作用于第二纖維素酶的反應(yīng)產(chǎn)物或反之亦然等，則第一纖維素酶可以被認為具有對第二纖維素酶補充的活性。在進一步的實施方案中，所述一種或多種共表達的纖維素酶可以選自家族_5， 6，8，9和48纖維素酶。在進一步的具體實施方案中，所述一種或多種共表達的纖維素酶可以選自解纖維素梭菌(Clostridium cellulolyticum)纖維素酶Cel48F，Cel9G, Cel9R, Cel9P, Cel9E, Cel9H, Cel9J, Cel9M, Cel8C, Cel5N 禾口 Cel5A,以及 Saccharophagus degradans 2-40 株纖維素酶 Cel9A，Cel9B, Cel5J, Cel5I, Cel5F, Cel5D, Cel5B, Cel9G, Cel5E, Cel5A, Cel5C和Cel6A，以及任一種所述纖維素酶的功能片段和/或變體。進一步的實施方案提供了本文教導(dǎo)的重組微生物，更特別地產(chǎn)溶劑重組微生物， 其中Cel5H多肽或其同源物，或所述Cel5H多肽或所述同源物的功能片段和/或變體，和任選地如上教導(dǎo)的一種或多種共表達的多肽，更特別地一種或多種共表達的纖維素酶，包含在雜交的和/或共價的多纖維素酶體或小型多纖維素酶體中(在此說明書全文中多纖維素酶體的總稱中始終包括兩者)。多纖維素酶體可以提供尤其是結(jié)合纖維素活性和解聚纖維素活性的超分子組織結(jié)構(gòu)(organisation)，從而實現(xiàn)糖聚合物代謝，特別地纖維素代謝的更高效率。在進一步的方面，本發(fā)明提供了降解包含纖維素的物質(zhì)的方法，所述物質(zhì)諸如木質(zhì)素纖維素或纖維素材料或生物量，所述方法包括使所述物質(zhì)與本文教導(dǎo)的重組生物體接觸。在具體的實施方案中，該物質(zhì)包含或富含結(jié)晶纖維素。相關(guān)的方面提供了從包含纖維素的物質(zhì)中產(chǎn)生溶劑、燃料或化學(xué)中間體的方法， 所述物質(zhì)諸如木質(zhì)素纖維素或纖維素材料或生物量，所述方法包括用一種或多種本文教導(dǎo)的微生物處理所述物質(zhì)。在具體的實施方案中，該物質(zhì)包含或富含結(jié)晶纖維素。在最具體的實施方案中，該溶劑為乙醇，且該微生物為產(chǎn)乙醇微生物。在具體實施方案中，本發(fā)明的方法包括在纖維素物質(zhì)上生長本文所述的重組微生物，從而確保從含纖維素的物質(zhì)中直接產(chǎn)生有用的溶劑諸如乙醇，所述纖維素物質(zhì)包含或富含結(jié)晶、半結(jié)晶或無定形纖維素。還應(yīng)該理解盡管在前述的方面和實施方案中已經(jīng)主要結(jié)合重組微生物公開了本發(fā)明，但本發(fā)明還包括涉及有效用于獲得該重組微生物的重組手段和試劑，使用所述重組手段和試劑獲得該重組微生物的方法，用于在該重組微生物中表達所需多肽的方法，以及表達的多肽及其組合本身和它們的制備方法的多個方面。因此，進一步的方面提供了 Saccharophagus degradans 2-40株的分離的Cel5H 多肽或其同源物，或所述Cel5H多肽或所述同源物的功能片段和/或變體。另一個方面提供了重組核酸分子，所述重組核酸分子編碼Cel5H多肽或其同源物，或編碼所述Cel5H多肽或所述同源物的功能片段和/或變體。本發(fā)明此方面的進一步的實施方案提供了編碼Cel5H多肽或其同源物的重組核酸分子，或編碼所述Cel5H多肽或所述同源物的功能片段和/或變體的重組核酸分子，所述重組核酸分子可操作地連接至允許在目的宿主微生物中的表達的調(diào)節(jié)序列。在具體的實施方案中，所述宿主為產(chǎn)溶劑微生物。在更具體的實施方案中，所述宿主為本說明書中其他地方教導(dǎo)的產(chǎn)乙醇微生物。在本文提供的重組核酸分子的具體實施方案中，編碼Cel5H多肽或其同源物，或編碼所述Cel5H多肽或所述同源物的功能片段和/或變體的核酸序列適應(yīng)宿主微生物的密碼子偏倚。進一步的實施方案提供了編碼Cel5H多肽或其同源物的重組核酸分子，或編碼所述Cel5H多肽或所述同源物的功能片段和/或變體的重組核酸分子，所述重組核酸分子可操作地連接至允許在目的宿主微生物，特別地在重組微生物，更特別地在本說明書中其他地方教導(dǎo)的產(chǎn)溶劑微生物和更優(yōu)選地產(chǎn)乙醇微生物中的分泌的分泌信號序列。進一步的實施方案提供了編碼Cel5H多肽或其同源物的重組核酸分子，或編碼所述Cel5H多肽或所述同源物的功能片段和/或變體的重組核酸分子，所述重組核酸分子可操作地連接至允許在目的宿主微生物中的分泌的分泌信號序列，且可操作地連接至允許在目的宿主微生物，特別地在本說明書中其他地方教導(dǎo)的產(chǎn)溶劑微生物和更特別地產(chǎn)乙醇微生物中的表達的調(diào)節(jié)序列。一個進一步的方面是載體，諸如例如克隆載體，穿梭載體和/或表達載體，其包含上面公開的一種或多種重組核酸。一個進一步的方面提供了用一種或多種所述重組核酸或用上述的載體轉(zhuǎn)化的目的宿主微生物。在一個實施方案中，該微生物可以是細菌，更特別地選自下列的細菌 大腸桿菌(Escherichia coli), Salmonella tymphimurium,粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens),鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)禾口枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。所述細菌特別適合于過量產(chǎn)生重組多肽，例如為了純化的目的。在具體實施方案中，該宿主微生物為本說明書中其他地方教導(dǎo)的產(chǎn)溶劑微生物且優(yōu)選產(chǎn)乙醇微生物。一個進一步的方面提供了由這樣轉(zhuǎn)化的微生物直接獲得或可由其獲得的細胞溶胞產(chǎn)物或細胞提取物。因此，還提供了用于獲得根據(jù)本發(fā)明的重組微生物，優(yōu)選本說明書其他地方教導(dǎo)的產(chǎn)溶劑微生物和更優(yōu)選產(chǎn)乙醇微生物的方法，該方法包括用本文教導(dǎo)的重組核酸或載體轉(zhuǎn)化宿主微生物。進一步提供了用于產(chǎn)生，和任選地和最特別地分泌一種或多種Cel5H多肽或其同源物，或所述Cel5H多肽或所述同源物的功能片段和/或變體的方法，所述方法包括用本文教導(dǎo)的各種重組核酸或載體中的一種或多種轉(zhuǎn)化宿主微生物，并且在有效引起所述各種多肽表達的條件下培養(yǎng)或保持這樣轉(zhuǎn)化的微生物。有利地，所述各種多肽以生物活性形式產(chǎn)生。任選地，該方法可以包括分離各種多肽的步驟。
因此，還考慮本文公開的重組核酸、載體或宿主細胞在產(chǎn)生，和任選地和特別地分泌Cel5H多肽或其同源物，或所述Cel5H多肽或所述同源物的功能片段和/或變體中的應(yīng)用。優(yōu)選所述各種多肽以生物活性形式產(chǎn)生。在上述多肽的具體實施方案中，重組核酸、載體、轉(zhuǎn)化的宿主微生物、方法和應(yīng)用的特征在于下面特征中的一種或多種-所述Cel5H同源物包含與Cel5H的DZ結(jié)構(gòu)域同源的結(jié)構(gòu)域；和/或-所述Cel5H同源物為假單胞菌屬物種(I^seudomonassp. )ND137的ACLA多肽； 和/或-所述功能片段包含一個或多個結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域選自或?qū)?yīng)于Cel5的GH5結(jié)構(gòu)域，CBM6結(jié)構(gòu)域和DZ結(jié)構(gòu)域；和/或-所述一種或多種Cel5H多肽或其同源物，或所述一種或多種Cel5H多肽或所述同源物的功能片段和/或變體與一個或多個與Cel5H多肽或其同源物異源的結(jié)構(gòu)域融合，所述異源的結(jié)構(gòu)域選自多纖維素酶體支架蛋白的GH催化結(jié)構(gòu)域，CBM結(jié)構(gòu)域，黏結(jié)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域諸如錨定結(jié)構(gòu)域，和X組件結(jié)構(gòu)域；和/或-所述一種或多種Cel5H多肽或其同源物，或所述一種或多種Cel5H多肽或所述同源物的功能片段和/或變體可以與一種或多種參與糖聚合物代謝，特別地參與纖維素代謝的多肽，優(yōu)選重組多肽或酶，優(yōu)選地與一種或多種能夠降解木質(zhì)素纖維素材料的酶，更優(yōu)選地與一種或多種本文教導(dǎo)的異源纖維素酶共表達和任選地共分泌；和/或-所述一種或多種Cel5H多肽或其同源物，或所述Cel5H多肽或所述同源物的功能片段和/或變體，和任選地(如上面所教導(dǎo)的)一種或多種共表達的多肽，更特別地共表達的纖維素酶包含在雜交的和/或共價的多纖維素酶體中。因此，一個方面提供了分離的組合物，其包含Cel5H多肽或其同源物，或所述 Cel5H多肽或所述同源物的功能片段和/或變體，且還包含一種或多種參與糖聚合物代謝， 和特別地參與纖維素代謝的多肽，優(yōu)選一種或多種能夠降解木質(zhì)素纖維素材料的酶，更優(yōu)選本文教導(dǎo)的一種或多種異源纖維素酶。在所述組合物的具體實施方案中，所列舉的組分作為離散的或游離的多肽存在。在其他實施方案中，所列舉的多肽包含在雜交的和/或共價的多纖維素酶體中。本發(fā)明人對Cel5H多肽的結(jié)構(gòu)和組織已經(jīng)進一步進行了全面的分析，并且已經(jīng)鑒定了在Cel5H多肽的C-末端附近存在以前未曾同樣鑒定到的新結(jié)構(gòu)域(此后稱為結(jié)構(gòu)域 DZ)。不受限制地，本發(fā)明人的數(shù)據(jù)提示了針對該DZ結(jié)構(gòu)域的推測的糖結(jié)合組件(和/或低聚組件功能)并且指示其存在可能至少部分地是Cel5H解聚結(jié)晶纖維素的良好能力的原因。因此，本發(fā)明進一步認識到DZ結(jié)構(gòu)域或Cel5H多肽的包含DZ結(jié)構(gòu)域的部分可以用于多種酶體系中以改善它們消化和降解結(jié)晶纖維素的能力。因此，進一步的方面是Saccharophagus degradans 2-40株的Cel5H多肽的分離的結(jié)構(gòu)域(DZ結(jié)構(gòu)域)，即所述Cel5H多肽(諸如，例如，在圖IC中顯示的示例性的成熟 Cel5H多肽SEQ ID NO :3中)的氨基酸496至氨基酸596或與其同源的分離的結(jié)構(gòu)域，或所述DZ結(jié)構(gòu)域或所述同源結(jié)構(gòu)域的功能片段和/或變體。在具體實施方案中，與Cel5H DZ同源的結(jié)構(gòu)域是假單胞菌屬物種ND137的ACLA 多肽(諸如，例如，在圖IE中顯示的示例性的成熟ACLA多肽SEQ ID NO :5中)的從氨基酸463延伸至氨基酸558的結(jié)構(gòu)域。具體實施方案提供了 Cel5H多肽或其同源物或變體的分離片段，其具有結(jié)構(gòu) EPR-DZ, CBM6-EPR-DZ或PSL-CBM6-EPR-DZ，其中EPR, CBM6和PSL具有本說明書中他處所解釋的含義。這樣的片段包含DZ結(jié)構(gòu)域，所述DZ結(jié)構(gòu)域提供其有利的功能，和任選地，這樣的片段可以包括Cel5H糖結(jié)合組件CBM6，所述CBM6可以進一步促進降解結(jié)晶纖維素或半纖維素物質(zhì)的能力。此外，內(nèi)源性接頭序列可以為將DZ和任選地CBM6結(jié)構(gòu)域與其他多肽融合同時保留它們的結(jié)構(gòu)和功能提供有利的手段。因此，具體實施方案提供ACLA多肽的分離片段，其包含與Cel5H的DZ結(jié)構(gòu)域同源的結(jié)構(gòu)域。此外考慮的是分離的DZ結(jié)構(gòu)域或其功能片段和/或變體，或如上教導(dǎo)的分 離片段作為糖結(jié)合組件的應(yīng)用。這樣的應(yīng)用可以對多種酶體系賦予新的糖_或纖維素_結(jié)合特性。另一個方面涉及嵌合多肽，所述嵌合多肽包含分離的DZ結(jié)構(gòu)域，最特別地Cel5H 的分離的DZ結(jié)構(gòu)域，或其功能片段和/或變體，或包含含有DZ結(jié)構(gòu)域的Cel5H的分離片段， 并且還包含與Cel5H多肽或其同源物異源的一個或多個結(jié)構(gòu)域，所述一個或多個結(jié)構(gòu)域選自多纖維素酶體支架蛋白的GH催化結(jié)構(gòu)域，CBM結(jié)構(gòu)域，黏結(jié)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域諸如錨定結(jié)構(gòu)域，和X組件結(jié)構(gòu)域。這樣的組件組合允許生成新的纖維素降解酶，所述纖維素降解酶具有針對結(jié)晶纖維素或半纖維素物質(zhì)的有用活性。其他方面提供了嵌合多肽，所述嵌合多肽包含分離的DZ結(jié)構(gòu)域或其功能片段和/ 或變體，或包含DZ結(jié)構(gòu)域的Cel5H的分離片段，所述嵌合多肽融合于與Cel5H多肽或其同源物異源的一種或多種參與糖聚合物代謝，特別地參與纖維素代謝的多肽，優(yōu)選地融合于一種或多種能夠降解木質(zhì)素纖維素材料的酶，更優(yōu)選融合于一種或多種糖苷水解酶，甚至更優(yōu)選地融合于一種或多種纖維素酶。然而，也考慮另外的一個或多個DZ結(jié)構(gòu)域與如本文所述的Cel5H多肽或其同源物，或其片段和/或變體的融合。一個進一步的方面提供了重組核酸分子，所述重組核酸分子編碼分離的DZ結(jié)構(gòu)域或與其同源的分離的結(jié)構(gòu)域或其功能片段和/或變體，或編碼包含DZ結(jié)構(gòu)域或其同源物的Cel5H的分離片段，或編碼如上所述的嵌合多肽。此方面的一個具體實施方案提供了重組核酸分子，所述重組核酸分子編碼分離的 DZ結(jié)構(gòu)域或與其同源的分離的結(jié)構(gòu)域或其功能片段和/或變體，或編碼包含DZ結(jié)構(gòu)域或其同源物的Cel5H的分離片段，或編碼如上所述的嵌合多肽，所述重組核酸分子可操作地連接至允許在目的宿主微生物中，優(yōu)選地在本說明書中其他地方教導(dǎo)的產(chǎn)溶劑微生物中和更優(yōu)選地在產(chǎn)乙醇微生物中的表達的調(diào)節(jié)序列。一個進一步的實施方案提供了重組核酸分子，所述重組核酸分子編碼分離的DZ 結(jié)構(gòu)域或與其同源的分離的結(jié)構(gòu)域或其功能片段和/或變體，或編碼包含DZ結(jié)構(gòu)域或其同源物的Cel5H的分離片段，或編碼如上所述的嵌合多肽，所述重組核酸分子可操作地連接至允許在目的宿主微生物中，優(yōu)選地在本說明書中其他地方教導(dǎo)的產(chǎn)溶劑微生物中和更優(yōu)選地在產(chǎn)乙醇微生物中的分泌的分泌信號序列。此方面的另一個進一步的實施方案提供了重組核酸分子，所述重組核酸分子編碼分離的DZ結(jié)構(gòu)域或與其同源的分離的結(jié)構(gòu)域或其功能片段和/或變體，或編碼包含DZ結(jié)構(gòu)域或其同源物的Cel5H的分離片段，或編碼如上所述的嵌合多肽，所述重組核酸分子可操作地連接至允許在目的宿主微生物中的分泌的分泌信號序列，和可操作地連接至允許在目的宿主微生物中，優(yōu)選地在本說明書中其他地方教導(dǎo)的產(chǎn)溶劑微生物中和更優(yōu)選地在產(chǎn)乙醇微生物中的表達的調(diào)節(jié)序列。 一個進一步的方面提供了載體，諸如例如克隆載體，穿梭載體和/或表達載體，其包含任一種上述重組核酸分子。一個進一步的方面提供了用上述重組核酸分子或載體轉(zhuǎn)化的目的宿主微生物。 在具體實施方案中，該微生物是細菌，更優(yōu)選地是選自下列的細菌大腸桿菌，Salmonella tymphimurium，粘質(zhì)沙雷氏菌，鼠傷寒沙門氏菌和枯草芽孢桿菌。在具體實施方案中，該微生物可以是本說明書中其他地方教導(dǎo)的產(chǎn)溶劑微生物且優(yōu)選產(chǎn)乙醇微生物。一個進一步的方面提供了由這樣轉(zhuǎn)化的微生物直接獲得或可由其獲得的細胞溶胞產(chǎn)物或細胞提取物。在具體實施方案中，分離的DZ結(jié)構(gòu)域或與其同源的分離的結(jié)構(gòu)域或其功能片段和/或變體，或包含DZ結(jié)構(gòu)域或其同源物的Cel5H的分離片段，或如上所述的嵌合多肽，和任選地一種或多種共表達的參與糖聚合物代謝，特別地參與纖維素代謝的多肽可以包含在雜交的和/或共價的多纖維素酶體中。在進一步的方面，本發(fā)明提供了降解包含纖維素的物質(zhì)諸如木質(zhì)素纖維素或纖維素材料或生物量的方法，所述方法包括使所述物質(zhì)與分離的DZ結(jié)構(gòu)域或與其同源的分離的結(jié)構(gòu)域或其功能片段和/或變體，或與包含DZ結(jié)構(gòu)域或其同源物的Cel5H的分離片段， 或與如上所述的嵌合多肽，或與表達這些的重組微生物接觸。在一個實施方案中，所述物質(zhì)可以包含或富含結(jié)晶纖維素，半結(jié)晶纖維素或無定形纖維素。相關(guān)的方面提供了從包含纖維素的物質(zhì)諸如木質(zhì)素纖維素或纖維素材料或生物量中產(chǎn)生溶劑、燃料或化學(xué)中間體的方法，所述方法包括用分離的DZ結(jié)構(gòu)域或與其同源的分離的結(jié)構(gòu)域或其功能片段和/或變體，或用包含DZ結(jié)構(gòu)域或其同源物的Cel5H的分離片段，或用如上所述的嵌合多肽，或用表達這些的重組的產(chǎn)溶劑微生物處理所述物質(zhì)。在一個實施方案中，所述物質(zhì)可以包含或富含結(jié)晶纖維素。在具體實施方案中，提供了產(chǎn)生溶劑， 更特別地產(chǎn)生乙醇的方法，并且該微生物可以是產(chǎn)乙醇微生物。一個進一步的方面提供了通過本文所述的方法獲得的或可獲得的包含纖維素降解產(chǎn)物和/或溶劑，更特別地乙醇的組合物。所述組合物可以是粗制培養(yǎng)基或針對Cel5H 多肽(或其同源物或片段)的產(chǎn)物進行(至少)部分地富集和/或純化或針對溶劑、燃料或化學(xué)中間體進行部分地富集和/或純化。在具體實施方案中，這樣的組合物的特征在于增加的葡萄糖、纖維二糖和纖維三糖含量。在進一步具體的實施方案中，提供了這樣的組合物，其中葡萄糖、纖維二糖和/或纖維三糖的含量大于IOwt %，大于20wt %，大于30wt %，大于40wt%，大于50wt%，大于60wt%，大于70wt%，大于80wt%，大于90wt%以上。在進一步具體的實施方案中，這樣的組合物的特征在于高含量的目的溶劑、燃料或化學(xué)中間體。在進一步具體的實施方案中，提供了這樣的組合物，其中溶劑、燃料或化學(xué)中間體的含量大于IOwt%，大于20wt%，大于30wt%，大于40wt%，大于50wt%，大于 60wt %，大于 70wt %，大于 80wt %，大于 90wt %，大于 90wt %，或 96 % -99，9wt %。在具體實施方案中，該組合物中溶劑、燃料或化學(xué)中間體的濃度大于約10g/L，和優(yōu)選大于約15g/ L0本發(fā)明的這些和其他方面和實施方案在下面和在所附的權(quán)利要求中進一步解釋，并通過非限制性實施例說明。附圖簡要說明

圖1圖示了 Saccharophagus degradans 2-40株的天然Cel5H多肽的示例性編碼核酸序列(A)和氨基酸序列(B-C)，所述氨基酸序列含有(B)或不含有(C) N-末端分泌信號序列；假單胞菌屬物種ND137的天然ACLA蛋白的示例性氨基酸序列，所述序列含有(D)或不含有(E) N-末端分泌信號序列；示例性的改造的Cel5H-編碼核酸序列(F)和適應(yīng)丙酮丁醇梭菌密碼子偏倚并在3’(C-末端)端處含有6xHis密碼子或標(biāo)簽的氨基酸序列(G)。圖2示意性地圖示了根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，已被或被改造用于表達的 Cel5H的不同片段和衍生物。圖3圖示了根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，Cel5H的多種形式在37°下針對CMC的活性。圖4圖示了根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，Cel5H的多種形式在37°下針對磷酸溶脹纖維素(Phosphoric Acid Swollen Cellulose)的活性。圖5圖示了根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，Cel5H的多種形式在37°下針對Avicel PHlOl的活性。圖6圖示了根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，Cel5H微晶纖維素酶(avicelase)活性與來自解纖維素梭菌(C.cellulolyticum)的野生型和改造的纖維素酶的比較。圖7圖示了根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，來自解纖維素梭菌的Cel5A的改造形式的略圖，所述改造形式包含附加的Cel5H的結(jié)構(gòu)域。圖例參見圖2。圖8圖示了根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，來自解纖維素梭菌的Cel5A的不同改造形式對Avicel (3. 5g/L 20mM Tris-馬來酸酯pH 6和ImM CaCl2)的降解，所述改造形式包含附加的Cel5H的結(jié)構(gòu)域。圖例參見圖2。圖9顯示根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，Cel5H和至少一種其他的纖維素酶對 Avicel的降解。圖10示意性地圖示了根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，包含Cel5H的雜交小型多纖維素酶體(minicellulosome)。圖11顯示了根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，在含有3g/L 2YT-PASC和pH 5. 5的發(fā)酵罐中PASC的降解，剩余纖維二糖的消耗(consummation)和丙酮丁醇梭菌的細菌生長，其 Cel5H信號肽序列被解纖維素梭菌的Cel5H信號肽序列替換。圖12顯示了根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，在存在2YT和pH 5. 5但不含任何PASC 的發(fā)酵罐中剩余纖維二糖的消耗和丙酮丁醇梭菌的細菌生長，其Cel5H信號肽序列被解纖維素梭菌的Cel5H信號肽序列替換。圖13圖示了根據(jù)本發(fā)明具體實施方案的不同構(gòu)建體。這些構(gòu)建體包含融合到運載結(jié)構(gòu)域(carrier domain)和信號序列的目的多肽(纖維素酶“Cel5H”)。運載結(jié)構(gòu)域包含來自于多纖維素酶體支架蛋白的糖結(jié)合組件(CBM3a)，該組件融合到一個或兩個X組件 (Xa)0纖維素酶Cel5H包含糖苷水解酶家族5結(jié)構(gòu)域(“5”)、聚絲氨酸接頭(“sss”)、 糖-結(jié)合組件家族6結(jié)構(gòu)域(“6”)、富含-谷氨酸-脯氨酸區(qū)(“印pv”)和C-末端結(jié)構(gòu)域，該C-末端結(jié)構(gòu)域被本發(fā)明人鑒定為推測的糖-結(jié)合組件(“DZ”)。圖14證明與對照菌株相比野生型Cel5H以及融合到運載結(jié)構(gòu)域的Cel5H的分泌。運載結(jié)構(gòu)域包含來自多纖維素酶體支架蛋白的糖結(jié)合組件(CBM3a)，該組件融合到兩個親水結(jié)構(gòu)域(Xa)。測量培養(yǎng)物上清對可溶性物質(zhì)對-硝基苯基-纖維二糖 (para-nitrophenyl-cellobiose)白勺 舌十生°圖15證明不同蛋白(包括根據(jù)本發(fā)明具體實施方案的融合蛋白)對不同纖維素物質(zhì)的活性；(a)包含Cel5H的蛋白對可溶性物質(zhì)對-硝基苯基-纖維二糖的活性；野生型 Cel5H(實線)，具有一個X組件的融合體(CBM-Xa-5H ；點線)，具有兩個X組件的融合蛋白 (CBM-Xa-Xa-5H，虛線)(b)包含cel5H的蛋白對結(jié)晶纖維素Avicel的活性。圖16示意性地圖示了根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，Cel5H和ACLA的結(jié)構(gòu)域的比較。發(fā)明詳述當(dāng)用于本文時，單數(shù)形式“一個”、“一種”、和“所述”既包括單數(shù)也包括復(fù)數(shù)指示物，除非上下文另有清楚地說明。當(dāng)用于本文時，術(shù)語“包含”(“comprising”、“comprises”和“comprisedof”)與 “包括”或“含有” (“including”、“includes” 或“containingWontains”)意思相同， 是包括的或開放式的，并且不排除另外的、未列舉的成員、要素或方法步驟。通過端值列舉的數(shù)值范圍包括該范圍內(nèi)所包含的所有數(shù)字和分數(shù)，也包括所列舉的端值。術(shù)語“大約”用于本文時，當(dāng)指可測量的數(shù)值如參數(shù)、量、時間期間等時，是指包括標(biāo)示數(shù)值的和偏離標(biāo)示數(shù)值的+/-10%或更少，優(yōu)選地+/-5%或更少，更優(yōu)選地+/-1%或更少，還更優(yōu)選地+/-0. 或更少的差異，只要此類差異在所公開的發(fā)明中適合于實施。要理解修飾語“大約”所指的值本身也被明確地和優(yōu)選地公開。本說明書中引用的所有文獻通過弓I用完整地并入本文。除非另外指定，用于公開本發(fā)明的所有術(shù)語，包括技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域中普通技術(shù)人員所普遍理解的含義。借助于進一步的指導(dǎo)，包括術(shù)語定義以更好地理解本發(fā)明的教導(dǎo)。當(dāng)用于本文時，術(shù)語“Cel5H”，“Cel5H多肽”或“Cel5H蛋白”指根據(jù)本領(lǐng)域中這些命名所普遍公知的Mccharophagus degradans 2-40株的多肽或蛋白(參見，特別是Taylor等，2006，見上)。上述命名特別地指具有天然序列的此類多肽，S卩，其基本序列與自然界中存在的或來源于自然界的S. degradans 2-40株的Cel5H蛋白的基本序列相同的多肽。專業(yè)技術(shù)人員理解Cel5H的天然序列由于遺傳趨異或自發(fā)突變可能導(dǎo)致在 S. degradans 2_40株的不同次代菌株或傳代培養(yǎng)物之間發(fā)生差異。Cel5H的天然序列可能由于轉(zhuǎn)錄后或翻譯后修飾而進一步發(fā)生趨異。因此，自然界中存在或來源于自然界的所有 Cel5H序列均被認為是“天然的”。上述名稱包括形成活生物體、微生物或細胞的一部分時的Cel5H多肽，以及至少部分地分離自所述來源時的Cel5H多肽。這些術(shù)語也包括通過重組或合成方式生產(chǎn)時的 Cel5H多肽。Cel5H多肽正常是分泌性的，并且可以以前體形式存在，所述前體形式包含可切割的N-末端分泌信號序列，或以缺少所述信號序列的成熟形式存在。取決于容易被專業(yè)技術(shù)人員理解的背景，本文提及的Cel5H多肽可以包括所述成熟形式和/或所述前體形式。
示例性Cel5H多肽包括但不限于由在下列各處標(biāo)注的核酸編碼序列編碼的多肽 NCBI Entrez 基因數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez db = gene)基因座標(biāo)簽 Sde_3237 (GeneID :3965710)，和 NCBI Genbank (http //www. ncbi. nlm. nih. gov/ Genbank/index. html)登錄號NC 007912(序列版本1，數(shù)據(jù)庫錄入更新時間2008年7月 20目)，也重現(xiàn)在圖IA中(SEQ ID NO 1)；和在下列各處標(biāo)注的Cel5H多肽NCBI Genbank 登錄號YP 528706(序列版本1,數(shù)據(jù)庫錄入更新時間:2008年7月20日)和Uniprot/ Swissprot (http://www. expasy. org/)登錄號 Q21FN5(于 2006 年 4 月 18 日輸入的序列版本1)，如示例性地重現(xiàn)在圖IB (SEQ ID NO 2)中。此序列對應(yīng)于包含信號序列的Cel5H前體。示例性的成熟Cel5H多肽，S卩，信號序列被加工掉的多肽由所述前體序列的氨基酸位置35-630表示，其示例性地重新在圖 IC(SEQ ID NO 3)中。人們將理解信號肽酶的實際切割可以潛在地在前體Cel5H的氨基酸34和35之間的預(yù)測切割位點附近的肽鍵處發(fā)生，所述前體Cel5H諸如圖IB中所示。例如，實際的切割可能在前體Cel5H的位置30-40，優(yōu)選31-39，更優(yōu)選32-38，甚至更優(yōu)選32-37，還更優(yōu)選 33-36的氨基酸區(qū)內(nèi)的任一個肽鍵處發(fā)生，所述前體Cel5H如圖IB中所示。此外，除非明確地另外指明或通過上下文另外指明，每當(dāng)本文參考氨基酸位置來鑒定Cel5H的結(jié)構(gòu)域或其他基序時，這樣的參考針對Cel5H的成熟形式，諸如特別地以SEQ ID NO 3顯示的那種。當(dāng)用于本文時，術(shù)語“同源性”是指來自相同或不同分類單位的兩種大分子之間， 尤其是兩種多肽或多核苷酸之間的結(jié)構(gòu)相似性，其中所述相似性是由于共同祖先所產(chǎn)生的。因此，術(shù)語“同源物”是指具有所述結(jié)構(gòu)相似性的如此相關(guān)的大分子。優(yōu)選地，本文意指的Cel5H多肽的同源物包括所述具有天然序列的同源物。Cel5H多肽的多肽同源物可以優(yōu)選地顯示與Cel5H多肽的如本說明書中其他地方定義的至少約30 %，更優(yōu)選至少40 %，甚至更優(yōu)選至少50 %，還更優(yōu)選至少60 %，仍更優(yōu)選至少70%，諸如非常優(yōu)選至少80%或至少90%或至少95%的序列同一性。備選地或優(yōu)選另外地，Cel5H多肽的多肽同源物可以顯示與Cel5H多肽的如本說明書中其他地方定義的至少約50 %，更優(yōu)選至少60 %，甚至更優(yōu)選至少70 %，還更優(yōu)選至少80 %，仍更優(yōu)選至少 90%，諸如非常優(yōu)選至少95%的序列相似性。此外優(yōu)選地，Cel5H多肽的多肽同源物可以包含與Cel5H多肽的結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)的一個或多個功能結(jié)構(gòu)域，和優(yōu)選地包含GH家族5催化結(jié)構(gòu)域，CBM家族6結(jié)構(gòu)域和DZ結(jié)構(gòu)域中的一個或多個。優(yōu)選地，所述結(jié)構(gòu)域可以具有與Cel5H 類似的組織結(jié)構(gòu)，尤其是GH5-CBM6-DZ，通常具有插入的接頭。需注意，Cel5H多肽的優(yōu)選同源物為假單胞菌屬物種ND137的ACLA多肽。示例性的ACLA多肽包括但不限于Uniprot/Swissprot登錄號Q8VUT3 (于2002年3月1日輸入的序列版本1)所注釋的序列，該序列也重現(xiàn)在圖1D(SEQ ID NO 4)中。此序列對應(yīng)于包含信號序列的ACLA前體。示例性的成熟ACLA多肽，即，信號序列被加工掉的多肽，由各個前體的氨基酸位置觀-585表示，其示例性地重現(xiàn)在圖IE (SEQ ID NO 5)中。人們將理解信號肽酶的實際切割可能潛在地在前體ACLA的氨基酸27和28之間的預(yù)測切割位點附近的肽鍵處發(fā)生，所述前體ACLA諸如圖1D(SEQ ID NO 4)中所示。例如， 實際的切割可能在前體ACLA的位置23-32，優(yōu)選對_31，更優(yōu)選25-30，甚至更優(yōu)選沈-四的氨基酸區(qū)內(nèi)的任一個肽鍵處發(fā)生，所述前體ACLA如圖ID中所示。取決于容易被專業(yè)技術(shù)人員理解的背景，本文提及的ACLA多肽可以包括所述成熟形式和/或所述前體形式。此外，除非明確地另外指明或通過上下文另外指明，每當(dāng)本文參考氨基酸位置來鑒定ACLA的結(jié)構(gòu)域或其他基序時，這樣的參考針對ACLA的成熟形式，諸如特別地SEQ ID NO :5中顯示的那種。術(shù)語“片段”當(dāng)提及給定的多肽諸如Cel5H或其同源物，或提及給定的結(jié)構(gòu)域諸如 Cel5H的DZ結(jié)構(gòu)域或其同源物時，通常是指所述多肽的截短形式，其與所述多肽諸如所述 Cel5H或同源物或所述結(jié)構(gòu)域相比具有一個或多個氨基酸殘基的N-末端和/或C-末端缺失，但該片段剩余的基本序列與所述多肽諸如所述Cel5H或同源物或所述結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中的相應(yīng)位置相同。例如，給定多肽諸如Cel5H或其同源物的片段可以包含所述多肽諸如所述Cel5H 或同源物的約> 5個連續(xù)氨基酸，優(yōu)選> 10個連續(xù)氨基酸，更優(yōu)選> 20個連續(xù)氨基酸，甚至更優(yōu)選> 30個連續(xù)氨基酸，例如，^ 40個連續(xù)氨基酸，和最優(yōu)選> 50個連續(xù)氨基酸，例如，彡60，彡70，彡80，彡90，彡100，彡200或彡500個連續(xù)氨基酸的序列。例如，Cel5H的DZ結(jié)構(gòu)域或其同源物的片段可以包含所述DZ結(jié)構(gòu)域或其同源物的約> 5個連續(xù)氨基酸，優(yōu)選> 10個連續(xù)氨基酸，更優(yōu)選> 20個連續(xù)氨基酸，甚至更優(yōu)選 ^ 30個連續(xù)氨基酸，例如，^ 40個連續(xù)氨基酸，和最優(yōu)選> 50個連續(xù)氨基酸，例如，^ 60， 彡70，彡80，或彡90個連續(xù)氨基酸的序列。此外，給定多肽諸如Cel5H或其同源物或DZ結(jié)構(gòu)域的片段可以代表所述多肽諸如所述Ce 15H或同源物或DZ結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的至少約30 %，例如，至少50 %或至少 70 %，優(yōu)選至少80 %，例如，至少85 %，更優(yōu)選至少90 %，和仍更優(yōu)選至少95 %或甚至約 99%。術(shù)語給定多肽諸如Cel5H或其同源物或DZ結(jié)構(gòu)域的“變體(variant)，，是指這樣的多肽，其氨基酸序列與所述多肽諸如所述Cel5H或其同源物或DZ結(jié)構(gòu)域的天然序列基本上相同(即，大部分但非全部相同)?！盎旧舷嗤笔侵钢辽偌s85%相同，例如，優(yōu)選至少 90%相同，例如，至少91%相同，92%相同，更優(yōu)選至少93%相同，例如，94%相同，甚至更優(yōu)選至少95 %相同，例如，至少96 %相同，仍更優(yōu)選至少97 %相同，例如，至少98 %相同，和最優(yōu)選至少99%相同。兩個多肽之間的序列同一性可以通過多肽的氨基酸序列的最優(yōu)比對(兩個蛋白序列的最優(yōu)比對是使配對得分減去關(guān)于引入空位的任何罰分的總和最大化的比對；并且可以優(yōu)選地通過算法的計算機化執(zhí)行來進行，諸如“Gap”，使用Needleman和^msch 1970 (J Mol Biol (分子生物學(xué)雜志)48 :443-453)的算法，或“Bestfit”，使用Smith和 Waterman 1981 (J Mol Biol (分子生物學(xué)雜志)147 195-197)的算法，它們可獲自，例如， 來自Accelrys的GCG v. 11. 1. 2包)，和一方面對該比對中多肽含有相同氨基酸殘基的位置數(shù)目和另一方面對該比對中兩個多肽的序列不同的位置數(shù)目評分來確定。當(dāng)兩個多肽在比對中的給定位置處含有不同的氨基酸殘基(氨基酸置換)時或當(dāng)多肽之一在比對中的給定位置處含有氨基酸殘基而另一個多肽不含氨基酸殘基或反之亦然(氨基酸插入或缺失) 時，這兩個多肽在比對中的該位置處的序列不同。序列同一性計算為比對中多肽含有相同氨基酸殘基的位置數(shù)相對于比對中的位置總數(shù)目的比例(百分比)。用于執(zhí)行序列比對和確定序列同一性的更多合適的算法包括基于最初由Altschul等1990 (J Mol Biol(分子生物學(xué)雜志)215 :403-10)所述的基本局部比對搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool) (BLAST)的那些，諸如由 Tatusova 和 Madden 1999 (FEMS Microbiol Lett (FEMS 微生物學(xué)通訊)174 :247-250)所述的〃 Blast 2序列"算法，諸如使用其缺省設(shè)置。給定多肽諸如Cel5H或其同源物或DZ結(jié)構(gòu)域的變體當(dāng)用于本文時也具體地包括與所述多肽諸如所述Cel5H或其同源物或DZ結(jié)構(gòu)域具有一定程度的相似性的多肽。優(yōu)選地，這樣的變體可以為至少約90%相似，例如，優(yōu)選至少91%相似，例如，至少92%相似， 93 %相似，更優(yōu)選至少94 %相似，例如，95 %相似，甚至更優(yōu)選至少96 %相似，例如，至少 97%相似，仍更優(yōu)選至少98%相似，例如，至少99%相似。兩個多肽之間的序列相似性可以通過多肽的氨基酸序列的最優(yōu)比對(見上)，和一方面對該比對中多肽含有相同或相似(即，保守置換的)氨基酸殘基的位置數(shù)目和另一方面對該比對中兩個多肽的序列另外不同的位置數(shù)目評分來確定。當(dāng)兩個多肽在比對中的給定位置處含有非保守氨基酸殘基時或當(dāng)多肽之一在比對中的給定位置處含有氨基酸殘基而另一個多肽不含氨基酸殘基或反之亦然(氨基酸插入或缺失)時，這兩個多肽在比對中該位置處的序列另外不同。序列相似性計算為比對中多肽含有相同或相似氨基酸殘基的位置數(shù)相對于比對中的位置總數(shù)目的比例(百分比)。應(yīng)該理解提及片段和/或變體時，說明書也廣泛地考慮給定多肽諸如Cel5H或其同源物或DZ結(jié)構(gòu)域的變體的片段，以及所述多肽的片段的變體。術(shù)語“功能”當(dāng)提及給定多肽諸如Cel5H或其同源物或DZ結(jié)構(gòu)域的片段和/或變體時是指這樣的片段和變體，其至少部分地保留了相應(yīng)多肽諸如所述Cel5H或其同源物或 DZ結(jié)構(gòu)域的生物活性或功能性。優(yōu)選，這樣的功能片段和/或變體可以保留至少約20%， 例如，至少30%，或至少40%，或至少50%，例如，至少60%，更優(yōu)選至少70%，例如，至少 80 %，仍更優(yōu)選至少85 %，還更優(yōu)選至少90 %，和最優(yōu)選至少95 %或甚至100 %的相應(yīng)多肽諸如所述Cel5H或其同源物或DZ結(jié)構(gòu)域的活性。有可能，這樣的功能片段和/或變體可以甚至具有比相應(yīng)多肽諸如所述Cel5H或同源物或DZ結(jié)構(gòu)域更高的活性。給定多肽諸如Cel5H或其同源物或DZ結(jié)構(gòu)域的功能片段和/或變體可以在其生物活性或功能的至少一個方面和優(yōu)選更多或所有方面上與所述多肽的功能等同。所述 Cel5H或其同源物的生物學(xué)功能的相關(guān)方面包括特別地但不限于解聚纖維素活性或纖維素酶活性，關(guān)于不同纖維素物質(zhì)(例如，結(jié)晶、半結(jié)晶或無定形纖維素或半纖維素)的活性譜， 降解結(jié)晶纖維素物質(zhì)的能力或偏好，和與纖維素物質(zhì)相互作用或結(jié)合的能力。Cel5H或其同源物的所述DZ結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)功能的相關(guān)方面包括特別地但不限于結(jié)合纖維素和特別地結(jié)合結(jié)晶纖維素，和/或低聚作用活性。Cel5H或其同源物或DZ結(jié)構(gòu)域的給定片段和/或變體的生物活性，包括所述活性的上述方面，可以通過標(biāo)準(zhǔn)試驗，諸如例如實施例章節(jié)中給出的酶活性試驗來確定。術(shù)語“產(chǎn)溶劑的(solventogenic)” 或“產(chǎn)生溶劑的(solvent-producing) ” 具有其本領(lǐng)域已確定的含義并且特別地指微生物諸如細菌(即，產(chǎn)溶劑細菌)從糖源諸如例如己糖、戊糖或寡糖產(chǎn)生一種或多種非氣態(tài)有機液體或溶劑，諸如，尤其是乙醇，丙酮，丁醇， 丙酸，丁酸，醚或甘油的能力。特別地，該術(shù)語包含天然存在的產(chǎn)溶劑生物體，帶有天然存在的或誘導(dǎo)的突變的產(chǎn)溶劑生物體，和已經(jīng)被遺傳修飾的產(chǎn)溶劑生物體。
術(shù)語“產(chǎn)乙醇的(ethanologenic)”或“產(chǎn)生乙醇的(ethanol-producing) ” 意在表示微生物諸如細菌(即，產(chǎn)乙醇細菌)從糖源諸如例如己糖、戊糖或寡糖產(chǎn)生至少或優(yōu)選地主要乙醇的能力，更優(yōu)選地從糖類產(chǎn)生乙醇作為最豐富的非氣態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的能力。特別地，該術(shù)語包括天然存在的產(chǎn)乙醇生物體，帶有天然存在的或誘導(dǎo)的突變的產(chǎn)乙醇生物體， 和已經(jīng)被遺傳修飾的產(chǎn)乙醇生物體。合適的產(chǎn)溶劑微生物的實例包括但不限于梭菌屬和發(fā)酵單胞菌屬的菌株，諸如，但不限于本文例證的那些。術(shù)語“分離(isolating)，，當(dāng)提及具體組分時通常表示將該組分與組合物的至少一種其他組分分開，由此前一組分從該組合物中被“分離”。特別地，術(shù)語“分離”和“分離的(isolated)”在本文中可以指樣品中增加量的所需的一種或多種蛋白或一種或多種多肽。相對量可以表示為待分離的所需一種或多種蛋白或一種或多種多肽的濃度或量和樣品中總蛋白的濃度或量之間的比率。另外，該術(shù)語可以包括將所需的一種或多種蛋白或一種或多種多肽與非蛋白細胞組分(例如，細胞壁，液體，核酸，等)分開。術(shù)語“重組核酸”或“重組核酸分子”當(dāng)用于本文時通常是指包含使用重組DNA技術(shù)(諸如例如分子克隆和核酸擴增)產(chǎn)生和/或連接在一起的區(qū)段的核酸分子(諸如，例如，DNA, cDNA或RNA分子)。通常，重組核酸分子可以包含一個或多個非天然存在的序列， 和/或可以包含與天然存在的序列對應(yīng)的區(qū)段，所述區(qū)段不象它們在未被修飾的來源基因組中定位的那樣被定位。當(dāng)重組核酸分子在已經(jīng)引入其的宿主生物體中復(fù)制時，子代核酸分子也包括在術(shù)語“重組核酸分子”的范圍內(nèi)。在具體實施方案中，重組核酸分子可以穩(wěn)定地整合至宿主生物體的基因組中，諸如例如在一個或多個隨機位置處整合或以靶向的方式，諸如，例如，借助于同源重組整合， 或重組核酸分子可以作為染色體外元件存在或包含在染色體外元件內(nèi)，其中后者可以是自復(fù)制的。提出重組DNA技術(shù)的一般原理的標(biāo)準(zhǔn)參考文獻包括Molecular Cloning =A Laboratory Manual (分子克隆實驗室指南)，第二版，第1_3卷，Sambrook等編輯，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, N. Y. ,1989 ；Current Protocols in Molecular Biology (現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗技術(shù))，Ausubel 等編輯，Greene Publishing and ffiley-Interscience,New York (紐約)，1992 (定期更新)Jnnis 等，PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (PCR 實驗技術(shù)方法和應(yīng)用指南)，Academic Press =San Diego (圣地亞哥)，1990。微生物學(xué)的一般原理見，例如，Davis，B. D.等， Microbiology (微生物學(xué))，第三版，Harper & Row, publishers, Philadelphia (費城)， Pa. (1980)。術(shù)語“重組多肽”當(dāng)用于本文中時是指通過重組核酸分子的表達由宿主生物體產(chǎn)生的多肽或蛋白，所述重組核酸分子已經(jīng)引入至所述宿主生物體或其祖先中，并且其包含編碼所述多肽或蛋白的序列。此外，術(shù)語“重組的”或“轉(zhuǎn)化的”當(dāng)在本文中用于提及宿主生物體、微生物或細胞時，包括其中已經(jīng)引入了重組核酸分子的宿主生物體、微生物或細胞，以及所述宿主生物體、微生物或細胞的重組子代。在此，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”包括將外來核酸諸如重組核酸引入或轉(zhuǎn)移至宿主生物體、微生物或細胞中。這樣引入的核酸可以優(yōu)選地在所述宿主生物體、微生物或細胞的進一步生長和細胞分裂全程中得以保持?？梢允褂萌魏纬Ｒ?guī)的基因轉(zhuǎn)移方法來實現(xiàn)轉(zhuǎn)化，諸如而不限于電穿孔，電滲透，化學(xué)轉(zhuǎn)化，脂轉(zhuǎn)染(lipofection)，病毒-或噬菌體-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，等。“編碼”的意思是核酸序列或其部分依靠被研究的生物體的遺傳密碼對應(yīng)于特定的氨基酸序列，例如，所需多肽或蛋白的氨基酸序列。通過舉例，“編碼”特定多肽或蛋白的核酸可以包括基因組，hnRNA,前-mRNA，mRNA, cDNA,重組或合成的核酸。優(yōu)選，編碼特定多肽或蛋白的核酸可以包含編碼所述多肽或蛋白的可讀框(ORF)。 “可讀框”或“0RF”是指一連串編碼核苷酸三聯(lián)體(密碼子)，其以本身已知的翻譯起始密碼子開始并以本身已知的翻譯終止密碼子結(jié)束，并且不包含任何內(nèi)部的框內(nèi)翻譯終止密碼子，和潛在地能夠編碼多肽。因此，該術(shù)語可以與本領(lǐng)域中使用的“編碼序列”同義。在一個實施方案中，編碼本發(fā)明的一種或多種多肽的核酸序列或ORF可以是以本身已知的方式為了在特定生物體例如，微生物，更特別地目的細菌中表達而最優(yōu)化的密碼子?？色@得多種生物體的密碼子使用偏好和密碼子頻率，例如，經(jīng)由Nakamura等，2000 (Nucl Acids Res(核酸研究)28 : 所述的密碼子使用數(shù)據(jù)庫(Codon Usage Database) (http://www. kazusa. or. jp/codon/)。如本文教導(dǎo)的重組微生物中目的多肽的表達可以通過可操作地連接編碼所述多肽的核酸序列或ORF與允許在所述微生物中的表達的調(diào)節(jié)序列來實現(xiàn)。就此而言，術(shù)語“表達”多肽當(dāng)指重組生物體時包括能夠，例如，在合適的培養(yǎng)條件下或在添加誘導(dǎo)物時(例如， 在使用可誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)序列時)表達該多肽的重組生物體?！翱刹僮鞯倪B接”是其中調(diào)節(jié)性核酸序列和要表達的序列以允許所述表達的方式連接的連接。例如，序列，諸如，例如，啟動子和0RF，可以被稱為可操作地連接，條件是所述序列之間的連接的性質(zhì)不會(1)導(dǎo)致引入移碼突變(frame-shift mutation), (2)干擾啟動子指導(dǎo)ORF轉(zhuǎn)錄的能力，(3)干擾ORF從啟動子序列轉(zhuǎn)錄的能力。表達所需的調(diào)節(jié)序列或元件的準(zhǔn)確性質(zhì)可以在生物體之間發(fā)生變化，但典型地包括啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子，和任選地增強子。提及“啟動子”或“增強子”要在其最寬泛的背景中理解并且包括準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄起始所需的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列和當(dāng)可適用時對基因表達的準(zhǔn)確的空間和/或時間的控制或其對例如，內(nèi)部或外部(例如，外源性)刺激物的反應(yīng)。更特別地，“啟動子”可以描述核酸分子，優(yōu)選DNA分子上的一個區(qū)域，RNA聚合酶與所述區(qū)域結(jié)合并啟動轉(zhuǎn)錄。啟動子優(yōu)選地，但非必需地，位于轉(zhuǎn)錄受其控制的序列的上游，即5’。典型性，在原核生物中，啟動子區(qū)可以包含啟動子本身和當(dāng)轉(zhuǎn)錄為RNA時將發(fā)出蛋白質(zhì)合成起始信號的序列(例如，Shine-Dalgarno序列)兩者。在實施方案中，本文考慮的啟動子可以是組成型的或可誘導(dǎo)型的。借助于舉例，適合于在梭菌屬諸如丙酮丁醇梭菌中的表達的組成型啟動子包括而不限于丙酮丁醇梭菌的硫解酶基因的啟動子(Pthl啟動子)，乙酰乙酸脫羧酶基因的啟動子 (Pad。啟動子)，磷酸丁酰轉(zhuǎn)移酶(phosphotransbutyrylase)基因的啟動子(Pptb啟動子)，木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)木糖操縱子的木糖可誘導(dǎo)型啟動子(Pxyl啟動子)。因此，在具體實施方案中，提供了這樣的啟動子，其是受操縱基因控制的啟動子。 當(dāng)用于本文中時，術(shù)語“操縱基因”是指一種核苷酸序列，優(yōu)選DNA序列，其控制序列從啟動子轉(zhuǎn)錄的起始和/或維持。典型地，操縱基因通常可以位于啟動子和其轉(zhuǎn)錄被啟動子控制的下游序列之間。通常，操縱基因能夠結(jié)合阻遏物多肽，由此其減少從所述啟動子的轉(zhuǎn)錄。 有用的阻遏物可以在其結(jié)合操縱基因的狀態(tài)和其不結(jié)合操縱基因的狀態(tài)之間交替，并且這樣的交替可以有利地受外部條件，例如，外部物質(zhì)或特定代謝物的控制。因此，在包含相容性阻遏物的宿主細胞中，在本發(fā)明的核酸中包含操縱基因可以允許控制啟動子的活性和從所述啟動子的表達。操縱基因序列通?？梢詠碓从诩毦旧w。還應(yīng)該理解本發(fā)明的核酸可以編碼一種或多于一種的目的多肽。此外，在預(yù)期表達兩種或多種多肽時，所述表達可以來自多個獨立的表達單元，或可以來自單個表達單元 (即，多順反子表達(multi-cistronic expression))，所述單個表達單元包含兩個或多個連續(xù)的受常見的調(diào)節(jié)元件控制的0RF。借助于舉例，編碼兩種或多種多肽的表達單元可以通過將各個ORF的翻譯起始密碼子與控制翻譯起始的序列(例如，核糖體進入序列)締合來產(chǎn)生。術(shù)語“終止子”或“轉(zhuǎn)錄終止子”通常是指在轉(zhuǎn)錄單元末端處的序列元件，其發(fā)出轉(zhuǎn)錄終止的信號。例如，終止子通常位于編碼目的多肽的一個或多個ORF的下游，即3’。例如，在重組核酸包含兩個或多個0RF，例如，連續(xù)排列并一起形成多順反子轉(zhuǎn)錄單元的ORF 的情況下，轉(zhuǎn)錄終止子可以有利地位于最下游的ORF的3’。在優(yōu)選的實施方案中，可以有利地針對要用于轉(zhuǎn)化本發(fā)明的微生物的重組核酸提供控制本文教導(dǎo)的一種或多種多肽的表達的調(diào)節(jié)序列。然而，還考慮這樣的實施方案，其中重組核酸提供缺少一個或多個調(diào)節(jié)序列的一個或多個編碼序列，而需要的調(diào)節(jié)序列由被轉(zhuǎn)化的微生物提供(諸如，例如，其中該重組核酸插入至包含合適的調(diào)節(jié)序列的染色體或附加體(印isomal)區(qū)域中)。梭菌屬和丙酮丁醇梭菌當(dāng)用于本文中時是指本領(lǐng)域中如所述那樣已知的細菌分類單位，并且特別地包括屬于所述分類單位的細菌、細菌菌種、菌株、亞種和培養(yǎng)物，以及天然存在的或野生型標(biāo)本的修飾的或改造的，諸如例如突變的或遺傳改造的衍生物。通過指導(dǎo)而非限制，可獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的梭菌屬的分離菌株可以，尤其以關(guān)于丙酮丁醇梭菌的登錄號ATCC 824, ATCC 4259, ATCC 39236或ATCC 43084來訂購。例如， 拜氏梭菌(Clostridium bei jerinckii)的分離菌株可以，尤其以登錄號ATCC 858和ATCC 25752來訂購。需注意，由本發(fā)明的產(chǎn)溶劑微生物表達的多肽可以被靶定以用于分泌。為了實現(xiàn)分泌，編碼多肽的核酸序列可以與編碼分泌信號序列的序列可操作地連接。就此而言，“可操作地連接”表示編碼信號序列的序列和編碼待分泌的多肽的序列在框內(nèi)(in frame)或同相(in phase)連接，從而在表達時，信號肽促進如此與其連接的多肽的分泌。應(yīng)當(dāng)理解，適當(dāng)?shù)男盘栃蛄锌扇Q于期望在其中進行分泌的微生物的類型。例如， 相對于革蘭氏陰性菌，在革蘭氏陽性菌中可能需要不同信號序列。借助于實例而非限制，革蘭氏陽性菌中的分泌，特別是梭菌屬如丙酮丁醇梭菌中的分泌，可使用如下信號序列完成，所述信號序列為解纖維素梭菌的Cel5A前體多肽的信號序列(示例序列Aenbank登錄號AAA51444,1994年10月31日修改的序列版本1)，或解纖維素梭菌的CipC前體支架蛋白的信號序列(示例序列=Genbank登錄號AAC28899，2005 年12月5日修改的序列版本2)，或丙酮丁醇梭菌的CipA前體支架蛋白的信號序列(示例序列Genbank登錄號AAK78886, 2006年1月19日修改的序列版本1)。
此外非限制地，革蘭氏陰性菌中的分泌可以經(jīng)由Sec途徑，例如，使用運動發(fā)酵單胞菌(Z.mobilis)的葡糖酸內(nèi)酯酶前體多肽的信號序列(示例序列Genbank登錄號 CAA47637,2006年10月19日修改的序列版本1)或糖類選擇性孔蛋白(porine)0prB的信號序列(示例序列=Genbank登錄號AAV88688, 2005年1月25日修改的序列版本1)來實現(xiàn)，或經(jīng)由雙精氨酸轉(zhuǎn)運(Tat)途徑，例如，使用運動發(fā)酵單胞菌的葡萄糖果糖氧化還原酶前體多肽的信號序列(示例序列=Genbank登錄號CAB02496, 2006年10月19日修改的序列版本1)來實現(xiàn)。還應(yīng)當(dāng)理解可以使用將要通過本文教導(dǎo)的微生物表達的多肽的天然(或同源的、 內(nèi)源性)信號肽，只要它們在所述微生物中是有功能的。因此，借助于舉例，可以使用Cel5H 前體多肽的內(nèi)源性或同源的分泌信號序列來實現(xiàn)Cel5H或相關(guān)多肽的分泌。特別地，由于 S. degradans是一種革蘭氏陰性菌，因此Cel5H的內(nèi)源性或同源的信號序列可以特別適合于其在其他革蘭氏陰性菌中的分泌。在其他實施方案中，多肽諸如Cel5H和相關(guān)多肽可以使用異源的信號序列進行分泌。天然Cel5H多肽的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)可概括為GH5-PSL-CBM6-EPR-DZ，成熟Cel5H中的結(jié)構(gòu)域邊界的示意性指示顯示在圖9中。Cel5H或其同源物的功能片段優(yōu)選地含有GH5， CBM6和DZ結(jié)構(gòu)域中的一個或多個，或與其對應(yīng)的結(jié)構(gòu)域(例如，Cel5H的同源物和/或變體內(nèi)的類似結(jié)構(gòu)域)。優(yōu)選地，包含在這些片段內(nèi)的結(jié)構(gòu)域可以如本文預(yù)期的那樣是功能性的。因此，在具體實施方案中，本發(fā)明考慮了一些片段，諸如與下列結(jié)構(gòu)域組織結(jié)構(gòu)對應(yīng)的那些:GH5, GH5-PSL, GH5-PSL-CBM6，GH5-PSL-CBM6-EPR, PSL-CBM6，PSL-CBM6-EPR, PSL-CBM6-EPR-DZ, CBM6, CBM6-EPR, CBM6-EPR-DZ,^P EPR-DZ, DZ。本發(fā)明還設(shè)想了與成熟 Cel5H的結(jié)構(gòu)域的組合對應(yīng)的片段，諸如，但不限于EPR-DZ-EPR-DZ。需注意，本發(fā)明還涉及Cel5H和具有有用的異源結(jié)構(gòu)域的相關(guān)多肽的多種融合。 在此背景中，術(shù)語“異源的”表示所述一個或多個結(jié)構(gòu)域來源于除Cel5H多肽或其同源物以外的多肽。因此，“異源的”當(dāng)指結(jié)構(gòu)域的組合時是指這樣的事實，即不同的結(jié)構(gòu)域不源自 (或不是天然地存在于)同一蛋白。然而，也可以考慮另外的Cel5H來源的結(jié)構(gòu)域與Cel5H 多肽或其同源物、或其片段和/或變體的融合。術(shù)語“融合”在本文中被寬泛地預(yù)期為包括尤其是遺傳融合(即，將不同的部分融合為單個可讀框)以及通過化學(xué)和/或物理手段(例如，化學(xué)交聯(lián)或光電耦合)誘導(dǎo)的融合。此外，融合包括直接融合或經(jīng)由接頭的融合。合適的接頭可以包括而不限于至少3，優(yōu)選至少4或5，更優(yōu)選至少7和仍更優(yōu)選至少12個氨基酸，諸如3-15個氨基酸，且優(yōu)選包含非帶電氨基酸，富含非帶電氨基酸或由非帶電氨基酸組成的肽序列，所述非帶電氨基酸優(yōu)選選自甘氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、纈氨酸、脯氨酸、蘇氨酸，并且更優(yōu)選甘氨酸或絲氨酸。示例性的糖苷水解酶(GH)催化結(jié)構(gòu)域可以來源于本身已知的糖苷水解酶(糖苷酶)或尤其是使用已確定的程序鑒定和分離的未來糖苷水解酶。示例性的糖苷酶包括分組在NC-IUBMB的EC 3.2.1. “糖苷酶”分類中的那些，更優(yōu)選能夠解聚纖維素和木質(zhì)纖維素(lingo-cellulosic)物質(zhì)的糖苷酶，諸如，例如，纖維素酶(EC 3. 2. 1. 4.)，纖維素 1，4-β-cellobiosidases(EC 3.2.1.91)和加工性內(nèi)切纖維素酶(EC 3. 2. 1. 4. /EC 3 ■ 2 ■ 1· 91 ) ο
術(shù)語糖結(jié)合組件(CBM)在本領(lǐng)域中是已知的，并且普遍地廣義地涵蓋存在于糖苷水解酶中或來源于糖苷水解酶的所有非催化性糖(sugar)-或糖(carbohydrate)-結(jié)合組件。本文優(yōu)選的CBM組件可以包括特異性結(jié)合纖維素或纖維素物質(zhì)的那些并且備選地是指纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)。CMB和它們的結(jié)構(gòu)和功能特性的綜述參見尤其是 Tomme 等-1995( "Cellulose-binding domains-classification and properties (纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域分類和特性)”，于Enzymatic Degradation of Insoluble Polysaccharides (不溶性多糖的酶降解)，Saddler JN & Penner M，編輯，142-163 頁， American Chemical Society (美國化學(xué)協(xié)、會)，Washington (華盛頓))禾口 Boraston 等， 2004( "Carbohydrate-binding modules :fine tuning polysaccharide recognition ( H 結(jié)合組件精細調(diào)節(jié)的多糖識別)".Biochem J(生物化學(xué)雜志)382 :769-81)。黏結(jié)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域當(dāng)用于本文中時通常是指能夠特異性結(jié)合多纖維素酶體支架蛋白亞基的一個或多個受體(黏結(jié)蛋白)結(jié)構(gòu)域的所有多肽結(jié)構(gòu)域。示例性的黏結(jié)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括存在于組裝成多纖維素酶體的糖苷水解酶中或來源于所述糖苷水解酶的錨定結(jié)構(gòu)域。本文考慮I型和II型錨定結(jié)構(gòu)域兩者。對錨定結(jié)構(gòu)域的解釋參見尤其是 Lytle 等，2001 ( "Solution structure of a type I dockerin domain，a novel prokaryotic, extracellular calcium-binding domain(I 型錨定結(jié)構(gòu)域，艮口一禾中新的原核生物細胞外鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域的溶液結(jié)構(gòu))”.J Mol Biol (分子生物學(xué)雜志)307: 745-753) ,Adams 等，2005 ("Structural characterization of type II dockerin module from the cellulosome of Clostridium thermocellum calcium-induced effects on conformation and target recognition(來自熱纖梭菌的多纖維素酶體的II型錨定組件的結(jié)構(gòu)表征鈣誘導(dǎo)的對構(gòu)象和靶標(biāo)識別的作用)” .Biochemistry (生物化學(xué))44 2173-82)禾口參見 Bayer 等，1998( "cellulosomes-structure and ultrastructure (多纖維素酶體-結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu))”.J Struct Biol (結(jié)構(gòu)生物學(xué)雜志)124 :221-234)。用于測定錨定蛋白-黏結(jié)蛋白相互作用的合適的測定法，諸如用于指導(dǎo)選擇本文中合適的錨定結(jié)構(gòu)域，描述于尤其是 Haimovitz 等，2008 ( "Cohesin-dockerin microarray Diverse specificities between two complementary families of interacting protein modules(黏結(jié)蛋白-錨定蛋白微陣列兩個互補家族的相互作用蛋白組件之間不同的特異性)，，.Proteomics (蛋白組學(xué))8 :968-979)。另外考慮的是本文教導(dǎo)的多肽與有效用于糖聚合物代謝，特別地有效用于纖維素代謝中的其他多肽或酶，優(yōu)選重組多肽或酶的共表達和任選地共分泌。術(shù)語“共表達”通常涉及由相同的微生物，特別地由所述微生物的相同細胞表達兩種或多種蛋白或多肽(稱為被“共表達的”)。合適的用于實現(xiàn)兩種或多種多肽的共表達的系統(tǒng)本身是已知的。非限制地，共表達的多肽可以由受相同或不同的調(diào)節(jié)元件控制的單獨的順反子編碼，或可以由單個多順反子元件編碼；這樣的順反子可以在染色體上或在相同或不同的外遺傳元件 (epigenetic element),或其組合等上。術(shù)語“糖苷水解酶”或“糖苷酶”通常包括能夠水解糖苷鍵，更特別地0-，N-或S-糖苷鍵，甚至更優(yōu)選在寡糖和/或多糖物質(zhì)中的這樣的鍵的酶和酶復(fù)合物。該術(shù)語包括外切糖苷酶以及內(nèi)切糖苷酶。該術(shù)語特別地包括分組在NC-IUBMB的EC 3.2.1. “糖苷酶”分類中的糖苷酶。
術(shù)語“纖維素酶”通常包括能夠水解纖維素和含纖維素物質(zhì)的酶和酶復(fù)合物。該術(shù)語包括而不限于下列的纖維素酶類型纖維二糖水解酶(l，4-i3_D-葡聚糖纖維二糖水解酶，EC 3.2. 1.91)，內(nèi)切-0-1，4-葡聚糖酶(內(nèi)切_1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶， EC 3. 2. 1. 4)，加工性內(nèi)切纖維素酶(EC 3. 2. 1. 4. /EC 3. 2. 1. 91.)和β -葡萄糖苷酶(EC 3. 2. 1. 21)。纖維素酶進一步包括內(nèi)切葡聚糖酶以及(加工性)外切葡聚糖酶，并且涵蓋產(chǎn)生各種長度的單體和/或低聚體的酶。該術(shù)語還包括纖維二糖酶，氧化纖維素酶，葡萄糖苷酶，纖維素磷酸化酶，和通常由此表示的其他酶。該術(shù)語包括能夠降解各種形式的纖維素的酶，所述纖維素諸如而不限于結(jié)晶纖維素，半結(jié)晶纖維素，無定形纖維素，半纖維素和/或化學(xué)或生物改性的纖維素形式。借助于舉例且非限制地，解纖維素梭菌的纖維素分解系統(tǒng)已由B6laich等， 1997( "The cellulolytic system of Clostridium cellulolyticum(角軍纖維素梭菌的纖維素分解系統(tǒng))”· J Biotechnol(生物技術(shù)雜志)57 :3-14)綜述；且Saccharophagus degradans的纖維素分解系統(tǒng)由Taylor等，2006(見上)綜述。本發(fā)明進一步考慮了改造的多纖維素酶體，其包含本文教導(dǎo)的多肽，特別地Cel5H 和相關(guān)多肽(例如，DZ-結(jié)構(gòu)域和包含該結(jié)構(gòu)域的多肽)。如本領(lǐng)域中所已知的，天然的多纖維素酶體代表某些細菌分類單位，諸如尤其是梭菌屬和擬桿菌屬(Bacteroides)的細胞外的、多酶纖維素分解復(fù)合物。天然多纖維素酶體的基本組織結(jié)構(gòu)包括組織化多肽(支架蛋白)，通常包含一個或多個相同或不同的糖結(jié)合組件(CBM)和一個或多個相同或不同的受體(黏結(jié)蛋白)結(jié)構(gòu)域，它們促進糖苷酶或纖維素分解酶通過與所述酶中的關(guān)聯(lián)錨定結(jié)構(gòu)域的相互作用而結(jié)合至多纖維素酶體復(fù)合物中。天然多纖維素酶體的這些結(jié)構(gòu)特征也可以用于改造的多纖維素酶體中，由此所需的糖結(jié)合和糖解聚活性可以結(jié)合至改造的多纖維素酶體中。用于產(chǎn)生改造的多纖維素酶體的技術(shù)在本領(lǐng)域中已確定(參見，例如，F(xiàn)ierobe等，2002( "Degradation of cellulose substrates by cellulosome chimeras. Substrate targeting versus proximity of enzyme components (多纖維素酶體嵌合體降解纖維素底物。酶組分的底物靶向性與接近性的比較)”· J Biol Chem(生物化學(xué)雜志)277 =49621-30) ；Fierobe等， 2005("Action of designer cellulosomes on homogeneous versus complex substrates controlled incorporation of three distinct enzymes into a defined trifunctional SCaff0ldin(設(shè)計的多纖維素酶體對均質(zhì)底物與復(fù)雜底物的作用比較三種不同的酶可控地結(jié)合至確定的三功能支架蛋白中)”.J Biol Chem(生物化學(xué)雜志)280 :16325-34)； 以及 Perret 等，2004 ( "Production of heterologous and chimeric scaffoldins by Clostridium acetobutylicum ATCC 8 ”(丙酮丁醇梭菌ATCC8M產(chǎn)生異源和嵌合的支架蛋白)· J Bacteriol (細菌學(xué)雜志)186 :253-7))。通常，改造的多纖維素酶體可以含有雜交的或嵌合的支架蛋白多肽，其包含相同或不同的糖類底物特異性的一個或多個CBM組件，和一個或多個能夠結(jié)合相同或不同的關(guān)聯(lián)錨定結(jié)構(gòu)域的黏結(jié)蛋白結(jié)構(gòu)域。酶，諸如特別地糖苷酶或纖維素分解酶，可以借助于用于支架蛋白多肽中存在的黏結(jié)蛋白結(jié)構(gòu)域的關(guān)聯(lián)錨定組件(正常存在于所述酶中和/或被改造至所述酶中)結(jié)合至多纖維素酶體中。所述酶也可以包含CBM或其他非催化性結(jié)構(gòu)域。 這樣的改造的多纖維素酶體在本領(lǐng)域中通常被稱為“嵌合的”或“雜交的”多纖維素酶體或“小型多纖維素酶體”。備選地或另外地，所述一種或多種酶，諸如糖苷酶或纖維素分解酶可以與支架蛋白主鏈，諸如，例如，通過作為同一多肽鏈的一部分表達(即，遺傳融合)來共價連接。 這樣多纖維素酶體通常被稱為“共價的”(Mingardon等，2007，“Exploration of new geometries in cellulosome-like chimeras (在多纖維素酶體樣嵌合體中研究新的幾何學(xué))” Appl. Environ. Microbiol.(應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué))73 :7138-7149)。因此，改造的多纖維素酶體，諸如雜交的，嵌合的，小型_，或共價的多纖維素酶體， 或這些形態(tài)的任意組合，或任意的其他改造的多纖維素酶體形式，被考慮與本文教導(dǎo)的多肽一起使用。術(shù)語“纖維素”本身在本領(lǐng)域中是已知的。借助于進一步的解釋而非限制，該術(shù)語可以包括所有形式的纖維素，諸如而不限于天然存在和非天然存在的纖維素形式，諸如，例如，結(jié)晶纖維素，半結(jié)晶纖維素，微晶纖維素，無定形纖維素，半纖維素，再生纖維素，和/或化學(xué)或生物學(xué)改性或衍生的纖維素形式，諸如，例如，其醚或酯，等。富含結(jié)晶纖維素的物質(zhì)可以包含而不限于，至少約(w/w)，例如，彡5% (w/w)， 優(yōu)選至少約10% (w/w)，例如，彡20%，彡30%或彡40% (w/w)，更優(yōu)選至少約50% (w/w)， 例如，彡60%或彡70% (w/w)，仍更優(yōu)選至少約80% (w/w)，例如，彡90% (w/w)的本領(lǐng)域中所理解的結(jié)晶纖維素，半結(jié)晶和/或微晶纖維素，更優(yōu)選結(jié)晶纖維素。用重組微生物諸如本文教導(dǎo)的重組微生物處理或接觸含纖維素物質(zhì)的方法和過程在本領(lǐng)域中是普遍已知的，并且可以無限制地包括各種規(guī)模的工業(yè)發(fā)酵過程。要如此發(fā)酵的物質(zhì)可以例如，以固體，半固體，液體或可溶形式提供，或作為勻漿物或提取物提供，或作為(水性)分散體或混懸液提供，或作為(部分)分離的或純化的和/或預(yù)處理的(例如，通過稀酸預(yù)處理，氫氧化鈉預(yù)處理，石灰(lime)預(yù)處理，用具有水的有機溶劑預(yù)處理， 熱液過程，或AFEX)木質(zhì)素纖維素物質(zhì)或纖維素物質(zhì)或纖維素提供，或以其他合適的本身用于纖維素材料和生物量的解聚和/或發(fā)酵的形式提供。因此，本發(fā)明還考慮起始培養(yǎng)物， 其包含本發(fā)明的微生物，任選地與一種或多種其他所需的微生物組合。用于纖維素利用的生物技術(shù)方法的綜述參見尤其是Lynd等，2002( “Microbial cellulose utilization fundamentals and biotechnology (微生物纖維素利用原理和生物技術(shù))” .Microbiol Mol Biol Rev (微生物學(xué)和分子生物學(xué)評論)66 :506-77)，和 Himmel 等，2007 ( "Biomass recalcitrance !engineering plants and enzymes for biofuels production(生物量頑抗性改造用于生物燃料制備的植物和酶)，，kience (科學(xué))315 =804-807)。通過下面的非限制性實施例進一步支持上面的各個方面和實施方案。
實施例實施例1 :Cel5H的新DZ結(jié)構(gòu)域的鑒定已發(fā)表的對由S. degradans產(chǎn)生的推測的纖維素酶的分析(Taylor等，2006，見上)表明關(guān)于Cel5H的下列組織結(jié)構(gòu)(從酶的N-末端至C-末端)信號序列/催化性組件(GH-家族幻/富含絲氨酸的接頭/屬于CBM-家族6的糖結(jié)合組件/富含谷氨酸和脯氨酸的接頭，其他的名稱為信號序列-GH5-PSL-CBM6-Era。我們進行了更充分的序列分析，該分析揭示在Cel5H的C-末端處，S卩，SEQ ID N02 (圖1B)中從位置496至位置596，存在新的約100個氨基酸長的稱為DZ結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域。 因此，Cel5H的組織結(jié)構(gòu)可以表示為信號序列-GH5-PSL-CBM6-EPR-DZ。由于DZ結(jié)構(gòu)域富含芳香族殘基(Trp，Tyr)，因此其似乎可以代表新類型的糖結(jié)合組件(CBM)。在非冗余DNA序列數(shù)據(jù)庫中對同源的結(jié)構(gòu)域的搜索揭示了由來自細菌假單胞菌屬物種ND137的aclA基因編碼的推測的纖維素酶中高度同源的結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO :4的位置465-558，圖1D)。含有此特殊結(jié)構(gòu)域的其他蛋白來源于S. degradans。Cel5H的另一個非典型特征與GH5催化性組件有關(guān)，該催化性組件的長度估計為 300個氨基酸，而其他家族-5酶顯示380-450個殘基的催化性組件。因此此組件異乎尋常地短，并且缺少家族-5酶中高度保守的殘基的重要序列段。實施例2 在大腸桿菌中制備完整的(野生型)，截短的Cel5H，和改造形式的 Cel5H使用分子生物學(xué)技術(shù)，編碼Cel5H的成熟形式(無信號序列)的DNA在大腸桿菌 (E. coli)表達載體(pET22b(+)，Novagen)中擴增和克隆。得到的載體用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21株(DE!3) (Novagen)。同樣，編碼截短形式或改造形式的Cel5H的修飾基因通過PCR 來獲得并在pET22b(+)中克隆，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21株(DE3)。在所有情況下，在重組蛋白的C-末端終端處移植6個His密碼子以促進它們在鎳樹脂(Nickel resin) (Ni-NTA, Qiagen)上的純化。各種改造形式的Cel5H概括在圖2中。重組菌株在LB培養(yǎng)基(Luria Bertani medium)中生長并且使用IPTG作為誘導(dǎo)物觸發(fā)被克隆的基因的表達。通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)來驗證重組Cel5H 的合成。將培養(yǎng)物離心并在弗氏壓碎器(French press)中破壞收獲的細胞。實施例3 各種形式的Cel5H的純化和表征和評價對多種底物包括羧甲基纖維素 (CMC)，磷酸溶脹纖維素(PASC)，微晶纖維素(Avicel)和未加工底物，即孵化稻草(hatched straw)的活性通過在Ni-OTVUQiagen)上裝載粗提取物純化 Cel5H，Cel5Ht 和 Cel5Ht_CBM3a， 并使用漸增濃度的咪唑鐺(imidazolium)洗脫目的蛋白。如下所述使用FPLC Q-瓊脂糖 (sepharose) (Hitrap Q HP 樹脂，GE Healthcare)完成純化。備選地，Cel5H以及Cel5H_CBM3a和CBM3a_Cel5H構(gòu)建體使用不同的程序純化。含有這些蛋白的粗提取物與PASC在4°C溫育，并離心。纖維素沉淀物通過在磷酸鹽緩沖液中離心洗滌數(shù)次，使用純水或1 %三乙胺從基質(zhì)上洗脫與纖維素酶特異性結(jié)合的蛋白。通過將含有目的蛋白的級分裝載至陰離子交換樹脂(Hitrap Q HP,GE healthcare)上在pH8下使用FPLC裝置來完成純化。使用線性梯度的NaCl將蛋白從柱上洗脫。在所有情況下，通過 SDS-PAGE檢查純度，并且濃縮蛋白，分成等分試樣并保存在-80°C。使用標(biāo)準(zhǔn)條件(37°C )測試純化酶對CMC，PASC，微晶纖維素(Avicel)和孵化稻草的活性。對于針對CMC的活性的測試，酶濃度為InM且底物濃度為8g/L CMC (pH 6. 0)。多種形式的Cel5H在37°下針對CMC的活性顯示在圖3中。在所有情況下獲得的活性模式表明對Cel5H的外切(exo)作用模式而非內(nèi)切(endo)作用模式。如圖3中所示，所有酶如下進行表征，即通過糖類在動力學(xué)的首先幾分鐘或幾秒鐘內(nèi)大量釋放，然后酶活性大幅度減小(5分鐘后觀察到平穩(wěn)期)，這對于外切作用酶或加工性酶更典型。
基于初速度，Cel5H對CMC的比活性估計為20，OOOiu/μ mol。對于針對PASC的活性的測試，酶濃度為5nM且底物濃度為3. 5g/L(pH 6. 0)。多種形式的Cel5H在37°下針對PASC的活性顯示在圖4中。DZ結(jié)構(gòu)域的去除(Cel5Ht)將比活性減少大約70%，顯示此結(jié)構(gòu)域在Cel5H水解 PASC過程中具有重要作用?；谶@些動力學(xué)，Cel5Hwt對PASC的比活性為大約1，OOOiu/ μ mol ο 將 CBM3a 移植在 N-末端(CBM3a_Cel5H)，C-末端(Cel5H_CBM3a)或代替 DZ 組件 (Cel5Ht-CBM3a)進一步減小了該酶的活性。對于針對微晶纖維素(Avicel)的活性的測試，酶濃度為IOOnM且底物濃度為 3. 5g/L(pH 6.0)。多種形式的Cel5H在37°下針對微晶纖維素(Avicel)的活性顯示在圖 5中。如對兩種其他底物所觀察到的那樣，野生型Cel5H的活性高于改造形式，并且特別地與缺少C-末端DZ結(jié)構(gòu)域的截短形式相比則更高，進一步證實DZ結(jié)構(gòu)域在結(jié)晶纖維素降解中的作用。與野生型Cel5H相比，其被強效的CBM3a替換僅部分地恢復(fù)微晶纖維素酶 (avicelase)活性。Cel5H對微晶纖維素(Avicel)的活性升高，其根據(jù)動力學(xué)的第一個小時期間獲得的數(shù)據(jù)計算，表明比活性為8. 5士2iu/ymol。也測試Cel5H對可溶性生色底物，對-硝基苯基-β -D-纖維二糖糖苷(para-nit rophenyl-^-D-cellobioside)的酶活性。在對硝基苯基和纖維二糖之間的連接被酶裂解后，對硝基酚和纖維二糖被釋放，并且其濃度可以通過分光光度分析直接測定。Cel5H對此底物的比活性為約14ui/μ mol。此活性為來自解纖維素梭菌的Cel5A的活性的約13倍，所述Cel5A也屬于糖苷水解酶的家族5。實施例4 來自解纖維素梭菌的野生型和改造的纖維素酶的Cel5H微晶纖維素酶活性的比較使用如實施例3中所述的測定設(shè)計，Cel5H微晶纖維素酶活性與來自解纖維素梭菌的野生型和改造的纖維素酶進行比較。酶濃度為IOOnM且底物濃度為3. 5g/L (pH 6. 0)。如圖6中所示，Cel5Hwt對微晶纖維素(Avicel)的活性為Cel9G的幾乎6倍，Cel9G 是來自解纖維素梭菌的活性最高的纖維素酶之一。與Cel9G的改造形式(其含有CBM3a和 X2 組件)(CBM-X-Cel9G，Mingardon 等，2007. Appl Environ Microbiol (應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué))73:7138-49.)相比，Cel5Hwt仍然保持了針對結(jié)晶纖維素的25%更多的活性。相反， 共價多纖維素酶體(其包含Cel9G和Cel48F的催化性組件和強效的CBM3a ；Mingardon等， 2007，見上)的活性僅比Cel5H多36%。通過戴安(dionex)對Cel5Hwt作用于微晶纖維素(Avicel)釋放的可溶性糖類的分析表明溫育M小時后，后一種酶主要釋放纖維二糖(67% )，纖維三糖5% )和葡萄糖㈩.5% )，即，復(fù)雜性相對低的可溶性糖類，但沒有纖維四糖。也測試Cel5H(Cel5HWt)對孵化稻草的活性(酶濃度和底物濃度分別為IOOnM和 3. 5g/L)。溫育M小時后，通過Cel5Hwt釋放大約70 μ M的可溶性糖類。通過戴安(dionex) 對可溶性糖類的分析表明Cel5H對此未加工底物的作用主要釋放葡萄糖(90% )。上述的所有動力學(xué)實驗在37°C下在20mM Tris-馬來酸酯pH 6. 0, ImM CaCl2 (疊氮化物0.01% w/v)緩沖液中進行。Cel5H的微晶纖維素酶活性也在相同緩沖液中在存在氯化鈉(171mM NaCl)的條件下測量。在NaCl的存在下，發(fā)現(xiàn)Cel5H的活性多10%。與37°C相比，在50°C下酶活性大幅度減小，可能是由于在50°C下酶的解折疊所引起的。得出結(jié)論，Cel5H顯示對結(jié)晶纖維素較高的活性，并且因此是在產(chǎn)生溶劑細菌諸如丙酮丁醇梭菌中異源制備的合適候選物，其能夠使此菌株在結(jié)晶纖維素或無定形纖維素上生長。我們的結(jié)果提示DZ組件充當(dāng)纖維素結(jié)合組件(CBM)，其可以有利地在底物的表面處錨定纖維素酶。迄今為止我們獲得的數(shù)據(jù)表明此酶可能是外切葡聚糖酶或內(nèi)切加工性纖維素酶(并且不是內(nèi)切葡聚糖酶)。值得注意的是家族-5纖維素酶通常被描述為內(nèi)切葡聚糖酶。Cel5H不從純纖維素中釋放任何纖維四糖，而是產(chǎn)生纖維二糖，葡萄糖和纖維三糖。實施例5 將Cel5H的附屬結(jié)構(gòu)域(accessory domains)和/或接頭4_移植至其他(多個)酶使用分子遺傳技術(shù)將S. degradans的DZ組件單獨或與上游CBM6和任選地與接頭 (參見圖1中的Cel5Hwt) —起連接至缺少這些組件的其他(多個)酶。選擇用于這些實驗的纖維素酶是來自解纖維素梭菌的Cel5A，其類似于Cel5H，也顯示N-末端處的家族-5催化性組件。Cel5A是一種真正的內(nèi)切葡聚糖酶，其對微晶纖維素 (Avicel)具有中等活性(Fierobe 等，1991. J Bacteriol (細菌學(xué)雜志)173 :7956-62)。構(gòu)建的雜交酶顯示在圖7中。純化多種改造形式的Cel5A并且測試它們對微晶纖維素(Avicel)的活性，并與 Cel5Awt 和 Cel5At 進行比較(圖 8)。DZ觀察到的活性譜表明DZ結(jié)構(gòu)域的存在改善了 Cel5A活性(即，Cel5A對微晶纖維素(Avicel)的水解)。特別地，溫育M小時后，由Cel5At-DZ或Cel5At-DZ2釋放的糖類的數(shù)量為由Cel5At釋放的糖類的數(shù)量的3倍。這些結(jié)果提示該酶通過DZ結(jié)構(gòu)域固定或附著在纖維素上。因此，提示DZ結(jié)構(gòu)域是新類型的固定結(jié)構(gòu)域。然而，觀察到的活性比Cel5At_CBM3的活性低20%。因此支架蛋白CBM結(jié)構(gòu)域似乎也與改善Cel5A對結(jié)晶纖維素的活性相關(guān)。與僅具有一個DZ結(jié)構(gòu)域的酶構(gòu)建體相比，加入兩個DZ結(jié)構(gòu)域沒有明顯地增加酶活性。也注意到，具有一個或多個附加的DZ結(jié)構(gòu)域的Cel5A構(gòu)建體對結(jié)晶纖維素的活性仍然為野生型Cel5H纖維素酶的4倍更低。因此，制成了包含CBM結(jié)構(gòu)域(CBM6)和來自Cel5H的DZ結(jié)構(gòu)域兩者的Cel5A構(gòu)建體。就結(jié)晶纖維素的降解而言，在催化性Cel5A結(jié)構(gòu)域和Cel5H DZ結(jié)構(gòu)域之間引入CBM6 結(jié)構(gòu)域增加了酶活性。實施例6 :Cel5H活性以游離的狀態(tài)或結(jié)合至雜交多纖維素酶體中來補充或增加其他纖維素酶對結(jié)晶纖維素的活性進行動力學(xué)試驗以研究Cel5H活性是否補充或增加其他纖維素酶在降解純結(jié)晶纖維素中的活性。在這些試驗中，測試下列的酶-來自解纖維素梭菌的野生型酶Cel5A(內(nèi)切)，Cel9G(內(nèi)切)，Cel9M(內(nèi)切)， Cel9P(內(nèi)切)，Cel48F(加工性)和Cel9E(加工性)。
-來自解纖維素梭菌的修飾的酶CipO_G(內(nèi)切)-從除解纖維素梭菌以外的生物體分離的酶=NeocaIlimastix patriciarum(muschroom)的 Cel6A (夕卜切)。在Avicel 結(jié)晶纖維素(3. 5g/L棉塞，20mMTris-馬來酸酯pH 6，ImM CaCl2 1)上溫育M小時后由所述酶釋放的可溶性糖類的量顯示在圖9中。對于每個酶組合，第一個條形表示兩種酶單獨活性的總和，而第二個條形表示兩種酶的混合物的活性(每種酶以0. ImM 的濃度存在)。這些結(jié)果表明在大多數(shù)情況下其他纖維素的活性補充或增加Cel5H纖維素的活性。進一步的試驗包括由包含Cel5H的雜交小型多纖維素酶體降解微晶纖維素 (Avicel)，所述Cel5H附加有合適的錨定組件(諸如，例如，在圖2中)，一種或兩種帶有關(guān)聯(lián)錨定蛋白的其他補充性纖維素酶并結(jié)合至展示任選的CBM3a組件的雜交支架蛋白(參見圖10)。證明與單獨Cel5H或其他纖維素酶相比，底物的降解增加。實施例7 由丙酮丁醇梭菌產(chǎn)生和分泌單獨的或與其他纖維素酶(和/或支架蛋白)一起的Cel5H(野生型，改造的，具有修飾的信號序列)編碼Cel5H的野生型基因通過PCR從S. degradans菌株中擴增，并克隆至大腸桿菌-丙酮丁醇梭菌PS0S952穿梭載體中。此質(zhì)粒是丙酮丁醇梭菌的表達載體(Perret等， 2004. J Bacteriol (細菌學(xué)雜志)186 :253-7)。目的基因的表達處于編碼硫解酶的基因的強力和組成型啟動子(Pthl)的控制下。兩個Iac操縱基因引入至pthl的上游和下游以防止大腸桿菌中該基因的任何表達。隨后載體被甲基化(體內(nèi)使用菌株ER2275[pANl]，體外使用甲基化酶CpG)并且如以前所述用來電轉(zhuǎn)化丙酮丁醇梭菌菌株。獲得重組克隆并且對菌落的PCR試驗指示該載體在產(chǎn)溶劑梭菌中仍然是完整的。幾個克隆在2YTC培養(yǎng)基中生長，但與對照菌株相比在培養(yǎng)上清中沒有檢測到附加的CMC酶活性，所述對照菌株帶有 “空” PS0S952 (在平板上的CMC酶試驗)。由于S. degradans的GC含量為約46 %，而丙酮丁醇梭菌顯示31 %的GC含量， 我們預(yù)測編碼Cel5H的野生型基因可能不能適應(yīng)丙酮丁醇梭菌密碼子偏倚。如上所述在 PS0S952中制備并克隆編碼野生型Cel5H但適應(yīng)丙酮丁醇梭菌密碼子偏倚的合成基因。關(guān)于丙酮丁醇梭菌的密碼子優(yōu)化的Cel5H編碼序列顯示在圖IF(SEQ ID NO 6) 中，并且相應(yīng)的多肽序列顯示在圖IG(SEQ ID NO 7)中。該序列含有改造的C-末端6xHis 標(biāo)簽以促進檢測和/或分離。用此新載體(甲基化后)轉(zhuǎn)化丙酮丁醇梭菌生成重組菌落。在2YTC中生長后對上清液的分析揭示改善的CMC酶活性，由此顯示該重組菌株分泌有活性的Cel5H。分泌產(chǎn)量似乎目前仍然低于lmg/L。S. degradans是一種革蘭氏陰性菌，其顯示兩層膜(外膜和胞質(zhì)膜)，而丙酮丁醇梭菌(革蘭氏陽性菌)僅擁有胞質(zhì)膜。Cel5H的天然信號序列因此被設(shè)計為解決跨越兩層膜分泌的問題但可能不適合于被丙酮丁醇梭菌有效分泌。為此，使用分子生物學(xué)技術(shù)，我們將Cel5H的天然信號序列替換為來自解纖維素梭菌的Cel5A的天然信號序列，因為后者被丙酮丁醇梭菌充分分泌(至多達5mg/L)。我們用包含雜交基因的載體轉(zhuǎn)化丙酮丁醇梭菌。 研究使用Cel5A信號序列時Cel5H的分泌產(chǎn)量。顯示通過用來自解纖維素梭菌的Cel5A的天然信號序列替換Cel5H的天然信號序列增加了分泌水平。由于對pNP-纖維二糖糖苷的強Cel5H活性，我們能夠測量到約0. 5mg/L的分泌水平。在發(fā)酵罐中在3g/L 2YT-PASC，pH固定在5，5的環(huán)境中生長重組細菌菌株的培養(yǎng)物。我們測量到PASC的降解，剩余纖維二糖的消耗和細菌生長。結(jié)果顯示在圖11和12中。在首個40小時期間觀察到明顯的細菌生長，直至OD值達到0.45。隨后，發(fā)生細胞溶解。此時，觀察到PASC的降解不斷增加。117小時后，68%的PASC被消耗，但未能檢測到單糖或寡糖。這提示通過水解PASC由Cel5H釋放的糖類立即被細菌消耗。這些結(jié)果顯示我們成功地構(gòu)建了能夠在補充PASC的培養(yǎng)基上生長的菌株。該重組細菌菌株的第二個培養(yǎng)物在發(fā)酵罐中在2YT (然而不含有任何PASC)，pH固定在5，5的環(huán)境中生長。此試驗的目標(biāo)是檢查細菌生長和PASC的消耗之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示在圖12中。如我們期望的那樣，在此情況下不能觀察到細菌生長。因此，我們可以得出結(jié)論，觀察到的細菌生長是由于PASC的降解和隨后消耗釋放的糖類所引起的。此外，建立第三個培養(yǎng)物，以檢查觀察到的細菌生長是否是由于Cel5H的活性而非丙酮丁醇梭菌的內(nèi)源性酶系統(tǒng)的活性引起的。因此，含有空載體(PSOS)的菌株的培養(yǎng)物在發(fā)酵罐中在3g/L 2YT-PASC，pH固定在5，5的環(huán)境中生長。最后，第四個培養(yǎng)物在發(fā)酵罐中在5g/L 2YT-PASC，pH固定在5，5的環(huán)境中生長， 以檢查PASC濃度是否是細菌生長的限制因素。因此，較高濃度的PASC可以潛在地導(dǎo)致較高的OD值(即，高于在前面試驗中觀察到的0. 45的最大OD值)。編碼Cel5H的基因與編碼其他纖維素酶的基因組合進行克隆，所述其他纖維素酶以游離的狀態(tài)獨立于Cel5H起作用。備選地，在丙酮丁醇梭菌中克隆和表達編碼包含 Cel5H(附加有錨定蛋白)的有效小型多纖維素酶體的基因，支架蛋白和一種或兩種其他的攜帶合適的錨定蛋白的纖維素酶。當(dāng)克隆三種或四種不同的基因時，也使用稱為pMTL的第二表達載體。此載體顯示在丙酮丁醇梭菌中與PS0S952相容。備選地，這些基因在特定的位點處(諸如尤其在已授權(quán)的PCT/EP/2006/066997中所教導(dǎo)的)，或隨機地整合至染色體中。此外，在丙酮丁醇梭菌中克隆和表達具有Cel5H的增加的組件(特別地DZ和任選地CBM6，參見實施例4)的纖維素酶，以實現(xiàn)結(jié)晶纖維素的降解和利用的增加。我們使用丙酮丁醇梭菌的野生型和多種改造的菌株，諸如，例如，具有改良的分泌機器(machinery)，為異源蛋白的分泌進行優(yōu)化，和/或為最優(yōu)化地產(chǎn)生乙醇(或丁醇)而具有改良的代謝的菌株。相應(yīng)的重組丙酮丁醇梭菌顯示產(chǎn)生和分泌改造的酶，并且展示在一種或多種纖維素物質(zhì)上生長和/或降解所述一種或多種纖維素物質(zhì)的能力。實施例8 改善丙酮丁醇梭菌對Cel5H的分泌制備了多種構(gòu)建體并且圖示于圖13，其中使用了從不同支架蛋白獲得的組件。在第一構(gòu)建體中，將適應(yīng)丙酮丁醇梭菌密碼子偏倚并編碼來自于Saccharophagus degradans的纖維素酶Cel5H的合成多聚核酸融合到這樣的多聚核酸，所述這樣的多聚核酸編碼運載結(jié)構(gòu)域并包含CBM3a組件、從丙酮丁醇梭菌的CipA蛋白獲得的第一(Xa)和第二(Xa’)X組件和解纖維素梭菌的CipC支架蛋白的信號肽。使用適當(dāng)?shù)慕宇^序列將不同組件相互連接。天然Cel5H多肽的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)可概括為GH5-PSL-CBM6-EPR-DZ，其中GH5代表其糖苷水解酶家族5結(jié)構(gòu)域，PSL代表聚絲氨酸接頭，CBM6代表糖-結(jié)合組件家族6結(jié)構(gòu)域， EPR代表富含-谷氨酸-脯氨酸區(qū)，以及不被這種解釋所限制，DZ表示被本發(fā)明人鑒定為推測的糖-結(jié)合組件的C-末端結(jié)構(gòu)域。這種構(gòu)建體使用重疊延伸PCR技術(shù)來構(gòu)建，并克隆在穿梭表達載體PS0S952 (其賦予對抗生素紅霉素(erythromycin)的抗性)中，由此產(chǎn)生質(zhì)粒pS0S952-CBM-Xa_Xa，-5H。 該構(gòu)建體通過測序驗證，并在體內(nèi)和體外甲基化。隨后甲基化的載體用于電轉(zhuǎn)化丙酮丁醇梭菌菌株ATCC 824。通過丙酮丁醇梭菌分泌的附加有來自于解纖維素梭菌的支架蛋白CipC的信號肽的野生型Cel5H蛋白為0. 5-0. 9mg/L(數(shù)值是基于培養(yǎng)物上清對于對-硝基苯基-纖維二糖糖苷(para-nitrophenyl-cellobioside)的活性)。然而，攜帶兩個編碼融合蛋白的構(gòu)建體(該融合蛋白包含連接到運載結(jié)構(gòu)域的Cel5H蛋白)的丙酮丁醇梭菌菌株在它們的生長培養(yǎng)基中以顯著更高的量分泌含有纖維素酶5H的融合蛋白，更特別地達到6. lmg/L (數(shù)值是基于培養(yǎng)物上清對于對-硝基苯基-纖維二糖糖苷的活性，參見圖14(3))。這些結(jié)果證明丙酮丁醇梭菌產(chǎn)生和分泌了 Cel5H。實施例9.證明根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白對纖維素的活性。使用分子生物學(xué)技術(shù)將編碼實施例8中描述的不同蛋白構(gòu)建體的DNA擴增并克隆在大腸桿菌表達載體(pET22b(+)，Novagen)中。使用所產(chǎn)生的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株 BL21(DE3) (Novagen)。在所有情況下，在重組蛋白的C-末端終端移植六個His密碼子以促進它們在鎳樹脂(Ni-NTA，Qiagen)上的純化。重組菌株在LB培養(yǎng)基(Luria Bertani medium)中生長并且使用IPTG作為誘導(dǎo)物觸發(fā)被克隆基因的表達。通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)驗證重組蛋白的合成。離心培養(yǎng)物并在弗氏壓碎器(French press)中破壞收獲的細胞。通過在Ni-NTAOliagen)上裝載粗提取物純化重組蛋白，使用漸增濃度的咪唑鐺 (imidazolium)洗脫目的蛋白。使用 FPLC Q-瓊脂糖(sepharose) (Hitrap Q HP 樹脂，GE Healthcare)完成純化。測試純化的Cel5H酶對于對-硝基苯基-纖維二糖糖苷的活性，并且結(jié)果顯示在圖15a中。備選地，使用標(biāo)準(zhǔn)條件(37°C)測量對微晶纖維素(Avicel)(微晶纖維素)的活性。結(jié)果圖示在圖15b中。實施例10 關(guān)于Cel5H同源物，特別地關(guān)于來自假單胞菌屬物種ND137的由基因 aclA編碼的ACLA采用如實施例2_7中所述的克隆和表達策略。對于顯示與來自S. degradans的Cel5H具有很大的整體同源性并且特別具有DZ 結(jié)構(gòu)域的酶應(yīng)用相同的策略。這由來自假單胞菌屬物種ND137的由基因aclA編碼的酶(ACLA)來例證。圖16 比較了 ACLA與Cel5H的一般組織結(jié)構(gòu)。編碼ACLA的基因已經(jīng)在大腸桿菌中克隆和過度表
iMffilSWBI^^^^^iiE (Aoki & KEimei 2006. European Journal of Phycology ( ^ 洲藻類學(xué)雜志)41 =321-328) 0鑒于這兩種酶之間的高度同源性(除了接頭以外)，預(yù)期它們共享類似的特性/活性。因此，對ACLA應(yīng)用實施例2-7中所述的克隆和表達策略，并且特別地在丙酮丁醇梭菌中產(chǎn)生另外的纖維素降解系統(tǒng)。實施例11 評價ACLA對多種底物包括對-硝基苯基-β _D_纖維二糖糖苷(pNPC)， 磷酸溶脹纖維素(PASC)和微晶纖維素(Avicel)的活性使用標(biāo)準(zhǔn)條件(37°C )測試純化的ACLA酶對多種底物的活性，并與純化的重組 Cel5H對相同底物的活性進行比較。測試ACLA對可溶性生色底物對-硝基苯基-β -D-纖維二糖糖苷(pNPC)的酶活性，并與Cel5H(以95%純度)的酶活性相比較。在對硝基苯基和纖維二糖之間的連接被該酶裂解后，對硝基酚和纖維二糖被釋放，并且其濃度可以通過分光光度分析直接測定。ACLA 對于對-硝基苯基-β -D-纖維二糖糖苷的酶活性為17，9ui/μ mol，而Cel5H對相同底物的酶活性為18，2ui/ymol。因此，與Cel5H對于對-硝基苯基-β-D-纖維二糖糖苷底物的酶活性相比，ACLA顯示98 %的酶活性。對于針對PASC (無定形纖維素)的活性的測試，使用的酶濃度為5ηΜ且底物濃度為3. 5g/L(pH 6. 0)。ACLA對PASC的酶活性為780ui/μ mol, M Cel5H對相同底物的酶活性為1600ui/ymolo因此，與Cel5H對PASC的酶活性相比，ACLA顯示49%的酶活性。對于針對Avicel (結(jié)晶纖維素)的活性的測試，酶濃度為IOOnM且底物濃度為 3. 5g/L(pH 6. 0)。ACLA對Avicel的酶活性為56 μ M/Mh，而Cel5H對相同底物的酶活性為 140yM/24ho因此，與Cel5H對Avicel的酶活性相比，ACLA顯示40%的酶活性。
權(quán)利要求
1.一種重組細菌，其表達&iccharophagus degradans 2-40株的Cel5H多肽或其同源物，或所述Cel5H多肽或所述同源物的功能片段和/或變體，所述重組細菌能夠降解纖維ο
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組細菌，其包含編碼所述Cel5H多肽或其同源物的重組核酸分子，或編碼所述Cel5H多肽或所述同源物的功能片段和/或變體的重組核酸分子，所述重組核酸分子可操作地連接至允許在所述微生物中的表達的調(diào)節(jié)序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項所述的重組細菌，其是產(chǎn)溶劑細菌，更特別地是產(chǎn)乙醇細菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的重組細菌，其是丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)0
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的重組細菌，其中所述Cel5H多肽或其同源物，或所述Cel5H多肽或所述同源物的功能片段和/或變體融合至與所述Cel5H多肽或其同源物異源的一個或多個結(jié)構(gòu)域，所述一個或多個結(jié)構(gòu)域選自多纖維素酶體支架蛋白的糖苷水解酶 (GH)催化結(jié)構(gòu)域，糖結(jié)合組件(CBM)結(jié)構(gòu)域，黏結(jié)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域諸如錨定結(jié)構(gòu)域，和親水 (X組件)結(jié)構(gòu)域。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的重組細菌，其中所述Cel5H多肽或其同源物，或所述Cel5H多肽或所述同源物的功能片段和/或變體，和任選地一種或多種能夠降解含纖維素物質(zhì)的酶，包含在雜交的和/或共價的多纖維素酶體或小型多纖維素酶體中。
7.Saccharophagus degradans 2-40株的Cel5H多肽的分離的結(jié)構(gòu)域(DZ結(jié)構(gòu)域)，即所述Cel5H多肽的氨基酸496至氨基酸596或與其同源的分離的結(jié)構(gòu)域，或所述DZ結(jié)構(gòu)域或所述同源的結(jié)構(gòu)域的功能片段和/或變體。
8.—種Cel5H多肽或其同源物或變體的分離片段，其具有結(jié)構(gòu)EPR-DZ，CBM6-EPR-DZ或 PSL-CBM6-EPR-DZ，其中EI3R代表富含谷氨酸-脯氨酸的區(qū)域，且PSL代表聚絲氨酸接頭。
9.一種嵌合多肽，其包含根據(jù)權(quán)利要求7所述的分離的結(jié)構(gòu)域或其功能片段和/或變體，或Cel5H多肽的根據(jù)權(quán)利要求8所述的分離片段，且還包含與Cel5H多肽或其同源物異源的一個或多個結(jié)構(gòu)域，所述一個或多個結(jié)構(gòu)域選自多纖維素酶體支架蛋白的GH催化結(jié)構(gòu)域，CBM結(jié)構(gòu)域，黏結(jié)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域諸如錨定結(jié)構(gòu)域，和親水(X組件)結(jié)構(gòu)域。
10.一種重組核酸，其編碼根據(jù)權(quán)利要求7所述的分離的結(jié)構(gòu)域或其功能片段和/或變體，或Cel5H多肽的根據(jù)權(quán)利要求8所述的分離片段，或根據(jù)權(quán)利要求9所述的嵌合多肽。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的重組核酸，還包含調(diào)節(jié)序列，所述調(diào)節(jié)序列允許在宿主細菌中的表達。
12.—種用根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的重組核酸轉(zhuǎn)化的宿主細菌。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的宿主細菌，其為丙酮丁醇梭菌。
14.一種降解包含纖維素的物質(zhì)的方法，所述方法包括使所述物質(zhì)與根據(jù)權(quán)利要求 1-6中任一項所述的重組細菌，或與根據(jù)權(quán)利要求7所述的分離的結(jié)構(gòu)域或其功能片段和/ 或變體、或Cel5H多肽的根據(jù)權(quán)利要求8所述的分離片段、或根據(jù)權(quán)利要求9所述的嵌合多肽、或根據(jù)權(quán)利要求9所述的嵌合肽、或根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的宿主細菌接觸。
15.一種由包含纖維素的物質(zhì)產(chǎn)生溶劑、燃料或化學(xué)中間體的方法，所述方法包括用根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項所述的重組微生物或用根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的宿主細菌處理所述物質(zhì)。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的方法，其中所述物質(zhì)包含或富含結(jié)晶纖維素。
全文摘要
本發(fā)明涉及Saccharophagus degradans的纖維素酶Cel5H和其同源物、功能片段和/或變體及其改造形式在重組的，更特別地產(chǎn)溶劑微生物，更特別地丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)的背景中的應(yīng)用。本發(fā)明還表征了具有推測的纖維素結(jié)合組件功能的Cel5H纖維素酶的一個新結(jié)構(gòu)域，和其在用于解聚含纖維素的物質(zhì)的嵌合蛋白中的應(yīng)用。
文檔編號C12N9/42GK102227498SQ200980147476
公開日2011年10月26日 申請日期2009年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月28日
發(fā)明者亨利-皮埃爾·菲耶羅布, 呂克·德迪厄, 安熱莉克·沙納爾-維亞爾, 昌塔爾·塔迪夫, 阿內(nèi)-洛爾·莫利尼耶 申請人:國家科學(xué)研究中心, 國立應(yīng)用科學(xué)學(xué)院, 地中海大學(xué), 普羅旺斯大學(xué), 道達爾公司